JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Absorptie van vloeistoffen nasale en bronchiale: Precision bemonstering van de menselijke respiratoire Mucosa en laboratorium verwerking van de monsters

Published: January 21, 2018
doi:
10.3791/56413
, , , , , , , , , , ,
1National Heart and Lung Institute, Faculty of Medicine, Imperial College London,St Mary’s Hospital, 2St Mary’s Hospital,Imperial College Healthcare Trust

Summary

Dit manuscript beschrijft het gebruik van nasale en bronchiale absorptie technieken, specifiek met behulp van synthetische absorberend matrices (SAM) om te proeven van de mucosal voering vloeistof (MLF) van de bovenste en onderste luchtwegen. Deze methoden bieden betere standaardisatie en verdraagbaarheid dan bestaande respiratoire bemonsteringstechnieken.

Abstract

De methoden van nasale absorptie (nvt) en bronchiale absorptie (BA) gebruiken synthetische absorberend matrices (SAM) om te absorberen de mucosal voering vloeistof (MLF) van de menselijke luchtwegen. NB is een niet-invasieve techniek die absorbeert vloeistof uit de turbinate inferior en minimaal ongemak veroorzaakt. NB heeft reproduceerbare resultaten opgeleverd met de mogelijkheid om vaak herhalen bemonstering van de bovenste luchtwegen.

Ter vergelijking, alternatieve methoden voor bemonstering van de respiratoire mucosa, zoals de keelholte aspiratie (NPA) en conventionele zwabberen, zijn meer invasief en kunnen leiden tot grotere variabiliteit van de gegevens. Andere methoden hebben beperkingen, bijvoorbeeld, biopten en bronchiale procedures zijn invasief, sputum bevat vele doden sterven cellen en vereist vloeibaar, uitgeademde adem condensaat (EBC) bevat water en speeksel en lavage monsters verdund worden en variabele.

BA kan worden uitgevoerd via het kanaal van de werken van een bronchoscope in de kliniek. Bemonstering wordt goed verdragen en kan worden uitgevoerd op meerdere locaties in de luchtwegen. BA resulteert in MLF monsters minder verdund dan bronchoalveolar lavage (BAL) monsters.

Dit artikel demonstreert de technieken van NA en BA, alsook de verwerking van het laboratorium van de resulterende monsters, die kan worden aangepast aan de gewenste downstream biomerker wordt gemeten. Deze absorptie technieken zijn nuttig alternatieven voor de conventionele bemonsteringstechnieken gebruikt in klinisch onderzoek van de luchtwegen.

Introduction

De meeste aandoeningen van de luchtwegen veroorzaken een inflammatoire respons, en er is een dringende noodzaak voor bemonstering van de respiratoire mucosa oppervlak in allergische rhinitis, virale en schimmelinfecties, tuberculose, astma, chronische obstructieve longziekte, pulmonale fibrose en long kanker 1. Keelholte aspirate (vzw), nasale lavage en bronchoalveolar lavage (BAL) zijn gemeenschappelijke technieken voor bemonstering van de bovenste en onderste luchtwegen. Deze technieken presenteren echter aanzienlijke problemen met inbegrip van arme verdraagbaarheid, verdunning van inflammatoire mediatoren en het onvermogen om te vaak Herhaal bemonstering2. Een alternatief voor NPA bemonstering is het gebruik van de wissers, ofwel stroomden nylon, katoen, of rayon3,4, maar deze hebben ook beperkingen, omdat ze leiden ongemak en schade aan de neus epitheel, en in sommige gevallen onomkeerbaar binding van tot inflammatoire mediatoren5. Deze technieken kunnen niet over het algemeen serieel herhaald worden meer dan een uur kunnen, en alternatieve technieken effectiever voor detectie van lage overvloed cytokines en chemokines5,6. Bovendien kan de variabiliteit van de gebruiker die samenhangen met deze technieken inconsistenties in de gegevens, wat resulteert in de eis van grotere patiënt cohorten genereren.

Anderzijds hebben absorptie-technieken met behulp van zowel natuurlijke als synthetische sponzen zijn gebruikt voor het verzamelen van MLF van mucosal oppervlakken. Ophthalmic sponzen samengesteld uit natuurlijke cellulose (bijvoorbeeldWeck-cel) zijn gebruikt voor het monster speeksel, cervicale, en vaginale afscheidingen7. Bovendien, synthetische sponzen gemaakt van polyvinylalcohol (PVA) en gehydroxyleerde polyvinylacetaat (HPVA) zijn benut8. Zeven verschillende absorberend materiaal zijn vergeleken voor bemonstering van mondelinge vloeistof voorafgaand aan het meten van antilichamen9, terwijl polyurethaan mini-sponzen zijn gebruikt voor het verzamelen van menselijke tranen10.

