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Medicine

Absorption de liquides nasales et bronchiques : échantillonnage Precision de la muqueuse respiratoire humaine et traitement des échantillons en laboratoire

Published: January 21, 2018
doi:
10.3791/56413
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1National Heart and Lung Institute, Faculty of Medicine, Imperial College London,St Mary’s Hospital, 2St Mary’s Hospital,Imperial College Healthcare Trust

Summary

Ce manuscrit décrit l’utilisation de techniques d’absorption nasal et bronchique, spécifiquement à l’aide de matrices d’absorption synthétiques (SAM) pour goûter le liquide de la muqueuse (MLF) des voies respiratoires supérieures et inférieures. Ces méthodes offrent la meilleure standardisation et la tolérance que les techniques d’échantillonnage respiratoires existants.

Abstract

Les méthodes d’absorption nasale (NA) et d’absorption bronchique (BA) utilisent des matrices d’absorption synthétiques (SAM) pour absorber le liquide de la muqueuse (MLF) de l’appareil respiratoire humain. NA est une technique non invasive qui absorbe le fluide de le cornet inférieur et provoque une gêne minime. NA a donné des résultats reproductibles avec la possibilité de répéter fréquemment l’échantillonnage des voies aériennes supérieures.

En comparaison, les modes de prélèvement d’échantillons de la muqueuse respiratoire, tels que l’aspiration nasopharyngée (NPA) et le frottis conventionnel, sont plus invasifs et peuvent entraîner une plus grande variabilité de données. Autres méthodes ont des limites, par exemple, biopsies et procédures bronchiques sont envahissantes, expectorations contient de nombreux morts et mourir les cellules et nécessite de liquéfaction, condensat d’air expiré (EBC) contient de l’eau et la salive et échantillons de lavage sont dilués et variable.

BA peut être effectué par le canal d’un bronchoscope en clinique. L’échantillonnage est bien toléré et peut être réalisée à plusieurs endroits dans les voies respiratoires. BA se traduit par des échantillons MLF étant moins diluées que les échantillons (BAL) de lavage broncho-alvéolaire.

Cet article explique les techniques de NA et de BA, ainsi que le traitement en laboratoire des échantillons qui en résulte, qui peuvent être adaptés pour le biomarqueur aval souhaité étant mesuré. Ces techniques d’absorption sont des alternatives utiles aux techniques classiques d’échantillonnage utilisés dans la recherche clinique en pneumologie.

Introduction

La plupart des maladies respiratoires provoquent une réaction inflammatoire, et il y a un besoin urgent pour l’échantillonnage de la surface de la muqueuse respiratoire dans la bronchopneumopathie chronique obstructive, pulmonaire, la tuberculose, la rhinite allergique, asthme, infections virales et fongiques fibrose et poumon cancer 1. Aspiration nasopharyngée (NPA), lavage nasal et lavage broncho-alvéolaire (LBA) sont des techniques courantes pour prélever les voies respiratoires supérieures et inférieures. Toutefois, ces techniques présentent des problèmes considérables, y compris la mauvaise tolérance, dilution des médiateurs de l’inflammation et l’incapacité de répéter fréquemment d’échantillonnage2. Une solution de rechange à l’échantillonnage de l’APN est l’utilisation d’écouvillons, soit en nylon floqué, coton, ou rayonne3,4, mais elles aussi ont des limites, parce qu’ils l’inconfort et les dommages à l’épithélium nasal et dans une liaison irréversible de cas de 5de médiateurs inflammatoires. Ces techniques ne peuvent généralement être répétés en série plus d’une heure, et des techniques alternatives peuvent être plus efficaces pour la détection de faible abondance cytokines et chimiokines5,6. De plus, la variabilité de l’utilisateur associée à ces techniques peut générer des incohérences dans les données, ce qui entraîne l’obligation de grandes cohortes de patients.

Alternativement, les techniques d’absorption à l’aide d’éponges naturelles et synthétiques ont été utilisés pour recueillir des fonds multilatéral de muqueuses. Éponges ophtalmiques composé de cellulose normale (p. ex., Weck-cel) ont servi d’échantillon salive, col de l’utérus et les sécrétions vaginales,7. En outre, les éponges synthétiques fabriqués à partir d’alcool polyvinylique (PVA) et acétate de polyvinyle hydroxylé (HPVA) ont été utilisés8. Sept différents matériaux absorbants ont été comparées pour prélèvement d’échantillons de salive avant de mesurer les anticorps9, tandis que le polyuréthane mini-éponges ont été utilisés pour recueillir les larmes humaines10.

