JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

ספיגת נוזלים באף ובסימפונות: דגימה מדויקת של רירית מערכת הנשימה האנושית, מעבדה בעיבוד של דגימות

Published: January 21, 2018
doi:
10.3791/56413
, , , , , , , , , , ,
1National Heart and Lung Institute, Faculty of Medicine, Imperial College London,St Mary’s Hospital, 2St Mary’s Hospital,Imperial College Healthcare Trust

Summary

כתב יד זה מתאר את השימוש בטכניקות קליטה באף ובסימפונות, ובמיוחד באמצעות מטריצות ספיגת ידע סינתטי (SAM) לדגימת הנוזל שורות mucosal (MLF) של דרכי הנשימה העליונים והתחתונים. שיטות אלה מספקים יותר סטנדרטיזציה והסבילות מאשר קיימות טכניקות הנשימה הדגימה.

Abstract

השיטות של קליטה באף (NA) וספיגה הסימפונות (BA) להשתמש מטריצות ספיגת ידע סינתטי (SAM) כדי לספוג את הנוזלים שורות mucosal (MLF) במערכת הנשימה האנושית. נה היא שיטה לא פולשנית אשר סופג נוזלים turbinate נחותים, גורמת אי נוחות מינימלית. נה הניב תוצאות לשחזור עם היכולת לחזור לעתים קרובות על דגימה של דרכי הנשימה העליונות.

לשם השוואה, שיטות אלטרנטיביות של דגימת רירית מערכת הנשימה, כגון שאיפה האף והלוע (NPA) מקימה קונבנציונאלי, פולשניים יותר, עלולה לגרום השתנות הנתונים גדול. שיטות אחרות יש מגבלות למשל, ביופסיות ונהלים הסמפונות הינם פולשניים, sputum מכיל הרבה מתו ולא למות תאים, דורש ניזול, והבל הפה מעובה (EBC) מכיל מים ורוק, שטיפה הדגימות שתדללו ו משתנה.

BA יכולה להתבצע דרך ערוץ עבודה של ברונכוסקופ. במרפאה. הדגימה היא נסבלת היטב, יכול להתבצע באתרים מרובים ב- דרכי הנשימה. BA תוצאות דגימות MLF להיות שתדללו פחות מאשר bronchoalveolar שטיפה (BAL) דגימות.

מאמר זה מדגים את הטכניקות של נה ו BA, כמו גם העיבוד מעבדה של הדגימות וכתוצאה מכך, אשר ניתן להתאים את סמן במורד הזרם הרצוי הנמדדים. טכניקות אלה הקליטה אלטרנטיבות שימושי של טכניקות דגימה קונבנציונאלי השתמשו במחקר קליני בדרכי הנשימה.

Introduction

רוב מחלות נשימה לגרום לתגובה דלקתית, ויש צורך דחוף דגימה מן השטח הרירית בדרכי הנשימה, קדחת השחת, זיהומים נגיפיים ופטריות, שחפת, אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, ריאות פיברוזיס של הריאות סרטן 1. האף והלוע וביופסיה (NPA), שטיפה של חלל האף bronchoalveolar שטיפה (BAL) הן טכניקות נפוצות עבור הדגימה את דרכי הנשימה העליונים והתחתונים. עם זאת, שיטות אלה להציג בעיות ניכר כולל סבילות המסכן, דילול של מתווכים דלקתיים, וחוסר היכולת לחזור לעתים קרובות דגימה2. חלופה אחת במתכונתם הדגימה הוא השימוש של דגימות, או התקבצו ניילון, כותנה, או משי מלאכותי3,4, אבל אלה גם יש מגבלות, בגלל שהיא גורמת אי נוחות ונזק האפיתל האף, ועל כמה מקרים איגוד בלתי הפיך של מתווכים דלקתיים5. שיטות אלה לא יכולה בדרך כלל להיות חוזרות ונשנות באופן סדרתי יותר משעה, טכניקות חלופיות עשויה להיות יעילה יותר לגילוי של שפע נמוך ציטוקינים ו נוגדנים5,6. בנוסף, מידת ההשתנות המשתמש המשויך טכניקות אלה עשויה ליצור חוסר עקביות בנתונים, וכתוצאה מכך הדרישה של גדודים המטופל גדול יותר.