Filtreerpapier bestaande uit natuurlijke cellulose uit de katoenplant is wijd verbeid gebruikt om te absorberen nasale secreties sinds het baanbrekende document uit Alam en collega’s in 199211,12,13,14, 15,16,17. Filtreerpapier schijven zijn verkregen uit filter kaarten (bijvoorbeeld Shandon) en hebben gebruikt voor het meten van histamine en cytokinen nadat controle nasale allergeen uitdagingen en met natuurlijke allergeen blootstelling18,19 2120, ,. Echter, verschillende batches instellen filtreerpapier variëren in hun mate van binding aan eiwitten en sommige niet vrij van cytokines. Methoden met behulp van een synthetische absorberend matrix (SAM) zijn daarom ontwikkelde2,22,23. SAMs zijn nu over het algemeen gebruikt om te verkrijgen van de nasale MLF door NA. Deze absorberende materialen zijn comfortabel om te gebruiken en kan verkrijgen MLF zelfs ontstoken neus met regelmatige tussenpozen gedurende langere perioden van tijd.

Nasale absorptie is een vorm van precisie Mucosal bemonstering met behulp van een SAM voor de bemonstering van MLF in de bovenste luchtwegen. NB apparaten worden vervaardigd als medische hulpmiddelen CE-markering van medische kwaliteit materialen met behulp van schone kamers en zijn vrij van stof en allergenen. De sampler nb bestaat uit een handvat en SAM in een steriele cryotube. De SAM bestaat uit polymeren, meestal vezels, maar het is ook beschikbaar als schuim, en deze zijn geselecteerd om te worden zacht en absorberend, met snelle wicking voor sample collectie. SAMs hebben de binding van de minimale eiwitten om de efficiënte elutie van geabsorbeerde afscheidingen. NB is een zeer zacht, niet-invasieve techniek die kan worden uitgevoerd op donoren van alle leeftijden. Daarnaast, is seriële bemonstering, zelfs om de paar minuten, mogelijk. NB is gevalideerd tegen bestaande bovenste luchtwegen technieken5 bemonstering en repetitieve bemonstering heeft toegestaan generatie van kinetische gegevens op basis van de uitdaging van de luchtwegen met allergeen23,24,25, bacteriële endotoxinen26 en virale-type TLR agonisten (JBZ, A. et al., manuscript in voorbereiding). NB is ook gebruikt in zuigelingen te onderzoeken van de natuurlijke geschiedenis van atopie27,28,29 en virale bronchiolitis30.

Bronchoscopische microsampling (BMS) is een procedure voor de collectie van MLF in de lagere luchtwegen die is ontwikkeld door Olympus31,32,33. Dit BMS-systeem is helaas alleen beschikbaar in Japan. Olympus leveren twee BMS systemen: één met een vezelige gehydroxyleerde polyester (FHPE) sonde34,35,,36,,37, en een met een katoenen probe33,,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. een groot struikelblok is geweest dat de BMS-sonde gebruikt bij patiënten met astma mucosal contact bloeden veroorzaakt, met de helft van alle monsters besmet met bloed. De auteurs concludeerden dat het niet haalbaar is om te monster MLF dit BMS systeem van perifere airways met astma patiënten43was.

Als alternatief hebben we ontwikkeld met behulp van een zachte SAM die kan worden uitgevoerd gedurende bronchoscopische behandeling van de lagere luchtwegen klem zitten, met inbegrip van experimentele besmetting van astmatische patiënten met rhinovirus6na BA. De BA-apparaat bestaat uit: een externe holle katheter, een hand-stuk dat op activering gesteenten van de SAM en een centrale kunststof begeleidingskabel die de SAM op zijn einde heeft. Wat NA, BA kits zijn vervaardigd uit medische kwaliteit materialen met behulp van schone kamers en zijn vrij van stof en allergenen. Daarnaast zijn apparaten CE-gemarkeerd en gamma-bestraald worden geleverd. De SAM strook is zacht, absorberend, en heeft snelle wicking voor sample collectie. Het heeft ook de binding van de minimale eiwitten om de efficiënte elutie van geabsorbeerde afscheidingen. Het apparaat kan passen via het kanaal van de werken van een bronchoscope en kan worden gebruikt om snel en nauwkeurig proef MLF op specifieke sites van belang in de luchtwegen. In tegenstelling tot BAL of BMS, BA niet leidt tot contact bloeding of extra patiënt ongemak na procedure.

Zorgvuldige aandacht moet worden besteed aan de verwerking van NA en BA monsters. Monsters kunnen rechtstreeks bevroren en verwerkt in partijen of onmiddellijk kan worden verwerkt. Het type van verwerking kan worden aangepast naar bepaalde downstream toepassingen, met inbegrip van immunoassay voor cytokines, chemokines en immunoglobulinen of elutions van virale, bacteriële, en gastheercel bijbehorende RNA. Presenteren wij de collectie van de klinische en laboratorium verwerkingstechnieken NA en BA als een gids voor klinische onderzoekers is gekoppeld.