Papier filtre composé de cellulose normale de la plante de coton a été largement utilisé pour absorber les sécrétions nasales depuis le livre pionnier de Alam et ses collègues en 199211,12,13,14, 15,16,17. Produits à partir des cartes de filtre (par exemple Shandon) disques de papier filtre et ont été utilisés pour mesurer les histamines et cytokines après avoir contrôlé les défis allergène nasale et allergènes naturels exposition18,19 ,20,21. Toutefois, les différents lots de papier filtre varient dans leur degré de liaison aux protéines et certains ne parviennent pas à libérer des cytokines. Méthodes à l’aide d’une matrice d’absorption synthétique (MCS) ont donc été développés2,22,23. SAMs sont maintenant généralement utilisées pour obtenir MLF nasale par NA. Ces matériaux absorbants est agréables à utiliser et peut obtenir MLF même du nez enflammées à intervalles fréquents sur de longues périodes de temps.

L’absorption nasale est une forme de précision d’échantillonnage de muqueuse à l’aide de SAM pour l’échantillonnage du MLF dans les voies aériennes supérieures. Dispositifs de NA sont fabriqués comme portant un marquage CE des dispositifs médicaux à partir de matériaux de qualité médicale à l’aide de salles blanches et sont libres de poussière et les allergènes. L’échantillonneur de NA se compose d’une poignée et SAM dans un cryotube stérile. Le SAM est constitué de polymères, généralement des fibres, mais il est également disponible en tant que mousse, et ils sont sélectionnés pour être doux et absorbant, avec mèche rapide pour le prélèvement de. SAMs ont la liaison aux protéines minimale pour permettre l’élution efficace des sécrétions absorbées. NA est une technique très douce et non invasive pouvant être exécutées sur les donateurs de tous les âges. En outre, l’échantillonnage serial, même toutes les quelques minutes, est possible. NA a été validée contre existants des voies aériennes supérieures d’échantillonnage techniques5 et répétitive échantillonnage a permis de générer des données cinétiques suite à contestation de la voie aérienne avec l’allergène23,24,25, endotoxine bactérienne26 et virale de type TLR agonistes (JAI, a. et al., manuscrit en préparation). NA a également été utilisé chez le nourrisson pour étudier l’histoire naturelle de l’atopie27,28,29 et30de la bronchiolite virale.

Microprélèvement bronchoscopique (BMS) est une procédure de collecte de fonds multilatéral dans les voies respiratoires inférieures qui a été développé par Olympus31,32,33. Malheureusement, ce système BMS est seulement autorisé au Japon. Deux systèmes BMS d’alimentation Olympus : une avec un polyester hydroxylé fibreux (FHPE) sonde34,35,36,37, et une avec un coton sonde33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. un obstacle majeur a été que la sonde BMS utilisée chez les patients souffrant d’asthme causé contact muqueux hémorragie, avec la moitié de tous les échantillons contaminés par du sang. Les auteurs ont conclu qu’il n’était pas possible à échantillon MLF utilisant ce système BMS de périphériques airways dans l’asthme patients43.

Comme alternative, nous avons développé de BA à l’aide d’une SAM douce qui peut être effectué au cours d’une enquête bronchoscopique des voies respiratoires inférieures, notamment suite à l’infection expérimentale de sujets asthmatiques avec rhinovirus6. Le dispositif de la BA se compose de : un cathéter externe creux, une pièce à main qui, lors de l’activation, expulse le SAM et un fil de guidage en plastique central qui possède le SAM à son extrémité. En ce qui concerne les NA, kits de BA sont fabriqués avec des matériaux de qualité médicale à l’aide de salles blanches et sont libres de poussière et les allergènes. En outre, dispositifs de marque et sont sont fournis irradiation gamma. La bande de SAM est doux, absorbant et a mèche rapide pour prélèvement d’échantillons. Il a également la liaison aux protéines minimale pour permettre l’élution efficace des sécrétions absorbées. L’appareil peut s’adapter par le canal d’un bronchoscope et peut être utilisé pour rapidement et avec précision l’échantillon MLF à certains sites d’intérêt dans les voies respiratoires. Contrairement au BAL ou BMS, BA n’entraîne pas contacter saignement ou après la procédure supplémentaire inconfort pour le patient.

Une attention particulière devrait être portée au traitement des échantillons de NA et de BA. Les échantillons peuvent être directement congelés et transformés en lots ou peuvent être traitées immédiatement. Le type de traitement peut être adapté vers certaines applications en aval, y compris les immunoessais pour les cytokines, chimiokines et immunoglobulines ou elutions des virus, bactéries, et la cellule hôte associés RNA. Nous présentons la collection clinique et le laboratoire des techniques de traitement associés à NA et BA comme un guide pour les cliniciens-chercheurs.

