JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Burun ve bronş sıvıları emilimini: hassas örnekleme insan solunum mukoza ve laboratuvar işleme örnekleri

Published: January 21, 2018
doi:
10.3791/56413
, , , , , , , , , , ,
1National Heart and Lung Institute, Faculty of Medicine, Imperial College London,St Mary’s Hospital, 2St Mary’s Hospital,Imperial College Healthcare Trust

Summary

Bu el yazması burun ve bronş emme teknikleri, özellikle alt ve üst hava yolu Mukozal astar sıvı (MLF) örnek için sentetik dinsel matrisler (SAM) kullanarak açıklar. Bu yöntemleri daha iyi standardizasyon ve tolerabilite mevcut solunum örnekleme teknikleri daha sağlar.

Abstract

Burun emme (NA) ve bronş emme (BA) yöntemlerini insan solunum yolu Mukozal astar sıvı (MLF) emmek için sentetik dinsel matrisler (SAM) kullanın. NA konka aşağı sıvı emer ve en az düzeyde rahatsızlık neden olan non-invaziv bir tekniktir. NA sık üst solunum yolu örnekleme tekrarlamak için yeteneği ile tekrarlanabilir sonuçlar doğurdu.

Buna karşılık, nazofarenks aspirasyon (NPA) ve geleneksel ev temizliği, gibi solunum mukoza örnekleme farklı yöntemi daha invaziv ve daha büyük veri değişkenlik neden olabilir. Diğer yöntemleri kısıtlamaları bulunmaktadır, örneğin, biyopsi ve bronş yordamlar invaziv, balgam içeren birçok ölü hücreleri ve الرسالة gerektirir, su ve tükürük dışarı solunan nefes Yoğuşma (EBC) içerir ve lavaj örnekleri seyreltik ve değişken.

BA bronkoskop Kliniği çalışma kanalı aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Örnekleme iyi tolere edilir ve hava yolu içinde birden çok site yapılabilir. BA bronchoalveolar lavaj (BAL) örnekleri daha az sulu olmak MLF örnekleri sonuçlanır.

Bu makalede, NA ve BA teknikleri, hem de laboratuar işleme ölçülen istenen aşağı akım biyomarker uyarlanabilir elde edilen örneklerin gösterilir. Bu emme teknikleri klinik solunum araştırmalarında kullanılan geleneksel örnekleme teknikleri için yararlı alternatifleri vardır.

Introduction

Çoğu solunum yolu hastalıkları bir enflamatuar yanıt neden ve alerjik rinit, viral ve fungal enfeksiyonlar, tüberküloz, astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, akciğer solunum Mukozal yüzeyinden örnekleme için acil bir ihtiyaç olduğunu fibrozis ve akciğer kanseri 1. Nazofarenks aspiratı (NPA), nazal lavaj ve bronchoalveolar lavaj (BAL) alt ve üst hava yolu örnekleme için ortak teknikler vardır. Ancak, bu teknikler zavallı tolerabilite, seyreltme inflamatuar arabulucu ve örnekleme2sık sık tekrarlamak için yetersizlik de dahil olmak üzere önemli sorunlar mevcut. NPA örnekleme için bir alternatif temizleme bezi, naylon akın etti, pamuk, kullanımı veya onlar neden rahatsızlık ve hasar nazal epitel ve bazı durumlarda geri dönüşü olmayan bağlama beri Rayonu3,4, ama bunlar da sınırlamalar, sahip inflamatuar aracılar5. Bu teknikler genellikle bir saatten fazla seri olarak yinelenemez ve alternatif teknikleri daha düşük bereket sitokinler ve kemokinler5,6tespiti için etkili olabilir. Ayrıca, bu teknikleri ile ilişkili kullanıcı değişkenlik veri, büyük hasta tabur gereksinim olarak ortaya çıkan tutarsızlıkları oluşturabilir.

Alternatif olarak, doğal ve sentetik sünger kullanarak emme teknikleri MLF Mukozal yüzeyler arasında toplamak için kullanılmaktadır. Oftalmik sünger oluşur (örneğin, Weck-cel) doğal selüloz örnek tükürük, servikal ve vajinal salgılar7için kullanılmıştır. Buna ek olarak, polivinil alkol (PVA) sentetik sünger yaptı ve hydroxylated polivinil asetat (HPVA) faydalanılan8olmuştur. Yedi farklı dinsel malzeme poliüretan mini-sünger insan gözyaşları10toplamak için kullanılan süre antikorlar9, ölçme öncesinde oral sıvı örnekleme için karşılaştırılmıştır.