Protocol

De technieken die worden gebruikt in het volgende protocol zijn goedgekeurd door de ethische commissie voor West Londen onderzoek (referentienummer 15/lO/0444). 1. nasale absorptie (NB) Voorbereiding voordat NA bemonstering Bij het uitvoeren van nb, eerst handen wassen en handschoenen, bij voorkeur voor de patiënt te zetten. Controleer de neusholte met behulp van een hoofd toorts, en hebben de behandelaar gebruiken hun niet-dominante duim te trekken van de patiënt neus om te visualiseren de neusholte.Opmerking: Een nasale speculum is niet gewoonlijk vereist. Visualiseer de neusholte en inferior turbinate vóór de bemonstering.Opmerking: De neusgaten (neusgaten) zijn geen ronde in doorsnede en ze niet meteen achteruit gaan. In het algemeen de turbinate inferior kan worden gezien als een verdikking of inspringing aan de laterale wand van de neusgat, met de neus is weggesneden vormen de muur glad, plat mediale. Wij willen monster uit dit inferieur turbinate, aangezien de onderliggende epitheel een eenvoudige ciliated epitheel van de luchtwegen44 is. NA bemonstering Bij de bemonstering, passeren de nb SAM zachtjes omhoog het lumen van het neusgat, oriënteert het te plat tegen de turbinate inferior. Vragen van de donor met een wijsvinger te druk op de SAM op de nasale mucosa. NB kan leiden tot een lichte kietelen, met mogelijk oog drenken, zoals de MLF wordt geabsorbeerd.Opmerking: Bij volwassenen, voeren wij in het algemeen NA voor 60 s. Na absorptie van MLF, verwijdert u het apparaat NA van de neusgat en zet terug in de originele buis. De monsters in het laboratorium onmiddellijk verwerken of bevriezen ze, als gedetailleerde verderop in dit protocol.Opmerking: NB wordt onderzocht in een verscheidenheid van nasale mucosal uitdaging modellen, en ook in verschillende airways ziekten. Validatie tegen andere respiratoire bemonsteringsmethoden moet echter worden uitgevoerd voor elke studie en patiënt bevolking. 2. bronchiale absorptie (BA) Voorbereiding voorafgaand aan BA bemonsteringOpmerking: BA wordt uitgevoerd door gespecialiseerde personeel in een bronchoscopie suite. Alvorens het apparaat BA beneden de katheter te plaatsen, Controleer of de SAM is extruderen en intrekking van terug in de katheter. Vóór het uitvoeren van BA op een patiënt, voeren een mock BA op een bronchoscopie simulator. BA bemonstering De bronchoscope de luchtpijp en recht belangrijkste bronchiën doorgeven aan het niveau van de bronchiën intermedius, gewoon proximale naar de klasse in de juiste lagere en rechts midden lobben.Opmerking: We meestal genieten van de bronchiën intermedius, hoewel andere sites binnen de luchtwegen kunnen worden bemonsterd. Als observatie van de katheter en SAM, zien niet een uiteinde van de bronchoscope. We observeren de volgende eenvoudige stappen voor BA, zodra de bronchoscope de gewenste sampling-site bereikt. KATHETER naar beneden: Invoegen de BA-katheter via de operationele kanaal van de bronchoscope totdat de witte tip net zichtbaar in de luchtwegen, tot een maximum van 1 cm distale aan het einde van de bronchoscope is. Houd het bronchoscope en katheter puntje in het midden van het lumen van de luchtwegen. Wees voorzichtig om Minimaliseer contact tussen het uiteinde van de katheter en de bronchiale mucosa om het risico van slijtage aan de mucosa. SAM OUT: Druk de hendel van de BA-apparaat zodat de SAM is geëxtrudeerd in het lumen van de luchtroute rechts midden of rechts onderste kwab. Buig het uiteinde van de bronchoscope om ervoor te zorgen dat de SAM is het maken van contact met de MLF op de muur van de luchtweg onder direct zicht. Laat de SAM binnen de luchtwegen, vlak aan de mucosale muur voor 30 s. SAM IN: Kijk door de bronchoscope om ervoor te zorgen dat de vochtige SAM sonde rechtdoor en niet gebogen terug over het uiteinde van de katheter. Indien nodig, kan de uiteinde van de katheter en bronchoscope worden gebracht terug naar het rechttrekken van de SAM. Onder direct zicht, trekken de rechte SAM zachtjes terug in de katheter.Opmerking: Als er moeilijkheden intrekken van de SAM terug in de katheter, trekken het hele apparaat met SAM geëxtrudeerd terug uit de luchtwegen. KATHETER UP: De gehele katheter trekken uit het operationele kanaal van de bronchoscope. AFGESNEDEN SAM: De SAM is afgesneden met een steriele schaar en is dan gezet in een cryotube op het ijs. Deze monsters kunnen worden verwerkt met verschillende methoden, zoals verderop in dit protocol. 