Protocol

Les techniques utilisées dans le protocole suivant ont été approuvés par le West London Research Ethics Committee (numéro de référence 15/lO/0444). 1. nasale Absorption (NA) Préparation avant l’échantillonnage NA Lorsqu’on effectue des NA, tout d’abord se laver les mains et mettez des gants, de préférence devant le patient. Inspecter la cavité nasale à l’aide d’une lampe frontale et ont les cliniciens utilisent leur pouce non dominante pour rétracter le nez du patient afin de visualiser la cavité nasale.Remarque : Un spéculum nasal n’est pas généralement nécessaire. Visualiser la cavité nasale et inférieure cornet avant l’échantillonnage.Remarque : Les narines (narines) ne sont pas ronds en coupe transversale et ils vont tout droit vers l’arrière. Généralement, le cornet inférieure peut être vu comme un renflement ou une indentation sur la paroi latérale de la narine, avec la cloison nasale formant le mur lisse, plat médial. Nous voulons échantillon de cet inférieur cornets, puisque l’épithélium sous-jacent est un épithélium cilié simple des voies respiratoires44. Échantillonnage de NA Lors de l’échantillonnage, passez le SAM NA doucement vers le haut de la lumière de la narine, orienter, qu’il soit à plat contre le cornet inférieur. Demandez les donateurs d’utiliser l’index pour appuyer sur le SAM sur la muqueuse nasale. NA peut provoquer un léger chatouillement, avec larmoiements possible, comme le Fonds multilatéral est absorbé.Remarque : Chez les adultes, nous réalisons généralement NA pendant 60 s. Après absorption du MLF, retirez l’appareil de NA de la narine et replacé dans le tube d’origine. Traiter les échantillons immédiatement dans le laboratoire ou congelez-les, tel que décrit plus loin dans le présent protocole.Remarque : NA est étudiée dans une variété de modèles défi muqueuse nasale, ainsi que dans les maladies des voies respiratoires différents. Toutefois, la validation contre les autres méthodes d’échantillonnage respiratoire doit être exécutée pour chaque population de l’étude et le patient. 2. bronchique Absorption (BA) Préparation avant l’échantillonnage BARemarque : BA est effectuée par personnel spécialisé dans une bronchoscopie. Avant de placer l’appareil de BA vers le bas de la sonde, vérifier que le SAM est d’extrusion et de retrait dans le cathéter. Avant d’effectuer le BA sur un patient, procéder à un simulacre BA sur un simulateur de bronchoscopie. Échantillonnage de BA Passez le bronchoscope vers le bas de la trachée et des bronches principales droite au niveau de bronche intermedius, proximale par rapport à la division dans le lobe inférieur droit et le juste milieu.Remarque : Nous généralement des échantillons de bronche intermedius, bien que d’autres sites dans les voies respiratoires peuvent être dégustés. Lors de l’observation du cathéter et SAM, on ne peut pas voir la pointe bronchoscope. Nous observons les simples étapes suivantes pour BA, une fois que le bronchoscope a atteint le site d’échantillonnage souhaitée. CATHÉTER vers le bas : Insérer le cathéter de BA dans le canal exploité du bronchoscope jusqu’à ce que la pointe blanche est visible dans les voies respiratoires, jusqu’à un maximum de 1 cm distal par rapport à la fin du bronchoscope. Tenir l’extrémité bronchoscope et le cathéter dans le centre de la lumière des voies aériennes. Prendre soin de minimiser le contact entre l’extrémité du cathéter et de la muqueuse bronchique pour réduire les risques d’abrasion de la muqueuse. SAM OUT : Appuyer sur la poignée de l’appareil de BA, afin que le SAM est extrudé dans la lumière de la voie aérienne lobe droit moyen ou inférieur droit. Sous vision directe, plier la pointe du bronchoscope afin d’assurer que le SAM est en contact avec le Fonds multilatéral sur la paroi des voies respiratoires. Laisser le SAM dans les voies respiratoires, à plat sur la paroi muqueuse pendant 30 s. SAM IN : Feuilletez le bronchoscope afin d’assurer que la sonde humide de SAM est droit et pas plié sur l’extrémité du cathéter. Si nécessaire, l’extrémité du cathéter et bronchoscope peut être réintroduite pour redresser le SAM. Sous vision directe, rétracter le SAM droit doucement dans le cathéter.Remarque : Si il est difficile de se rétracter le SAM dans le cathéter, retirer l’ensemble du dispositif avec SAM expulsé hors de la voie aérienne. CATHÉTER vers le haut : Retirer le cathéter entière du canal d’exploitation du bronchoscope. COUPÉ SAM : SAM est coupée avec des ciseaux stériles et est ensuite placée dans un cryotube sur la glace. Ces échantillons peuvent être traités avec des méthodes différentes, tel que décrit plus loin dans le présent protocole. 