לחלופין, באמצעות ספוגים טבעיים וסינתטיים טכניקות קליטה שימשו כדי לאסוף MLF משטחים הרירית. ספוגים אופטלמולוגיות המורכב תאית טבעיים (למשל, שיודע-cel) שימשו דגימת רוק, צוואר הרחם, והפרשות הנרתיק7. בנוסף, ספוגים סינתטי זני אלכוהול (PVA), דבק פלסטי hydroxylated (HPVA) היה מנוצל8. שבעה חומרים ספיגת ידע שונים מושווים עבור דגימה נוזלים דרך הפה לפני מדידת נוגדנים9, בעוד מיני פוליאוריתן-ספוגים שימשו כדי לאסוף דמעות אדם10.

נייר סינון המורכב תאית טבעיים מצמח הכותנה כבר בשימוש נרחב כדי לספוג את הפרשות האף מאז הנייר חלוצית עלאם ועמיתיו בשנת 199211,12,13,14, 15,16,17. נייר סינון דיסקים הופקו מ מסנן קלפים (למשל Shandon), היה להיות מנוצל כדי למדוד histamines ו ציטוקינים לאחר מבוקר. האתגרים אלרגן האף, עם אלרגן טבעי חשיפה18,19 20, ,21. עם זאת, קבוצות שונות של נייר סינון להשתנות ב מידת חלבון מחייב ולהיכשל קצת לשחרר ציטוקינים. שיטות שימוש במטריצה ספיגת ידע סינתטי (SAM) ולכן היה מפותח2,22,23. סאמס עכשיו משמשים בדרך כלל כדי לקבל MLF האף על ידי הערך לא ישים סופג חומרים אלה הינם נוחים כדי להשתמש, יכול לקבל MLF אפילו מן האף דלקתי במרווחים תכופים במשך פרקי זמן ארוכים.

קליטה באף היא צורה של דיוק הרירית דגימה באמצעות סאם הדוגמאות של MLF, דרכי הנשימה העליונות. נה מכשירים מיוצרים כמו המסומן CE מכשירים רפואיים מחומרים סיווג רפואי באמצעות חדרים נקיים וחופשיים של אבק, אלרגנים. הדוגם נה מורכבת של ידית וסאם cryotube סטרילי. סאם מורכב פולימרים, בדרך כלל סיבים, אבל זה זמין גם כמו קצף, אלה נבחרו כדי להיות רך ספיגת ידע, עם הפתילה מהירה לאיסוף הדגימה. סאמס יש חלבון מינימלי מחייב לאפשר את • תנאי יעיל של הפרשות נספג. נה היא טכניקה מאוד עדין, לא פולשנית, שניתן לבצע לתורמים בכל הגילאים. בנוסף, דגימה טורי, אפילו כל כמה דקות, אפשרי. נה אומתה נגד קיימות דרכי הנשימה העליונות דגימה טכניקות5 , דגימה חוזרות אפשרה הדור של נתונים קינטי. האתגר של דרכי הנשימה עם אלרגן23,24,25, אנדוטוקסין חיידקי26 ונגיפית מסוג TLR אגוניסטים (Jha, א. et al., כתב היד בהכנה). נה שימש גם אצל תינוקות כדי לחקור את ההיסטוריה הטבעית של אטופיה27,28,29 , נגיפי דלקת סימפונונות30.

Bronchoscopic microsampling (BMS) היא הליך עבור אוסף של MLF בנתיב האוויר התחתון אשר פותחה על ידי אולימפוס31,32,33. למרבה הצער, מערכת זו BMS מוענק רק ביפן. אולימפוס לספק שתי מערכות BMS: בדיקה אחת סיבי פוליאסטר hydroxylated (FHPE)34,35,36,37ולאחר בדיקה אחת עם כותנה33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. להיות אבן נגף הגדולות כבר כי החללית BMS להשתמש בחולים עם אסטמה גרמה קשר הרירית מדמם, עם חצי של כל הדגימות מזוהם עם דם. המחברים הסיקו כי לא היה ריאלי מדגם MLF באמצעות מערכת זו עב מ מ איירווייז היקפיים חולי אסטמה43.

כחלופה, פיתחנו BA באמצעות סאם רך יכול להתבצע במהלך חקירת bronchoscopic של דרכי הנשימה התחתונה, לרבות בעקבות זיהום ניסיוני של אסתמה נושאים עם ריינו-וירוס6. המכשיר הבא מורכב: קטטר חלול חיצוני של היד-עבודה על ההפעלה extrudes של סאם, חוט מרכזי מדריך פלסטיק שיש לו את סם על סופו. באשר NA, BA ערכות מיוצרים מחומרים סיווג רפואי באמצעות חדרים נקיים וחופשיים של אבק, אלרגנים. בנוסף, המכשירים הם CE המסומנים ומסופקים מוקרן-גמא. רצועת סאם היא רכה, ספיגת ידע, ויש הפתילה מהירה לאיסוף הדגימה. יש גם חלבון מינימלי מחייב לאפשר את • תנאי יעיל של הפרשות נספג. המכשיר יכול להתאים דרך ערוץ עבודה של ברונכוסקופ יכול לשמש כדי במהירות, במדויק לטעום MLF באתרים ספציפיים של עניין בתוך האוויר. בניגוד BAL או BMS, BA לא לגרום דימום במגע או אי נוחות החולה נוספים post-procedure.