3. de verwerking van NA en BA monsters Opmerking: Er zijn tal van opties voor de verwerking van het laboratorium van monsters die voortvloeien uit NA en BA. Deze protocollen willen om op te slaan voor later gebruik monsters, en elueer de MLF monster uit de SAM. Opties voor onmiddellijke afhandeling van NA en BA monsters Optie 1: Slaan de vochtige SAM op ijs voor een paar uur vóór verdere verwerking. Optie 2: Onmiddellijk diepvries nb SAMs in de collectie buis. Evenzo bevriezen BA SAMs in cryogene flesjes na verwijdering, met een schaar, uit de bemonsteringsapparatuur. Optie 3: Plaats de vrijstaande SAM in elutie buffer (300 µL) vóór verwerking direct of diepe bevriezing. Opties voor elutie buffer voor NA en BA monstersOpmerking: De keuze van de elutie buffer hangt af van wat er gaat worden geanalyseerd in het MLF monster en wij stellen voor de vier belangrijkste alternatieven: Gebruik een geschikt voor immunoassay procedures vooraf bereid assay-buffer. Dergelijke buffers moeten bevatten een kleine hoeveelheid wasmiddel (0.05%) en eiwit, bijvoorbeeld bovien serumalbumine (BSA) op 1%. Ook gebruiken een buffer met een grotere hoeveelheid wasmiddel, zodat lysis van de cel voorkomt.Opmerking: We gebruiken de buffers Triton-X of NP40 met 1% concentratie. Cellysis buffers in staat stellen zowel de intracellulaire en de extracellulaire cytokines worden geëlueerd van de SAM, en in het algemeen resulteren in hogere niveaus van cytokines en chemokines. Deze buffers moeten bevatten ook eiwitten, en zijn opgebouwd met BSA tot 1%. Voor RNA metingen, zoals kwantitatieve PCR van viraal RNA of meten host RNA, RNA extractie buffer rechtstreeks toevoegen aan de vochtige SAM.Opmerking: Chaotropic RNA extractie buffers bevatten guanidinium die proteïnen denatureert. Een alternatief is het toevoegen van RNA extractie buffer aan de eluted MLF vloeistoffen in immunoassay of cel lysis-buffermengsel. Gebruik van organische oplosmiddelen, zoals trifluorazijnzuur, voor winning van lipiden en metabolieten, voor evaluatie door massa-spectrometrie.Opmerking: Details van deze alle reagentia zijn opgenomen in de sectie materialen. Elutie techniek Voor elk van de bovenstaande elutie technieken, plaatst u de SAM in een 2 mL micro-centrifuge buis, samen met de gewenste extractie buffer. Vortex Meng het monster voor 30 s te wassen de SAM van losjes gekoppelde vloeistoffen en biomoleculen. Uitvoeren om ervoor te zorgen volledige monster herstel, centrifugaal elutie door de vochtige SAM toe te voegen aan een spin filter mini kolom die wordt ingevoegd in de dezelfde 2 mL micro-centrifuge buis gebruikt voor het wassen.Opmerking: Twee soorten spin filter mini kolom kunnen worden gebruikt. De eerste bevat alleen een netwave, die de SAM op zijn plaats houdt, waardoor volledige elutie van vloeistoffen. Als alternatief, als het werken met besmettelijke materialen, spin filters gebruiken met een poriegrootte 0,22 µm. Deze filters monsters zal steriliseren en zijn geschikt voor monsters met een vermoedelijke mycobacteriële infecties. Deze filters moeten echter vooraf bebroede met buffer, om te minimaliseren van de binding van bemiddelaars aan het filter door niet-specifieke interacties. Gesteriliseerde pincet gebruiken de vochtige SAM overbrengen naar de filter van de draai. Wijzigen pincet tussen monsters om verontreiniging te voorkomen. Centrifuge monsters gedurende 20 minuten bij 16.000 x g in een mini centrifuge gekoeld tot 4 ° C. Samenvatting voorbeeld protocol In het laboratorium, label 2 mL micro-centrifuge buizen voor sample collectie en voeg de gewenste hoeveelheid elutie buffer (typisch 300 µL voor nb; 100 µL voor BA). Afdichting van de deksel en plaats op ijs. Na bemonstering (hetzij onmiddellijk, hetzij in het lab) de SAM is verwijderd uit de greep met pincet en geplaatst in de buffer met collectie buis (geproduceerd in de vorige stap). De dop van de tube microcentrifuge veilig wordt gesloten en de overdracht van de monsters, op ijs, naar het laboratorium voor verdere verwerking zorgen. Verwijderen van buizen met SAM en elutie buffer van hun overdracht container en vortex mix voor 30 s. Met behulp van steriele pincet, SAM Verwijder en plaats in een kolom van de spin (met of zonder 0,22 µm celluloseacetaat filter). De buffer van de elutie verzamelen uit de collectie buis en bewaren. De spin-kolom, met SAM, in de oorspronkelijke collectie buis plaatsen (of een nieuwe als steriel-filtert monsters) en collectie buffer om te draaien kolom toe te voegen. Op deze manier, zal de vloeistof wassen de spin kolom terug in de collectie buis, helpen om het monster van de SAM Elueer passeren. Centrifugeer de monsters met deksels verzegeld (16.000 x g, 20 min, 4 ° C). Verwijder de monsters uit de centrifuge en plaats in een rack. Open het verzegelde deksel van de buizen en verwijder de kolom van de spin met de SAM. Vervreemding van SAM en spin kolom in een geschikte afvalcontainer. Zorgvuldig buizen aliquot het eluaat deel uitmaakt van de buis in geëtiketteerd cryogene. Het totale volume van het eluaat en het volume in elk aliquot opnemen. De verzegelde cryogene buizen overbrengen in een vriezer-80 ° C en rechtop bewaren tot gebruik.