3. traitement des échantillons de BA et de NA Remarque : Il existe de nombreuses options pour le traitement en laboratoire d’échantillons résultant de NA et de BA. Ces protocoles visent à conserver les échantillons pour une utilisation ultérieure et pour éluer l’échantillon MLF de SAM. Options pour manipulation immédiate des échantillons de NA et BA Option 1 : Stocker le SAM humide sur la glace pendant quelques heures avant la poursuite de la procédure. Option 2 : Immédiatement deep freeze NA SAMs dans la collection tube. De même, geler SAMs BA en fioles cryogéniques après l’enlèvement, avec des ciseaux, de l’équipement d’échantillonnage. Option 3 : Placez le SAM détaché dans la mémoire tampon d’élution (300 µL) avant de traiter directement ou profond gel. Options du tampon d’élution pour échantillons de NA et de BARemarque : Le choix du tampon d’élution de dépend de ce qui se passe à analyser dans l’échantillon MLF et nous proposons quatre grandes variantes : Utiliser un tampon préparés à l’avance, adapté pour les procédures de test immunologique. Ces tampons doivent contenir une petite quantité de détergent (0,05 %) ainsi que des protéines, par exemple, l’albumine sérique bovine (BSA) à 1 %. Alternativement, utilisez un tampon contenant une plus grande quantité de détergent, afin que la lyse cellulaire se produit.Remarque : Nous utilisons des tampons contenant Triton-X ou NP40 concentration de 1 %. Mémoires tampons de lysis de cellules permettent des cytokines intracellulaires et extracellulaires à être élue de la SAM et généralement lieu à des niveaux plus élevés de cytokines et chimiokines. Ces tampons doivent également contenir des protéines et sont composées avec BSA à 1 %. Pour les mesures de RNA, comme la PCR quantitative de l’ARN viral ou mesure hôte ARN, ajouter RNA extraction tampon directement à la SAM humide.Remarque : Tampons de chaotropes RNA extraction contiennent guanidinium qui dénature les protéines. Une alternative consiste à ajouter le tampon d’extraction RNA au fluide MLF éluée contenus dans le tampon de lyse dosage immunologique ou cellule. Utilisation des solvants organiques comme l’acide trifluoroacétique, pour l’extraction des lipides et des métabolites, pour évaluation par spectrométrie de masse.Remarque : Détails de tous ces réactifs sont inclus dans la section matériel. Technique d’élution Pour toutes les techniques d’élution ci-dessus, insérez le SAM dans un tube à centrifuger-micro 2 mL, ainsi que le tampon d’extraction souhaité. Vortex mélanger l’échantillon pendant 30 s pour laver le SAM de fluides faiblement attachées et biomolécules. Pour assurer le recouvrement de l’ensemble de l’échantillon, effectuer l’élution centrifuge en ajoutant le SAM humide à une filtre mini colonne qui s’insère dans le même tube 2 mL de micro-centrifugeuse sert à se laver.Remarque : Deux types de mini-colonne filtre peuvent être utilisés. Le premier contient uniquement une maille en plastique, qui tient le SAM en place, permettant l’élution complète des fluides. Alternativement, si vous travaillez avec des matières infectieuses, utiliser des filtres de spin avec une porosité de 0,22 µm. Ces filtres seront stériliser des échantillons et conviennent aux échantillons avec suspicion d’infection mycobactérienne. Toutefois, ces filtres doivent être préalablement incubées avec tampon, afin de minimiser la liaison des médiateurs au filtre par les interactions non spécifiques. Forceps stérilisé permet de transférer le SAM humide pour le filtre de l’essorage. Changer la pince entre les échantillons afin d’éviter la contamination. Centrifuger les échantillons pendant 20 min à 16 000 x g dans une centrifugeuse mini refroidissement à 4 ° C. Protocole de l’exemple de Sommaire En laboratoire, étiquette 2 mL tubes micro-centrifuge pour prélèvement d’échantillons et d’ajouter le volume souhaité de la mémoire tampon d’élution (typiquement 300 µL pour NA ; 100 µL pour BA). Joint couvercle, puis posez sur la glace. Après échantillonnage (immédiatement ou dans le laboratoire), le SAM est retiré de la poignée avec une pincette et placées dans le tampon contenant le tube de prélèvement (produit à l’étape précédente). Assurez-vous que le bouchon du tube microcentrifuge est bien fermée et transférer les échantillons, sur la glace, au laboratoire pour un traitement ultérieur. Retirer les tubes contenant un tampon SAM et élution de leur gamme de conteneur et vortex de transfert pendant 30 s. À l’aide d’une pince stérile, enlever SAM et placer dans une colonne (avec ou sans filtre en acétate de cellulose 0,22 µm). Recueillir la mémoire tampon d’élution depuis le tube de prélèvement et de conserver. Placer la colonne, avec SAM, dans le tube de prélèvement original (ou une nouvelle si stérile filtrage échantillons) et ajouter le tampon collection pour faire tourner la colonne. De cette manière, le liquide de lavage traversera la colonne dans le tube de prélèvement, aidant à éluer l’échantillon de la SAM. Centrifuger les échantillons avec couvercles étanches (16 000 x g, 20 min, 4 ° C). Enlever les échantillons de la centrifugeuse et placer dans un rack. Ouvrez le couvercle scellé des tubes et supprimer la colonne contenant le SAM. Disposer de colonne SAM et essorage dans un conteneur à déchets approprié. Soigneusement les tubes aliquote l’éluat contenue dans le tube en étiquetés cryogénique. Enregistrer le volume total d’éluat et le volume de chaque aliquote. Transférer les tubes cryogéniques fermés dans un congélateur à-80 ° C et conserver debout jusqu’à l’utilisation.