Filtre kağıdı Pamuk bitki doğal selüloz oluşan yaygın Alam ve arkadaşları, 1992-11,12,13,14öncü kağıt beri burun salgıları emmek için kullanılmıştır, 15,16,17. Filtre kağıdı diskler (örneğin Shandon) filtresi kartlardan üretilen ve histamin ve sitokinler sonra burun alerjen zorluklar kontrollü ve doğal alerjen pozlama18,19 ile ölçmek için kullanılan ,20,21. Ancak, filtre kağıdı farklı gruplar halinde protein bağlayıcı ve sitokinler serbest bırakmak için bazı başarısız onların derecesi değişir. Sentetik dinsel matrisi (SAM) kullanarak yöntemleri bu nedenle gelişmiş2,22,23olmuştur. SAMs şimdi genellikle burun MLF almak için na tarafından kullanılır Bu emici malzemelerdir rahat kullanın ve MLF bile iltihaplı burun uzun bir süre sık aralıklarla elde edebilirsiniz.

Burun emme hassas Mukozal MLF örnekleme üst solunum yolu içinde için bir SAM kullanarak örnekleme bir şeklidir. NA Cihazlar CE işaretli tıbbi cihazlar Medikal dereceli malzemelerden temiz odalar kullanarak olarak imal edilmiş olup, toz ve alerjenleri serbest. NA örnekleyici bir kolu ve SAM bir steril cryotube oluşur. SAM polimerler, genellikle lifleri, oluşur ama de köpük mevcuttur ve bunlar yumuşak ve dinsel, hızlı örnek koleksiyon için esneklik ile seçilir. SAMs absorbe salgıları verimli elüsyon izin vermek için en az protein bağlayıcı var. NA üzerinde her yaştan bağış yapılabilir çok nazik, non-invaziv bir tekniktir. Buna ek olarak, seri örnekleme, birkaç dakikada bile, mümkündür. NA karşı varolan üst solunum yolu örnekleme teknikleri5 doğrulandı ve tekrarlayan örnekleme Kinetik veri meydan alerjen23,24,25ile hava yolu takip nesil izin verdi, Bakteriyel endotoksin26 ve viral türü TLR agonistler (Jha, A. vd., el yazması hazırlık). NA da doğa tarihi Atopi27,28,29 araştırmak bebeklerde ve viral bronşiyolit30kullanılmıştır.

Bronchoscopic microsampling (BMS) Olympus31,32,33tarafından geliştirilen alt solunum yolu MLF koleksiyonunda için bir yöntemdir. Ne yazık ki, bu BMS sistem sadece Japonya’da lisanslıdır. Olympus tedarik iki BMS sistemleri: fibröz hydroxylated polyester (FHPE) ile bir sonda34,35,36,37ve bir pamuk ile bir sonda33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. bir büyük engel astımı olan hastalarda kullanılan BMS sonda Mukozal temas kanama, tüm örnekleri kanla kontamine yarısı neden olmuştur. Yazarlar örnek MLF periferik airways bu BMS sistemden astım hastaları43yılında kullanarak mümkün olduğunu reddetmektedir.

Alternatif olarak, BA rhinovirus6olan astımlı bireylerde deneysel enfeksiyonu takip dahil olmak üzere alt solunum yolları, bronchoscopic incelenmesi sırasında gerçekleştirilen bir yumuşak SAM kullanarak geliştirdik. BA aygıt oluşur: bir dış içi boş kateter, bu SAM dışarı üstünde harekete geçirmek bir el parça ve SAM onun ucunda sahip bir merkez plastik kılavuz tel. NA, gelince BA kitleri temiz odalar kullanarak tıbbi malzemelerden üretilmektedir ve toz ve alerjenleri serbest. Ayrıca, CE işaretli ve gama radyasyona maruz sağlanan aygıtlardır. SAM şerit yumuşak, dinsel ve hızlı örnek koleksiyon için esneklik vardır. Ayrıca absorbe salgıları verimli elüsyon izin vermek için en az protein bağlayıcı vardır. Cihazın bir bronkoskop çalışma kanalı ile uygun ve için hızla kullanılabilir ve doğru bir şekilde MLF hava yolu içinde ilgi belirli siteleri, örnek. BAL veya BMS aksine, BA iletişim kanama veya ek hasta rahatsızlık sonrası yordam yol açmaz.

Dikkatli bir değerlendirme NA ve BA örnekleri işleme için verilmelidir. Örnekleri-ebilmek var olmak doğrudan donmuş ve toplu olarak işlenen veya hemen işlenebilir. Konak hücre RNA ilgili ve işlem türü uzun sitokinler, kemokinler ve immünglobulin veya viral, bakteriyel, elutions de dahil olmak üzere bazı aşağı akım uygulamaları doğru uygun olabilir. Biz klinik toplama ve laboratuvar işleme teknikleri klinik araştırmacılar için bir rehber olarak NA ve BA ile ilgili mevcut.