Representative Results

NB is gebruikt in een aantal studies naar eenvoudig en niet-gebeurt het meten van mucosal ontsteking. Na toediening van allergeen op de neus, prostaglandine-D2 (PGD2) kan worden waargenomen om te stijgen en dalen binnen minuten (Figuur 1), in overeenstemming met de mestcel degranulatie (Thwaites et al., manuscript in voorbereiding). Bovendien, kunnen bemiddelaars van ontsteking van de type-II, zoals IL-5 (Figuur 2, herdrukt met toestemming van 24), worden gemeten in de uren na23,24van de uitdaging van de nasale allergeen. In experimentele besmetting van allergische asthma en gezonde controles, werd nb gebruikt voor het meten van een panel van bemiddelaars/mediators, met inbegrip van interferon-gamma (IFN-γ), in de loop van 7 dagen (Figuur 3, herdrukt met toestemming van 6). Bovendien, in natuurlijke respiratoir syncytieel virus (RSV) besmetting van zuigelingen, nb aangetoond RSV moeten worden gekoppeld aan verhoogde niveaus van inflammatoire cytokines, zoals IFN-γ, ten opzichte van niet-RSV zuigelingen met bronchiolitis en gezonde controles ( Figuur 4, herdrukt met toestemming van 30). Interessant is dat was deze discriminatie tussen RSV en niet-RSV-bronchiolitis niet significant in tijd-matched NPA monsters (Figuur 4). BA werd ook gebruikt tijdens de experimentele besmetting van allergische asthma met rhinovirus. Op dag 4 van rhinovirus infectie, niveaus van IFN-γ, CXCL11, waren IL-10, en IL-5 verhoogde vanaf basislijn (Figuur 5; A, B, C en D, respectievelijk). Bovendien, deze techniek aangetoond verhoogde niveaus van de IL-5 in de lagere luchtwegen van allergische asthma tijdens rhinovirus infectie, ten opzichte van gezonde controles (figuur 5D) (Figuur 5 herdrukt met toestemming van 6). Deze representatieve resultaten werden gegenereerd op basis van monsters geëlueerd gebruik assay buffer met 0,05% Tween-20 en 1% BSA (Zie Tabel van materialen). Figuur 1 : Snelle generatie en de ontmijning van prostaglandine-D2 na nasale allergeen uitdaging. Niveaus van prostaglandine-D2 (PGD2) gemeten vanaf nasale absorptie eluaten in seriële monsters na nasale allergeen uitdaging met Timothy grass stuifmeel (n = 5). Elke regel staat voor gegevens van de ene persoon. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 : Kinetische meting van IL-5 na nasale allergeen uitdaging. De productie van IL-5 in seriële nasale absorptie monsters na nasale allergeen uitdaging. Drie Herhaal allergeen uitdaging studies werden uitgevoerd, met de deelnemers (n = 19) ontvangst van placebo (blauw), lage dosis (10 mg) mondelinge prednison (oranje) of hoge dosis (25 mg) mondelinge prednison (rood) één uur vóór de toediening van het allergeen. Lijnen duiden meetkundige gemiddelde en foutbalken zijn 95%-betrouwbaarheidsintervallen van alle deelnemers. (Figuur overgenomen met toestemming van Leaker et al., Mucosale immunologie, 2017). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Inductie van Interferon-γ tijdens rhinovirus infectie. Tijdens de infectie uitdaging van gezonde volwassenen (n = 11, blauw) en allergische asthma (n = 28, rood) met rhinovirus-16, nasale absorptie bemonstering werd gebruikt voor het meten van interferon-γ (IFN-γ). Gegevens worden weergegeven als A) rauwe spaghetti percelen van individuen en B) gemiddelde niveaus met foutbalken ter aanduiding van de interquartile bereiken. (Figuur overgenomen met toestemming van Hansel et al. 6). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : Nasosorption discrimineert verhoogde Interferon-γ geassocieerd met RSV-infectie van zuigelingen. Absorptie van de neus en keelholte aspiratie (NPA) werden gebruikt voor het meten van interferon-γ niveaus bij zuigelingen met bronchiolitis respiratoir syncytieel virus (RSV) infectie is gekoppeld (rood, n = 12), een niet-RSV respiratoire pathogenen (groen, n = 12), en gezond besturingselementen (blauw, n = 9). Gegevens zijn geanalyseerd met behulp van een Kruskall-Wallis test met Dunns correctie voor meerdere vergelijkingen (***p< 0,001). Lijnen geeft de mediane waarden en foutbalken zijn interquartile bereiken. (Figuur bewerkt met toestemming van Thwaites et al. 30). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5 : Inflammatoire mediatoren in bronchiale absorptie monsters tijdens rhinovirus infectie.Na rhinovirus-16 infectie van gezonde controles (n = 10, blauw) en allergische astmatische vrijwilligers (n = 23, rood), bronchiale absorptie werd gebruikt voor het meten van A) IFN-γ, B) CXCL11 C) IL-10 en D) IL-5 op basislijn en op dag 4 van de infectie. Gegevens geanalyseerd door Wilcoxon ondertekend rangschikking (gecompenseerde monsters) en Mann-Whitney test (ongeëvenaarde monsters). Figuur overgenomen met toestemming van Hansel et al. 6 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Resultaten van bestaande airway bemonsteringstechnieken worden beschouwd als zeer variabel; alternatieve bemonsteringstechnieken zijn nodig om het standaardiseren van onderzoek binnen dit veld5. NB BA bemonstering van MLF toestaan in een niet-invasieve wijze en opwindend potentieel voor het meten van de immuunrespons in gezonde en zieke luchtwegen hebben. Deze technieken bieden talrijke potentiële voordelen ten opzichte van bestaande technieken, met inbegrip van grotere verdraagbaarheid, snelheid van de bemonstering, de mogelijkheid te vaak herhalen van bemonstering, lagere variabiliteit tussen gebruiker en daalde verdunning van immuun bemiddelaars5 . De duur van absorptie en de verwerking toegepaste techniek moet worden geoptimaliseerd voor elk onderzoek en streng gehandhaafd tussen bemonstering gebeurtenissen. Bovendien, in het geval van BA, moet de plaats van bemonstering in de luchtwegen worden zorgvuldig gerepliceerd tussen individuen.