Representative Results

NA a été utilisé dans un certain nombre d’études permettant facilement et non invasive de mesurer l’inflammation des muqueuses. Après l’administration d’allergènes au nez, on peuvent observer des niveaux de prostaglandine-D2 (PGD2) à montent et descendent dans les minutes (Figure 1), en ligne avec la dégranulation des mastocytes (Thwaites et al., manuscrit en préparation). En outre, les médiateurs de l’inflammation de type II, telles que l’IL-5 (Figure 2, reproduit avec la permission du 24), peuvent être mesurés dans les heures qui suivent l’allergène nasale défi23,24. Dans les infections expérimentales d’asthmatiques allergiques et témoins sains, NA a été utilisé pour mesurer un panel de médiateurs, notamment l’interféron-gamma (IFN-γ), au cours des 7 jours (Figure 3, reproduit avec la permission de 6). En outre, dans l’infection naturelle virus respiratoire syncytial (RSV) des nourrissons, NA montré RSV pour être associée à des taux élevés de cytokines inflammatoires, telles que l’IFN-γ, par rapport aux non-VRS nourrissons atteints de bronchiolite et témoins sains ( Figure 4, réimprimé avec la permission de 30). Fait intéressant, cette discrimination entre RSV et non-VRS bronchiolite n’était pas significative dans les échantillons NPA apparié dans le temps (Figure 4). BA a également été utilisé au cours de l’infection expérimentale des asthmatiques allergiques rhinovirus. Au jour 4 de l’infection de rhinovirus, niveaux d’IFN-γ, CXCL11, IL-10 et IL-5 ont été élevés de base (Figure 5; A, B, C et D, respectivement). En outre, cette technique a montré des niveaux élevés d’IL-5 dans les voies aériennes inférieures des asthmatiques allergiques au cours de l’infection de rhinovirus, par rapport aux témoins sains (Figure 5) (Figure 5 reproduit avec la permission de 6). Ces résultats représentatifs sont extraits d’échantillons élués à l’aide du tampon d’essai contenant 0,05 % de Tween-20 et 1 % de BSA (voir Table des matières). Figure 1 : Génération rapide et la clairance de la prostaglandine-D2 suite allergène nasale challenge. Des niveaux de prostaglandine-D2 (PGD2) mesurée à partir d’éluats absorption nasale dans les échantillons séries suite allergène nasale challenge avec le pollen d’herbe Timothy (n = 5). Chaque ligne représente les données d’un individu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Mesure cinétique d’IL-5 suite contestation allergène nasale. Production d’IL-5 dans les échantillons de série absorption nasale suite à contestation allergène nasale. Trois Répétez allergène défi études ont été menées, avec les participants (n = 19) recevant le placebo (bleu), à faible dose (10 mg) par voie orale prednisone (orange), ou prednisone par voie orale de doses élevées (25 mg) (rouge) une heure avant l’administration d’allergènes. Dénotent des lignes moyenne géométrique et les barres d’erreur sont des intervalles de confiance de 95 % de tous les participants. (Figure reproduit avec la permission de Leaker et coll., immunologie des muqueuses, 2017). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Induction de l’interféron-γ pendant l’infection de rhinovirus. Au cours du défi d’infection des adultes sains (n = 11, bleu) et les asthmatiques allergiques (n = 28, rouge) avec le rhinovirus-16, prélèvement nasal d’absorption a été utilisé pour mesurer les niveaux de l’interféron-γ (IFN-γ). Données sont représentées comme parcelles A) crus spaghettis des individus et des niveaux B) médians avec des barres d’erreur qui dénote les gammes intervalle interquartiles. (Figure reproduit avec la permission de Hansel et al. 6). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Nasosorption discriminatoire à l’interféron-γ élevé associé à l’infection par le VRS des nourrissons. Absorption nasale et l’aspiration nasopharyngée (NPA) ont été utilisés pour mesurer les niveaux de l’interféron-γ chez les nouveau-nés avec bronchiolite associée à une infection de virus respiratoire syncytial (VRS) (rouge, n = 12), un pathogène respiratoire non-VRS (vert, n = 12) et en bonne santé contrôles (bleu, n = 9). Données ont été analysées à l’aide d’un test de Kruskall-Wallis avec Dunns correction pour les comparaisons multiples (***p< 0,001). Lignes désigne les valeurs médianes et barres d’erreur sont ranges intervalle interquartiles. (Figure modifiée avec la permission de m. Thwaites et al. 30). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Des médiateurs inflammatoires dans les échantillons d’absorption bronchique lors de l’infection de rhinovirus.Suite à une infection rhinovirus-16 des témoins sains (n = 10, bleu) et les volontaires asthmatiques allergiques (n = 23, rouge), absorption bronchique a été utilisée pour mesurer le niveau de A) IFN-γ, B) CXCL11, C) IL-10 et D) IL-5 au départ et le jour 4 de l’infection. Les données analysées par Wilcoxon signé rank test (échantillons appariés) et le test de Mann-Whitney (échantillons inégalées). Figure reproduit avec la permission de Hansel et al. 6 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les résultats de techniques d’échantillonnage existantes des voies respiratoires sont considérés comme très variable ; techniques d’échantillonnage alternatives sont nécessaires pour normaliser la recherche dans ce champ5. NA BA permis de prélèvement du Fonds multilatéral de manière non invasive et ont un potentiel excitant pour mesurer les réponses immunitaires chez airways sains et malades. Ces techniques offrent de nombreux avantages potentiels sur les techniques existantes, y compris une plus grande tolérance, vitesse d’échantillonnage, la capacité de répéter fréquemment d’échantillonnage, réduire la variabilité inter-utilisateur et a diminué la dilution des médiateurs immunitaires5 . La durée d’absorption et de la technique de traitement utilisée doit être optimisée pour chaque étude et rigoureusement maintenue entre les événements d’échantillonnage. En outre, dans le cas de BA, le site d’échantillonnage dans les voies respiratoires doit être soigneusement répliqué entre les individus.