Protocol

Aşağıdaki protokolünde kullanılan teknikleri Batı Londra araştırma Etik Komitesi (referans numarası 15/lO/0444) tarafından onaylanmış olması. 1. burun emme (NA) NA örnekleme öncesi hazırlık Ne zaman NA taşıma, önce ellerinizi yıkayın ve eldivenler, tercihen hastanın önünde koymak. Kafa bir meşale kullanarak burun boşluğuna inceleyin ve klinisyen hastanın burun burun boşluğuna görselleştirmek için geri çekmek için onların baskın başparmak kullanın sahip.Not: Burun bir spekulum genellikle gerekli değildir. Burun boşluğuna ve aşağı örnekleme önce konka görselleştirin.Not: Siklikla (burun) kesit içinde yuvarlak değildir ve düz geriye doğru gidiyorlar. Genellikle, alt konka bir şişkinlik ya da burun lateral duvarındaki girinti olarak görülebilir nazal septum ile düz, düz medial duvarı şekillendirme. Temel epitel solunum yolu44basit bir siliyer epitel olduğundan örnek bu alt konka, istiyoruz. NA örnekleme Örnekleme zaman NA konka inferior karşı düz olmasını süsleme SAM yavaşça burun deliği, lumen başarılı. SAM nazal mukoza üzerine basılacak bir işaret parmağı kullanmak için donör sor. NA MLF emilir gibi bir hafif, olası göz sulama ile gıdıklama neden olabilir.Not: Yetişkinlerde, biz genellikle NA 60 için gerçekleştirmek s. MLF emilimini sonra burun deliği NA aygıtı kaldırın ve özgün tüpün içine geri koy. Laboratuvar hemen örneklerinde işlemek veya onları, bu iletişim kuralını, daha sonra detaylı olarak dondurma.Not: NA nazal Mukozal meydan modelleri çeşitli ve farklı airways hastalıkları incelenmiştir. Ancak, diğer solunum örnekleme yöntemleri dayalı doğrulamayı her çalışma ve hasta popülasyon için yapılmalıdır. 2. bronşiyal emme (BA) BA örnekleme öncesi hazırlıkNot: BA Bronkoskopi paketindeki uzman personel tarafından gerçekleştirilir. Kateter BA aygıtı yerleştirmeden önce SAM ekstrüzyon ve kateter geri çekilmesi emin olun. Bir hastaya BA gerçekleştirmeden önce sahte BA Bronkoskopi simülatör davranış. BA örnekleme Trakea ve sağ ana bronş aşağı bronkoskop bronş intermedius, sadece sağ alt ve sağ orta LOB lige proksimal seviyesine geçmek.Not: hava yolu diğer sitelerle tatmak mümkündür rağmen genellikle bronş intermedius, örnek. Kateter ve SAM gözlemleyerek, bir bronkoskop ucunu göremiyorum. Bronkoskop istenen örnekleme sitesi ulaştı bir kez biz BA için aşağıdaki basit adımları izlemek. Kateter aşağı: beyaz ucu sadece hava yolu, en fazla 1 cm bronkoskop sonuna kadar distal görünene kadar bronkoskop çalışma kanalından BA kateter takın. Bronkoskop ve kateter ucu hava yolu Lümen ortasında tutun. Kateter ucu ve aşınma mukoza için riskini azaltmak için bronş mukoza arasında teması en aza indirmek için dikkatli olun. SAM OUT: Böylece SAM sağ orta veya sağ alt LOB hava yolu Lümen kalıptan çekilmiş BA aygıt tanıtıcısı düşürmek. Direkt görüş altında SAM hava yolu duvardaki MLF ile temas ediyor emin olmak için bronkoskop ucu viraj. SAM hava yolu içinde 30 Mukozal duvara düz bırakmak s. SAM inç: nemli SAM sonda düz ve değil bükülmüş sonuna kateter üzerinde olduğundan emin olmak için bronkoskop bakın. Gerekirse, kateter ve bronkoskop ipucu SAM düzeltmek için geri getirilebilir. Direkt görüş altında düz SAM yavaşça geri kateter geri çek.Not: SAM geri kateter geri çeker zorluk ise, tam aygıt SAM ile geri geri hava yolu dışında kalıptan çekilmiş. Kateter kadar: tüm kateter bronkoskop çalışma kanalından geri alıyorum. : SAM SAM steril makasla kesip kesip sonra bir cryotube buza koy. Bu örnekler bu protokolündeki daha sonra detaylı olarak değişen yöntemleri ile işlenebilir. 