NB, en met name BA, zijn nog steeds relatief nieuwe technieken voor klinisch onderzoek. De voordelen van deze technieken hebben echter geleid tot hun gebruik in tal van studies, met inbegrip van zorgvuldige validatie tegen alternatieve technieken5. Deze apparaten zijn nu beschikbaar als CE-markering apparaten klaar voor algemeen gebruik in respiratoir onderzoek. Terwijl NA en BA in veel kleinere hoeveelheden van het monster dan alternatieve bemonsteringstechnieken resulteren, hogere verkregen concentraties kunnen leiden tot grotere gevoeligheid voor lage overvloed immuun bemiddelaars/mediators.

Afhankelijk van de gewenste downstream toepassingen, kunnen NA en BA monsters rechtstreeks worden bevroren voor latere verwerking, verbetering van de haalbaarheid van de studie in de omgeving van een klinisch onderzoek. Het protocol voor de behandeling van het monster kan ook worden aangepast aan bepaalde downstream toepassingen. De voorgestelde verwerkingstechnieken kunnen worden gebruikt voor de collectie van eiwit, lipide immuun bemiddelaars of nucleic zuren, maar moeten worden geoptimaliseerd voor elk onderzoek. In het bijzonder kan MLF met verschillende buffers worden geëlueerd. In de eerste plaats kan immunoassay buffer worden gebruikt voor het meten van de mucosal cytokines, chemokines en antilichamen6,45. Buffers met hogere wasmiddel kunnen ook worden gebruikt om te garanderen dat lysis van de cel vindt plaats, waardoor de opname van intra-cellulaire cytokines. Chaotropic RNA extractie buffers moeten worden gebruikt voor de bepaling van virale infectie, virale load, hosten van mRNA, en de microbiome. Ook kunnen organische oplosmiddelen worden gebruikt voor jachtgeweerlipidomics en massaspectrometrie.