NA et en particulier de BA, sont encore relativement nouvelles techniques pour la recherche clinique. Toutefois, les avantages de ces techniques ont conduit à leur utilisation dans de nombreuses études, y compris la validation minutieuse contre des techniques alternatives5. Ces appareils sont maintenant disponibles comme portant un marquage CE des dispositifs prêts à l’emploi répandu dans la recherche en pneumologie. Tandis que NA et BA entraîner beaucoup plus petits volumes d’échantillon que les techniques alternatives d’échantillonnage, des concentrations plus élevées obtenues peuvent entraîner une plus grande sensibilité des médiateurs immunitaires de faible abondance.

Selon les applications en aval souhaitées, NA et BA échantillons peuvent être congelés directement pour un traitement ultérieur, renforcer l’étude de faisabilité dans un environnement de recherche clinique. Le protocole pour la manipulation des échantillons peut être adapté pour répondre à des applications particulières en aval. Les techniques de traitement suggéré peuvent être utilisés pour la collecte des protéines ou des acides nucléiques ou des médiateurs immunitaires lipidiques, mais doivent être optimisés pour chaque étude. En particulier, MLF peut être éluée avec différents tampons. Tout d’abord, buffer immunoessai peut servir à mesurer la muqueuse cytokines, chimiokines et anticorps6,45. Tampons avec des niveaux plus élevés de détergent permet également de garantir la lyse cellulaire se produit, ce qui permet l’inclusion des cytokines intra-cellulaire. Extraction de l’ARN de chaotropes tampons doivent être utilisés pour la détermination de l’infection virale, virale charger, hébergent des ARNm et le microbiome. Alternativement, des solvants organiques peuvent être utilisés pour la lipidomique et spectrométrie de masse.