3. NA ve BA örnekleri işleme Not: NA ve BA kaynaklanan örneklerinin laboratuvar işleme için çok sayıda seçenek vardır. Bu iletişim kuralları örnekleri daha sonra kullanmak üzere depolamak ve Sam MLF örnek elute için arıyorum. NA ve BA örnekleri hemen işleme seçenekleri Seçenek 1: nemli SAM daha fazla işleme önce bir kaç saat için buza saklayın. Seçenek 2: Hemen NA SAMs koleksiyonu derin dondurucu tüp. Benzer şekilde, kriyojenik şişeleri BA SAMs makas, örnekleme cihazı ile kaldırıldıktan sonra dondur. Seçenek 3: Müstakil SAM dondurucu doğrudan ve derin işleme öncesinde elüsyon arabellek (300 µL) yerleştirin. NA ve BA örnekleri için elüsyon arabellek seçenekleriNot: MLF örnekte çözümlenmesi için neler olduğunu elüsyon arabellek seçim bağlıdır ve dört ana alternatifler öneririz: İmmunoassay yordamlar için uygun bir önceden hazırlanmış tahlil arabellek kullanın. Böyle arabellekleri deterjan (% 0.05) az miktarda protein, Örneğin, sığır serum albumin (BSA) % 1 yanı sıra içermelidir. Böylece hücre lizis oluşur alternatif olarak, deterjan, daha büyük bir miktarı içeren bir arabellek kullanın.Not: Triton-X veya NP40% 1 konsantrasyonu içeren arabellekleri kullanıyoruz. Hücre lizis arabellekleri SAM eluted ve genellikle daha yüksek düzeyde sitokinler ve kemokinler sonuç hücre içi ve hücre dışı sitokinler etkinleştirin. Bu arabellekleri aynı protein içermelidir ve BSA ile % 1’e yapılır. Gibi kantitatif PCR viral RNA veya ölçüm ana bilgisayar RNA, RNA ölçümler için doğrudan nemli SAM’a RNA ayıklama arabellek ekleyin.Not: Chaotropic RNA ayıklama arabellekleri proteinler denatures guanidinium içerir. İmmunoassay veya hücre lizis arabellekte bulunan eluted MLF sıvı RNA ayıklama arabellek eklemek için bir alternatiftir. Trifluoroacetic asit gibi organik çözücüler lipidler ve metabolitleri, kütle spektrometresi tarafından değerlendirilmesi için çıkarım için kullanın.Not: Tüm bu ayıraçlar ayrıntılarını malzemeler bölümünde yer almaktadır. Elüsyon tekniği Herhangi yukarıdaki elüsyon teknikleri için istenen ekstraksiyon arabellek ile birlikte 2 mL mikro-santrifüj tüpü SAM takın. Girdap karışımı 30 için örnek s SAM gevşek bağlı sıvı ve biomolecules yıkamak için. Tam örnek malın güvenliğini garantiye almak için nemli SAM yıkamak için kullanılan aynı 2 mL mikro-santrifüj tüpü ekler spin filtre Mini sütun ekleyerek santrifüj elüsyon gerçekleştirin.Not: İki tür spin filtre Mini sütun kullanılabilir. İlki sadece bir plastik kafes, hangi SAM yerinde tutan, sıvı dolu elüsyon izin içerir. Alternatif olarak, eğer bulaşıcı malzemeleri ile çalışma, 0,22 µm gözenek boyutu ile spin filtreleri kullanın. Bu filtrelerin örnekleri sterilize ve örnekleri ile şüpheli Mikobakteriyel Enfeksiyon için uygundur. Ancak, bu filtreleri ile arabellek bağlama filtresi arabulucu tarafından non-spesifik etkileşim en aza indirmek için önceden inkübe olmalıdır. Steril forseps nemli SAM spin filtre aktarmak için kullanın. Forseps kontaminasyonu önlemek için örnek arasında değiştirin. Mini santrifüj 16.000 x g de 20 dk santrifüj örnekleri 4 ° C’ye soğutmalı Özet örnek Protokolü Laboratuvarda, 2 mL mikro-santrifüj tüpleri örnek koleksiyonu için etiket ve elüsyon Arabellek istenen hacmi ekleyin (NA için; genellikle 300 µL BA için 100 µL). Kapağı kapatın ve Buza koyun. (Hemen veya laboratuarda) SAM örnekleme takip forseps kullanarak tanıtıcıdan kaldırılır ve toplama tüp (önceki adımda üretilen) içeren arabellek içine yerleştirilir. Microcentrifuge tüp kapağı güvenli bir şekilde kapatılır ve örnekleri, buz, işlenmesi için laboratuvar aktarmak olun. SAM ve elüsyon arabelleğinden 30 için onların transferi konteyner ve girdap karışımı içeren tüpler kaldırın s. Steril forseps kullanarak, SAM kaldırmak ve bir spin sütununa (veya 0,22 µm selüloz asetat filtre olmadan) yerleştirin. Koleksiyon tüpünden elüsyon arabellek toplamak ve muhafaza. SAM ile spin sütun özgün koleksiyonu tüpte yerleştirin (veya steril filtreleme Eğer yeni bir örnek) ve koleksiyon arabellek sütun dönmeye ekleyin. Bu şekilde, yıkama sıvısı içinde spin sütun Sam örnek elute için yardımcı geri toplama tüp içine geçecek. Örnekler santrifüj kapasitesi ile kapalı kapakları (16.000 x g, 20 dk, 4 ° C). Örnekler santrifüj çıkarın ve bir raf yerleştirin. Tüplerin kapalı kapağını açın ve SAM içeren spin sütun kaldırmak. SAM ve spin sütununda uygun bir atık konteyner atın. Dikkatle tüpün içine içinde bulunan eluate kriyojenik etiketli aliquot tüpleri. Eluate hacmi ve birimin her aliquot kaydedin. Mühürlü kriyojenik tüpler-80 ° C dondurucu aktarın ve dik kadar kullanmak depolayın.