Kortom, is directe absorptie van MLF van mucosal oppervlakken een spannende techniek met potentiële gebruik in respiratoir, gastro-intestinale urogenitale en andere mucosal ziekten. Deze veelbelovende technieken van de absorptie zal echter precieze validatie voor bemonstering en verwerken van de techniek voor individuele tests (biomarkers) in elke instelling van de ziekte. Bovendien, vraagt deze roman precisie mucosal bemonsteringstechnieken validatie tegen conventionele monsters, zoals bloed, adem en sputum. Met deze technieken, kan MLF worden gebruikt voor het meten van de microben, cytokines chemokines, prostanoids en antilichamen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiering: Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de keizerlijke nationale Instituut voor gezondheid onderzoek (NIHR) Biomedische Research Centrum (BRC), de NIHR gezondheid bescherming Research Unit (HPRU) in infecties van de luchtwegen aan het Imperial College London in partnerschap met de volksgezondheid Engeland (PHE) en het NIHR Imperial patiëntveiligheid translationeel onderzoekscentrum. De standpunten zijn die van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs die van de NHS, de NIHR, het ministerie van volksgezondheid of Public Health England.

Materials

Nasosorption (adult, 7mm width) Hunt Developments NSFL-FXI-11 Different sizes are available for different patient groups/ages.
Bronchosorption Hunt Developments BSFL-FXI-11 Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) Sigma Aldrich CLS9301-1000EA
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) Sigma Aldrich CLS8160-24EA For sterilisation of samples with infection risk.
Assay (elution) buffer Millipore AB-33k Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.
NP-40 Cell lysis buffer Life Technologies FNN0021 Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.
Buffer RLT (RNA extraction) Qiagen 79216 Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031-100ML-M For elution of samples to be used in HPLC applications
2.0ml micro-centrifuge tubes Costar 3213 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hansel, T. T., Johnston, S. L., Openshaw, P. J. Microbes and mucosal immune responses in asthma. Lancet. 381 (9869), 861-873 (2013).
  2. Lu, F. X., Esch, R. E. Novel nasal secretion collection method for the analysis of allergen specific antibodies and inflammatory biomarkers. J Immunol Methods. 356 (1-2), 6-17 (2010).
  3. Esposito, S., et al. Collection by trained pediatricians or parents of mid-turbinate nasal flocked swabs for the detection of influenza viruses in childhood. Virol J. 7 (1), 85 (2010).
  4. Macfarlane, P., Denham, J., Assous, J., Hughes, C. RSV testing in bronchiolitis: which nasal sampling method is best?. Arch Dis Child. 90 (6), 634-635 (2005).
  5. Jochems, S. P., et al. Novel Analysis of Immune Cells from Nasal Microbiopsy Demonstrates Reliable, Reproducible Data for Immune Populations, and Superior Cytokine Detection Compared to Nasal Wash. PLoS One. 12 (1), e0169805 (2017).
  6. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma Increased Interferons (IFN-gamma and IFN-lambda) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. , (2017).
  7. Rohan, L. C., et al. Optimization of the weck-Cel collection method for quantitation of cytokines in mucosal secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (1), 45-48 (2000).
  8. Castle, P. E., et al. Comparison of ophthalmic sponges for measurements of immune markers from cervical secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (2), 399-405 (2004).
  9. Chang, C. K., Cohen, M. E., Bienek, D. R. Efficiency of oral fluid collection devices in extracting antibodies. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 231-235 (2009).
  10. Lopez-Cisternas, J., Castillo-Diaz, J., Traipe-Castro, L., Lopez-Solis, R. O. Use of polyurethane minisponges to collect human tear fluid. Cornea. 25 (3), 312-318 (2006).
  11. Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
  12. Sim, T. C., Grant, J. A., Hilsmeier, K. A., Fukuda, Y., Alam, R. Proinflammatory cytokines in nasal secretions of allergic subjects after antigen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 149 (2 Pt 1), 339-344 (1994).
  13. Sim, T. C., Reece, L. M., Hilsmeier, K. A., Grant, J. A., Alam, R. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. Am J Respir Crit Care Med. 152 (3), 927-933 (1995).
  14. Weido, A. J., Reece, L. M., Alam, R., Cook, C. K., Sim, T. C. Intranasal fluticasone propionate inhibits recovery of chemokines and other cytokines in nasal secretions in allergen-induced rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol. 77 (5), 407-415 (1996).
  15. Linden, M., et al. Immediate effect of topical budesonide on allergen challenge-induced nasal mucosal fluid levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-5. Am J Respir Crit Care Med. 162 (5), 1705-1708 (2000).
  16. Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