En conclusion, absorption directe du MLF de muqueuses est une technique passionnante avec utilisation potentielle dans les maladies muqueuses respiratoires, gastro-intestinales, urogénitales et autres. Toutefois, ces techniques d’absorption prometteur exigeront la validation précise d’échantillonnage et traitement technique pour les épreuves individuelles (biomarqueurs) dans chaque cadre de la maladie. En outre, ces techniques de précision roman muqueux d’échantillonnage exigeront la validation contre échantillons conventionnels, tels que du sang, le souffle et expectoration. Avec ces techniques, MLF peut servir à mesurer les anticorps, cytokines, chimiokines, prostanoïdes et microbes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financement : Ce travail a été financé par l’Institut National impériale pour Health Research (NIHR) Biomedical Research Centre (BRC), le NIHR santé Protection Research Unit (HPRU) dans les Infections respiratoires à l’Imperial College London en partenariat avec l’Angleterre de santé publique (PHE) et le Centre de recherche translationnelle NIHR impériale sécurité des patients. Les opinions exprimées sont celles des auteurs et pas nécessairement ceux du NHS, le NIHR, ministère de la santé ou santé publique de l’Angleterre.

Materials

Nasosorption (adult, 7mm width) Hunt Developments NSFL-FXI-11 Different sizes are available for different patient groups/ages.
Bronchosorption Hunt Developments BSFL-FXI-11 Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) Sigma Aldrich CLS9301-1000EA
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) Sigma Aldrich CLS8160-24EA For sterilisation of samples with infection risk.
Assay (elution) buffer Millipore AB-33k Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.
NP-40 Cell lysis buffer Life Technologies FNN0021 Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.
Buffer RLT (RNA extraction) Qiagen 79216 Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031-100ML-M For elution of samples to be used in HPLC applications
2.0ml micro-centrifuge tubes Costar 3213 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.
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References