Representative Results

NA çalışmaları için bir dizi kolayca kullanılmıştır ve non-invaziv Mukozal inflamasyon ölçün. Alerjen burnuna yönetiminin, prostaglandin D2 (PGD2) düzeyleri yükselmeye ve mast hücresi degranulation (Thwaites vd., el yazması hazırlık) doğrultusunda (şekil 1), birkaç dakika içinde düşüş görülebilmektedir. Ayrıca, arabulucu IL-5 ( 24izni ile yayımlanmaktadırŞekil 2,), gibi tip-II iltihabı burun alerjen challenge23,24saat içinde ölçülebilir. Alerjik astımlı ve sağlıklı kontrol deneysel enfeksiyonunda NA arabulucu, interferon-gamma (IFN-γ), dahil olmak üzere bir panel ölçmek için 7 gün (şekil 3,) 6izni ile yayımlanmaktadır boyunca kullanıldı. Ayrıca, bebekler doğal respiratuvar sinsityal virüs (RSV) enfeksiyonunda NA göre sigara RSV bebekler bronşiyolit ve sağlıklı kontrol ( ile IFN-γ gibi inflamatuar sitokinlerin düzeyleri ile ilişkilendirilecek RSV gösterdi Şekil 4, yazdırılan 30izniyle). İlginçtir, bu ayrımcılık RSV ve sigara RSV bronşiyolit arasında zaman eşlemeli NPA örnekleri (şekil 4) önemli değildi. BA rhinovirus ile Alerjik astımlı deneysel enfeksiyon sırasında da kullanıldı. IL-10 ve IL-5 gün rhinovirus enfeksiyon, düzeyleri, IFN-γ, CXCL11, 4 satır taban çizgisi (şekil 5; yükseltilmiş A, B, C ve D, sırasıyla). Ayrıca, bu teknik Alerjik astımlı alt havayolu yükseltilmiş IL-5 düzeyleri sağlıklı kontrol (şekil 5 d) (şekil 5 6izni ile yayımlanmaktadır) göre rhinovirus enfeksiyon sırasında gösterdi. Bu temsilci sonuçlar % 0.05 ara-20 ve % 1 BSA içeren tahlil tampon kullanarak eluted örnekleri oluşturulan ( Tablo malzemelerigörmek). Resim 1 : Hızlı üretimi ve prostaglandin D2 burun alerjen meydan takip yetkisi. Burun emme eluates seri örneklerinde burun alerjen meydan okuma ile Timothy çimen poleni takip itibaren ölçülen prostaglandin D2 (PGD2) düzeyleri (n = 5). Her satır veri tek bir kişi temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : IL-5 burun alerjen meydan takip Kinetik ölçüm. Burun alerjen meydan takip seri burun emme örneklerinde üretim IL-5. Üç alerjen meydan okuma yürütülen çalışmalar, katılımcılar ile tekrar (n = 19) plasebo (mavi) alma, düşük doz (10 mg) oral prednizon (turuncu) veya yüksek doz (25 mg) oral prednizon (kırmızı) alerjen yönetim önce bir saat. Geometrik ortalama satırları belirtmek ve hata çubukları tüm katılımcıların % 95 güven aralıkları vardır. (Şekil izninden Leaker vd., Mukozal İmmünoloji, 2017 ile yeniden basıldı). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Interferon γ indüksiyon rhinovirus enfeksiyon sırasında. Sağlıklı yetişkinlerin enfeksiyon mücadele sırasında (n = 11, mavi) ve Alerjik astımlı (n = 28, kırmızı) rhinovirus-16 ile burun emme örnekleme interferon-γ (IFN-γ) düzeylerini ölçmek için kullanıldı. Veri hata çubukları interquartile aralıkları ifade eden bireylerin ve B) medyan düzeyleri A) pişmemiş spagetti araziler temsil edilir. (Şekil Hansel ve ark. izni ile yayımlanmaktadır 6). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : Nasosorption ayrımcılık bebeklerde RSV enfeksiyonu ile ilişkili yükseltilmiş Interferon γ. Burun emme ve nazofarenks aspirasyon (NPA) solunum sinsisyal virüs (RSV) enfeksiyonu ile ilişkili bronşiyolit bebeklerde interferon γ düzeylerini ölçmek için kullanılmıştır (kırmızı, n = 12), bir sigara RSV solunum patojen (yeşil, n = 12) ve sağlıklı denetimleri (mavi, n = 9). Veriler analiz Kruskall Wallis testi ile Dunnlar düzeltme birden fazla karşılaştırmalar için kullanma (***p< 0.001). Satırları gösterir medyan değerleri ve hata çubukları interquartile aralıkları. (Şekil Thwaites vd izninden modifiye 30). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5 : Bronş emme örneklerinde rhinovirus enfeksiyon sırasında inflamatuar arabulucu.Sağlıklı kontrol rhinovirus-16 enfeksiyonu takip (n = 10, mavi) ve Alerjik astım gönüllü (n = 23, kırmızı), bronş emme düzeyi A) IFN γ, B) CXCL11, C) IL-10, D) IL-5 temel ve günde 4 enfeksiyon ölçmek için kullanıldı. Veri analiz Wilcoxon tarafından rank testi (eşleşen örnekleri) ve Mann-Whitney testi (eşsiz örnekleri) imzaladı. Şekil Hansel ve ark. izni ile yayımlanmaktadır 6 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Mevcut hava yolu örnekleme teknikleri sonuçlarından son derece değişken olarak kabul edilmektedir; Alternatif örnekleme teknikleri araştırma içinde bu alan5standart hale getirmek için ihtiyaç vardır. NA ve BA MLF örnekleme non-invaziv bir şekilde izin ve sağlıklı ve hastalıklı airways bağışıklık yanıtları ölçmek için heyecan verici bir potansiyele sahip. Bu tekniklerin daha büyük tolerabilite, örnekleme hızı, örnekleme, sık sık tekrarlamak için yeteneği dahil olmak üzere varolan teknikleri üzerinde çok sayıda potansiyel avantajları arası kullanıcı değişkenliği daha düşük teklif ve seyreltme bağışıklık arabulucu5 azaldı . Emme ve işleme tekniği kullanılan süresi her çalışma için en iyi duruma getirilmiş ve titizlikle örnekleme olaylar arasında yapılmaktadır. Ayrıca, söz konusu olduğunda BA, örnekleme hava yolu içinde sitenin dikkatle bireyler arasında yinelenmelidir.