  17. Riechelmann, H., Deutschle, T., Friemel, E., Gross, H. J., Bachem, M. Biological markers in nasal secretions. Eur Respir J. 21 (4), 600-605 (2003).
  18. Wagenmann, M., et al. Bilateral increases in histamine after unilateral nasal allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 155 (2), 426-431 (1997).
  19. Wagenmann, M., Schumacher, L., Bachert, C. The time course of the bilateral release of cytokines and mediators after unilateral nasal allergen challenge. Allergy. 60 (9), 1132-1138 (2005).
  20. Baumann, R., et al. The release of IL-31 and IL-13 after nasal allergen challenge and their relation to nasal symptoms. Clin Transl Allergy. 2 (1), 13 (2012).
  21. Baumann, R., et al. Nasal levels of soluble IL-33R ST2 and IL-16 in allergic rhinitis: inverse correlation trends with disease severity. Clin Exp Allergy. 43 (10), 1134-1143 (2013).
  22. Chawes, B. L., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
  23. Scadding, G. W., et al. Optimisation of grass pollen nasal allergen challenge for assessment of clinical and immunological outcomes. J Immunol Methods. 384 (1-2), 25-32 (2012).
  24. Leaker, B. R., et al. The nasal mucosal late allergic reaction to grass pollen involves type 2 inflammation (IL-5 and IL-13), the inflammasome (IL-1beta), and complement. Mucosal Immunol. 10 (2), 408-420 (2017).
  25. Nicholson, G. C., et al. The effects of an anti-IL-13 mAb on cytokine levels and nasal symptoms following nasal allergen challenge. J Allergy Clin Immunol. 128 (4), 800-807 (2011).
  26. Dhariwal, J., et al. Nasal Lipopolysaccharide Challenge and Cytokine Measurement Reflects Innate Mucosal Immune Responsiveness. PLoS One. 10 (9), e0135363 (2015).
  27. Folsgaard, N. V., et al. Neonatal cytokine profile in the airway mucosal lining fluid is skewed by maternal atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
  28. Folsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
  29. Wolsk, H. M., et al. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
  30. Thwaites, R. S., et al. Nasosorption as a Minimally Invasive Sampling Procedure: Mucosal Viral Load and Inflammation in Primary RSV Bronchiolitis. J Infect Dis. 215 (8), 1240-1244 (2017).
  31. Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
  32. Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), L1088-L1094 (2004).
  33. Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
  34. Yamazaki, K., Ogura, S., Ishizaka, A., Oh-hara, T., Nishimura, M. Bronchoscopic microsampling method for measuring drug concentration in epithelial lining fluid. Am J Respir Crit Care Med. 168 (11), 1304-1307 (2003).
  35. Kikuchi, J., Yamazaki, K., Kikuchi, E., Ishizaka, A., Nishimura, M. Pharmacokinetics of telithromycin using bronchoscopic microsampling after single and multiple oral doses. Pulm Pharmacol Ther. 20 (5), 549-555 (2007).
  36. Kikuchi, E., et al. Comparison of the pharmacodynamics of biapenem in bronchial epithelial lining fluid in healthy volunteers given half-hour and three-hour intravenous infusions. Antimicrob Agents Chemother. 53 (7), 2799-2803 (2009).
  37. Kodama, T., et al. A technological advance comparing epithelial lining fluid from different regions of the lung in smokers. Respir Med. 103 (1), 35-40 (2009).
  38. Sasabayashi, M., Yamazaki, Y., Tsushima, K., Hatayama, O., Okabe, T. Usefulness of bronchoscopic microsampling to detect the pathogenic bacteria of respiratory infection. Chest. 131 (2), 474-479 (2007).
  39. Kipnis, E., et al. Proteomic analysis of undiluted lung epithelial lining fluid. Chest. 134 (2), 338-345 (2008).
  40. Kanazawa, H., Kodama, T., Asai, K., Matsumura, S., Hirata, K. Increased levels of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine in epithelial lining fluid from peripheral airways in patients with chronic obstructive pulmonary disease: a pilot study. Clin Sci (Lond). 119 (3), 143-149 (2010).
  41. Sugasawa, Y., et al. The effect of one-lung ventilation upon pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 25 (2), 170-177 (2011).
  42. Sugasawa, Y., et al. Effects of sevoflurane and propofol on pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 26 (1), 62-69 (2012).
  43. Cohen, J., et al. Ciclesonide improves measures of small airway involvement in asthma. Eur Respir J. 31 (6), 1213-1220 (2008).
  44. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  45. de Silva, T. I., et al. Comparison of mucosal lining fluid sampling methods and influenza-specific IgA detection assays for use in human studies of influenza immunity. J Immunol Methods. , (2017).

Tags

NasosorptionNasal MucosaRespiratory MucosaPrecision SamplingSynthetic Absorptive MatrixSAMNasal CavityInferior TurbinateMucosal Lining FluidBronchosorptionBronchial Mucosa

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Thwaites, R. S., Jarvis, H. C., Singh, N., Jha, A., Pritchard, A., Fan, H., Tunstall, T., Nanan, J., Nadel, S., Kon, O. M., Openshaw, P. J., Hansel, T. T. Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples. J. Vis. Exp. (131), e56413, doi:10.3791/56413 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image