  1. Hansel, T. T., Johnston, S. L., Openshaw, P. J. Microbes and mucosal immune responses in asthma. Lancet. 381 (9869), 861-873 (2013).
  2. Lu, F. X., Esch, R. E. Novel nasal secretion collection method for the analysis of allergen specific antibodies and inflammatory biomarkers. J Immunol Methods. 356 (1-2), 6-17 (2010).
  3. Esposito, S., et al. Collection by trained pediatricians or parents of mid-turbinate nasal flocked swabs for the detection of influenza viruses in childhood. Virol J. 7 (1), 85 (2010).
  4. Macfarlane, P., Denham, J., Assous, J., Hughes, C. RSV testing in bronchiolitis: which nasal sampling method is best?. Arch Dis Child. 90 (6), 634-635 (2005).
  5. Jochems, S. P., et al. Novel Analysis of Immune Cells from Nasal Microbiopsy Demonstrates Reliable, Reproducible Data for Immune Populations, and Superior Cytokine Detection Compared to Nasal Wash. PLoS One. 12 (1), e0169805 (2017).
  6. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma Increased Interferons (IFN-gamma and IFN-lambda) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. , (2017).
  7. Rohan, L. C., et al. Optimization of the weck-Cel collection method for quantitation of cytokines in mucosal secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (1), 45-48 (2000).
  8. Castle, P. E., et al. Comparison of ophthalmic sponges for measurements of immune markers from cervical secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (2), 399-405 (2004).
  9. Chang, C. K., Cohen, M. E., Bienek, D. R. Efficiency of oral fluid collection devices in extracting antibodies. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 231-235 (2009).
  10. Lopez-Cisternas, J., Castillo-Diaz, J., Traipe-Castro, L., Lopez-Solis, R. O. Use of polyurethane minisponges to collect human tear fluid. Cornea. 25 (3), 312-318 (2006).
  11. Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
  12. Sim, T. C., Grant, J. A., Hilsmeier, K. A., Fukuda, Y., Alam, R. Proinflammatory cytokines in nasal secretions of allergic subjects after antigen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 149 (2 Pt 1), 339-344 (1994).
  13. Sim, T. C., Reece, L. M., Hilsmeier, K. A., Grant, J. A., Alam, R. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. Am J Respir Crit Care Med. 152 (3), 927-933 (1995).
  14. Weido, A. J., Reece, L. M., Alam, R., Cook, C. K., Sim, T. C. Intranasal fluticasone propionate inhibits recovery of chemokines and other cytokines in nasal secretions in allergen-induced rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol. 77 (5), 407-415 (1996).
  15. Linden, M., et al. Immediate effect of topical budesonide on allergen challenge-induced nasal mucosal fluid levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-5. Am J Respir Crit Care Med. 162 (5), 1705-1708 (2000).
  16. Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
  17. Riechelmann, H., Deutschle, T., Friemel, E., Gross, H. J., Bachem, M. Biological markers in nasal secretions. Eur Respir J. 21 (4), 600-605 (2003).
  18. Wagenmann, M., et al. Bilateral increases in histamine after unilateral nasal allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 155 (2), 426-431 (1997).
  19. Wagenmann, M., Schumacher, L., Bachert, C. The time course of the bilateral release of cytokines and mediators after unilateral nasal allergen challenge. Allergy. 60 (9), 1132-1138 (2005).
  20. Baumann, R., et al. The release of IL-31 and IL-13 after nasal allergen challenge and their relation to nasal symptoms. Clin Transl Allergy. 2 (1), 13 (2012).
  21. Baumann, R., et al. Nasal levels of soluble IL-33R ST2 and IL-16 in allergic rhinitis: inverse correlation trends with disease severity. Clin Exp Allergy. 43 (10), 1134-1143 (2013).
  22. Chawes, B. L., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
  23. Scadding, G. W., et al. Optimisation of grass pollen nasal allergen challenge for assessment of clinical and immunological outcomes. J Immunol Methods. 384 (1-2), 25-32 (2012).
  24. Leaker, B. R., et al. The nasal mucosal late allergic reaction to grass pollen involves type 2 inflammation (IL-5 and IL-13), the inflammasome (IL-1beta), and complement. Mucosal Immunol. 10 (2), 408-420 (2017).
  25. Nicholson, G. C., et al. The effects of an anti-IL-13 mAb on cytokine levels and nasal symptoms following nasal allergen challenge. J Allergy Clin Immunol. 128 (4), 800-807 (2011).
  26. Dhariwal, J., et al. Nasal Lipopolysaccharide Challenge and Cytokine Measurement Reflects Innate Mucosal Immune Responsiveness. PLoS One. 10 (9), e0135363 (2015).
  27. Folsgaard, N. V., et al. Neonatal cytokine profile in the airway mucosal lining fluid is skewed by maternal atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
  28. Folsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
  29. Wolsk, H. M., et al. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
  30. Thwaites, R. S., et al. Nasosorption as a Minimally Invasive Sampling Procedure: Mucosal Viral Load and Inflammation in Primary RSV Bronchiolitis. J Infect Dis. 215 (8), 1240-1244 (2017).
  31. Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
  32. Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), L1088-L1094 (2004).
  33. Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
  34. Yamazaki, K., Ogura, S., Ishizaka, A., Oh-hara, T., Nishimura, M. Bronchoscopic microsampling method for measuring drug concentration in epithelial lining fluid. Am J Respir Crit Care Med. 168 (11), 1304-1307 (2003).
  35. Kikuchi, J., Yamazaki, K., Kikuchi, E., Ishizaka, A., Nishimura, M. Pharmacokinetics of telithromycin using bronchoscopic microsampling after single and multiple oral doses. Pulm Pharmacol Ther. 20 (5), 549-555 (2007).
  36. Kikuchi, E., et al. Comparison of the pharmacodynamics of biapenem in bronchial epithelial lining fluid in healthy volunteers given half-hour and three-hour intravenous infusions. Antimicrob Agents Chemother. 53 (7), 2799-2803 (2009).
  37. Kodama, T., et al. A technological advance comparing epithelial lining fluid from different regions of the lung in smokers. Respir Med. 103 (1), 35-40 (2009).
  38. Sasabayashi, M., Yamazaki, Y., Tsushima, K., Hatayama, O., Okabe, T. Usefulness of bronchoscopic microsampling to detect the pathogenic bacteria of respiratory infection. Chest. 131 (2), 474-479 (2007).
  39. Kipnis, E., et al. Proteomic analysis of undiluted lung epithelial lining fluid. Chest. 134 (2), 338-345 (2008).
  40. Kanazawa, H., Kodama, T., Asai, K., Matsumura, S., Hirata, K. Increased levels of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine in epithelial lining fluid from peripheral airways in patients with chronic obstructive pulmonary disease: a pilot study. Clin Sci (Lond). 119 (3), 143-149 (2010).
  41. Sugasawa, Y., et al. The effect of one-lung ventilation upon pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 25 (2), 170-177 (2011).
  42. Sugasawa, Y., et al. Effects of sevoflurane and propofol on pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 26 (1), 62-69 (2012).
  43. Cohen, J., et al. Ciclesonide improves measures of small airway involvement in asthma. Eur Respir J. 31 (6), 1213-1220 (2008).
  44. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  45. de Silva, T. I., et al. Comparison of mucosal lining fluid sampling methods and influenza-specific IgA detection assays for use in human studies of influenza immunity. J Immunol Methods. , (2017).

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Thwaites, R. S., Jarvis, H. C., Singh, N., Jha, A., Pritchard, A., Fan, H., Tunstall, T., Nanan, J., Nadel, S., Kon, O. M., Openshaw, P. J., Hansel, T. T. Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples. J. Vis. Exp. (131), e56413, doi:10.3791/56413 (2018).
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