NA ve özellikle BA, klinik araştırma için hala nispeten yeni teknikler vardır. Ancak, bu teknikler Faydaları bunların kullanımı alternatif teknikleri5karşı dikkatli doğrulama dahil olmak üzere çok sayıda çalışmalarda sonuçlandı. Bu cihazlar şimdi Cihazlar CE işaretli solunum araştırma yaygın kullanım için hazır olarak mevcuttur. NA ve BA alternatif örnekleme teknikleri daha çok daha küçük örnek birimleri içinde sonucu iken, daha yüksek elde edilen konsantrasyonları düşük bereket için bağışıklık arabulucu büyük duyarlılık neden olabilir.

Bağlı olarak istenilen aşağı akım uygulamaları, NA ve BA örnekleri doğrudan çalışma fizibilite klinik araştırma ortamında geliştirilmesi daha sonra işlenmek donmuş olabilir. Örnek işleme için protokol Ayrıca belirli aşağı akım uygulamaları uyacak şekilde uyarlanabilir. Önerilen işleme teknikleri protein veya lipid bağışıklık arabulucu veya nükleik asitler topluluğu için kullanılabilir ancak her çalışma için optimize edilmelidir. Özellikle, MLF ile farklı arabellekleri eluted. İlk olarak, immunoassay arabellek Mukozal sitokinler, kemokinler ve antikorlar6,45ölçmek için kullanılabilir. Arabellekleri deterjan düzeyler ile hücre lizis oluşur, intra hücresel sitokinler eklenmesi izin güvence altına almak için de kullanılabilir. Chaotropic RNA ayıklama arabellekleri viral enfeksiyon, viral belirlenmesi için kullanılması gereken yük, mRNA ve microbiome ana. Alternatif olarak, lipidomics ve kütle spektrometresi organik çözücüler kullanılabilir.

Sonuç olarak, doğrudan emilimini MLF Mukozal yüzeyler Mukozal hastalıklarda solunum, mide-bağırsak, idrar ve diğer potansiyel kullanımı ile heyecan verici bir tekniktir. Ancak, bu umut verici emme teknikleri örnekleme ve bireysel deneyleri (biyolojik) her hastalık ayarı için teknik işleme kesin doğrulama gerektirir. Buna ek olarak, bu roman hassas Mukozal örnekleme teknikleri geleneksel örnekleri, dayalı doğrulamayı gibi kan, nefes ve balgam gerektirir. Bu teknikler ile MLF mikrop, sitokinler, kemokinler, prostanoids ve antikorlar ölçmek için kullanılabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Fonlama: Bu eser imparatorluk Ulusal Enstitüsü Sağlık Araştırma (NIHR) Biyomedikal Araştırma Merkezi (BRC için) NIHR sağlık koruma araştırma birimi (HPRU) anda Imperial College London’da solunum yolu enfeksiyonları içinde ortaklaşa finansman tarafından desteklenen Halk sağlığı İngiltere (PHE) ve NIHR imparatorluk hasta güvenliği translasyonel araştırma merkezi ile. Görüşler yazarlar ve ille bu NHS, NIHR, Sağlık Bakanlığı veya halk sağlığı İngiltere vardır.

Materials

Nasosorption (adult, 7mm width) Hunt Developments NSFL-FXI-11 Different sizes are available for different patient groups/ages.
Bronchosorption Hunt Developments BSFL-FXI-11 Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) Sigma Aldrich CLS9301-1000EA
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) Sigma Aldrich CLS8160-24EA For sterilisation of samples with infection risk.
Assay (elution) buffer Millipore AB-33k Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.
NP-40 Cell lysis buffer Life Technologies FNN0021 Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.
Buffer RLT (RNA extraction) Qiagen 79216 Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031-100ML-M For elution of samples to be used in HPLC applications
2.0ml micro-centrifuge tubes Costar 3213 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hansel, T. T., Johnston, S. L., Openshaw, P. J. Microbes and mucosal immune responses in asthma. Lancet. 381 (9869), 861-873 (2013).
  2. Lu, F. X., Esch, R. E. Novel nasal secretion collection method for the analysis of allergen specific antibodies and inflammatory biomarkers. J Immunol Methods. 356 (1-2), 6-17 (2010).
  3. Esposito, S., et al. Collection by trained pediatricians or parents of mid-turbinate nasal flocked swabs for the detection of influenza viruses in childhood. Virol J. 7 (1), 85 (2010).
  4. Macfarlane, P., Denham, J., Assous, J., Hughes, C. RSV testing in bronchiolitis: which nasal sampling method is best?. Arch Dis Child. 90 (6), 634-635 (2005).
  5. Jochems, S. P., et al. Novel Analysis of Immune Cells from Nasal Microbiopsy Demonstrates Reliable, Reproducible Data for Immune Populations, and Superior Cytokine Detection Compared to Nasal Wash. PLoS One. 12 (1), e0169805 (2017).
  6. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma Increased Interferons (IFN-gamma and IFN-lambda) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. , (2017).
  7. Rohan, L. C., et al. Optimization of the weck-Cel collection method for quantitation of cytokines in mucosal secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (1), 45-48 (2000).
  8. Castle, P. E., et al. Comparison of ophthalmic sponges for measurements of immune markers from cervical secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (2), 399-405 (2004).
  9. Chang, C. K., Cohen, M. E., Bienek, D. R. Efficiency of oral fluid collection devices in extracting antibodies. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 231-235 (2009).
  10. Lopez-Cisternas, J., Castillo-Diaz, J., Traipe-Castro, L., Lopez-Solis, R. O. Use of polyurethane minisponges to collect human tear fluid. Cornea. 25 (3), 312-318 (2006).
  11. Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
  12. Sim, T. C., Grant, J. A., Hilsmeier, K. A., Fukuda, Y., Alam, R. Proinflammatory cytokines in nasal secretions of allergic subjects after antigen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 149 (2 Pt 1), 339-344 (1994).
  13. Sim, T. C., Reece, L. M., Hilsmeier, K. A., Grant, J. A., Alam, R. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. Am J Respir Crit Care Med. 152 (3), 927-933 (1995).
  14. Weido, A. J., Reece, L. M., Alam, R., Cook, C. K., Sim, T. C. Intranasal fluticasone propionate inhibits recovery of chemokines and other cytokines in nasal secretions in allergen-induced rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol. 77 (5), 407-415 (1996).
  15. Linden, M., et al. Immediate effect of topical budesonide on allergen challenge-induced nasal mucosal fluid levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-5. Am J Respir Crit Care Med. 162 (5), 1705-1708 (2000).
  16. Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
  17. Riechelmann, H., Deutschle, T., Friemel, E., Gross, H. J., Bachem, M. Biological markers in nasal secretions. Eur Respir J. 21 (4), 600-605 (2003).
  18. Wagenmann, M., et al. Bilateral increases in histamine after unilateral nasal allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 155 (2), 426-431 (1997).
  19. Wagenmann, M., Schumacher, L., Bachert, C. The time course of the bilateral release of cytokines and mediators after unilateral nasal allergen challenge. Allergy. 60 (9), 1132-1138 (2005).
  20. Baumann, R., et al. The release of IL-31 and IL-13 after nasal allergen challenge and their relation to nasal symptoms. Clin Transl Allergy. 2 (1), 13 (2012).
  21. Baumann, R., et al. Nasal levels of soluble IL-33R ST2 and IL-16 in allergic rhinitis: inverse correlation trends with disease severity. Clin Exp Allergy. 43 (10), 1134-1143 (2013).
  22. Chawes, B. L., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
  23. Scadding, G. W., et al. Optimisation of grass pollen nasal allergen challenge for assessment of clinical and immunological outcomes. J Immunol Methods. 384 (1-2), 25-32 (2012).
  24. Leaker, B. R., et al. The nasal mucosal late allergic reaction to grass pollen involves type 2 inflammation (IL-5 and IL-13), the inflammasome (IL-1beta), and complement. Mucosal Immunol. 10 (2), 408-420 (2017).
  25. Nicholson, G. C., et al. The effects of an anti-IL-13 mAb on cytokine levels and nasal symptoms following nasal allergen challenge. J Allergy Clin Immunol. 128 (4), 800-807 (2011).
  26. Dhariwal, J., et al. Nasal Lipopolysaccharide Challenge and Cytokine Measurement Reflects Innate Mucosal Immune Responsiveness. PLoS One. 10 (9), e0135363 (2015).
  27. Folsgaard, N. V., et al. Neonatal cytokine profile in the airway mucosal lining fluid is skewed by maternal atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
  28. Folsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
  29. Wolsk, H. M., et al. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
  30. Thwaites, R. S., et al. Nasosorption as a Minimally Invasive Sampling Procedure: Mucosal Viral Load and Inflammation in Primary RSV Bronchiolitis. J Infect Dis. 215 (8), 1240-1244 (2017).
  31. Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
  32. Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), L1088-L1094 (2004).
  33. Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
  34. Yamazaki, K., Ogura, S., Ishizaka, A., Oh-hara, T., Nishimura, M. Bronchoscopic microsampling method for measuring drug concentration in epithelial lining fluid. Am J Respir Crit Care Med. 168 (11), 1304-1307 (2003).
  35. Kikuchi, J., Yamazaki, K., Kikuchi, E., Ishizaka, A., Nishimura, M. Pharmacokinetics of telithromycin using bronchoscopic microsampling after single and multiple oral doses. Pulm Pharmacol Ther. 20 (5), 549-555 (2007).
  36. Kikuchi, E., et al. Comparison of the pharmacodynamics of biapenem in bronchial epithelial lining fluid in healthy volunteers given half-hour and three-hour intravenous infusions. Antimicrob Agents Chemother. 53 (7), 2799-2803 (2009).
  37. Kodama, T., et al. A technological advance comparing epithelial lining fluid from different regions of the lung in smokers. Respir Med. 103 (1), 35-40 (2009).
  38. Sasabayashi, M., Yamazaki, Y., Tsushima, K., Hatayama, O., Okabe, T. Usefulness of bronchoscopic microsampling to detect the pathogenic bacteria of respiratory infection. Chest. 131 (2), 474-479 (2007).
  39. Kipnis, E., et al. Proteomic analysis of undiluted lung epithelial lining fluid. Chest. 134 (2), 338-345 (2008).
  40. Kanazawa, H., Kodama, T., Asai, K., Matsumura, S., Hirata, K. Increased levels of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine in epithelial lining fluid from peripheral airways in patients with chronic obstructive pulmonary disease: a pilot study. Clin Sci (Lond). 119 (3), 143-149 (2010).
  41. Sugasawa, Y., et al. The effect of one-lung ventilation upon pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 25 (2), 170-177 (2011).
  42. Sugasawa, Y., et al. Effects of sevoflurane and propofol on pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 26 (1), 62-69 (2012).
  43. Cohen, J., et al. Ciclesonide improves measures of small airway involvement in asthma. Eur Respir J. 31 (6), 1213-1220 (2008).
  44. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  45. de Silva, T. I., et al. Comparison of mucosal lining fluid sampling methods and influenza-specific IgA detection assays for use in human studies of influenza immunity. J Immunol Methods. , (2017).

Tags

NasosorptionNasal MucosaRespiratory MucosaPrecision SamplingSynthetic Absorptive MatrixSAMNasal CavityInferior TurbinateMucosal Lining FluidBronchosorptionBronchial Mucosa

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Thwaites, R. S., Jarvis, H. C., Singh, N., Jha, A., Pritchard, A., Fan, H., Tunstall, T., Nanan, J., Nadel, S., Kon, O. M., Openshaw, P. J., Hansel, T. T. Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples. J. Vis. Exp. (131), e56413, doi:10.3791/56413 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image