יש לתת שיקול דעת זהיר העיבוד של דגימות נה ו- BA. דוגמאות ניתן ישירות קפוא, לעבד בקבוצות, או יכול להיות מעובד באופן מיידי. הסוג של עיבוד התפורות לכיוון יישומים מסוימים במורד הזרם, כולל immunoassays של ציטוקינים, נוגדנים, immunoglobulins או elutions של ויראלי, חיידקי, ומקושרת התא המארח RNA. אנו מציגים אוסף קליניים ומעבדתיים טכניקות עיבוד המשויך נה ו BA כמדריך עבור חוקרים קליניים.

Protocol

הטכניקות בשימוש בפרוטוקול הבא אושרו על ידי ועדת האתיקה במחקר לונדון (אסמכתא מספר 15/lO/0444) במערב. 1. האף הקליטה (NA) הכנה לפני נה דגימה בעת ביצוע נה, קודם לשטוף את הידיים ולהניח על כפפות, רצוי לפני המטופל. לבדוק את חלל האף באמצעות פנס הראש, ויש את המטפל להשתמש באגודל האחרת כדי לבטל את האף של המטופל כדי להמחיש את חלל האף.הערה: מפשק האף אינו נדרש בדרך כלל. דמיינו את חלל האף ואת נחות turbinate לפני דגימה.הערה: נארס (הנחיריים) אינם סיבוב של חתך הרוחב, הם הולכים ישר לאחור. באופן כללי, והנחות turbinate רואים בליטה או כניסה בקיר הלטראלי של הנחיר, עם מחיצת האף ויוצרים הקיר חלקה, שטוח המדיאלי. אנחנו רוצים מדגם זה נחות turbinate, מאז האפיתל הבסיסי הוא אפיתל ciliated פשוטה של מערכת הנשימה44. נה דגימה כאשר הדגימה, עוברים את סאם נה בעדינות את לומן של הנחיר, orientating שזה יהיה שווידאתם turbinate נחותים. תשאל את התורם לשימוש של האצבע המורה להקיש את סאם אל רירית האף. נה יכול לגרום קלה מדגדג, עם העין ניתן להשקות, כמו MLF זה נספג.הערה: אצל מבוגרים, אנו בדרך כלל מבצעים נה 60 s. לאחר הספיגה של MLF, להסיר את ההתקן נה הנחיר, להחזיר לתוך הצינור המקורי. לעבד את הדגימות מיד במעבדה או להקפיא אותם, כפי שיפורט בהמשך פרוטוקול זה.הערה: הוא נחקר נה במגוון דגמים אתגר הרירית באף, וגם במחלות דרכי הנשימה שונים. עם זאת, אימות כנגד אחרים בשיטות דגימה הנשימה צריכה להתבצע על כל אוכלוסיית המחקר, החולה. 2. אסטמה הקליטה (BA) הכנה לפני דגימה BAהערה: BA מתבצע על ידי אנשי סגל מומחים בסוויטה ברונכוסקופיה. לפני הצבת המכשיר הבא למטה הקטטר, בדוק כי סאם הבלטת ממד, נסיגה בחזרה לתוך הצנתר. לפני ביצוע BA על מטופל, התנהגות תואר מדומה על הסימולטור ברונכוסקופיה. BA דגימה עוברים את ברונכוסקופ. את קנה הנשימה ואת סמפון נכון הראשי לרמה של סמפון נטויה, רק proximal לליגה אל האונות הימנית התחתונה והאמצעית נכון.הערה: אנחנו בדרך כלל לדגום סמפון נטויה, למרות אתרים אחרים בתוך האוויר ניתן לטעום. בעת התבוננות קטטר של סאם, לא ניתן לראות את הטיפ ברונכוסקופ. נתבונן אל השלבים הבאים פשוטים עבור BA, ברגע ברונכוסקופ הגיעה האתר הדגימה הרצוי. קטטר למטה: הכנס את הצנתר BA דרך ערוץ הניתוחים של ברונכוסקופ. עד קצה לבן מוצגת רק ב- דרכי הנשימה, למקסימום של 1 ס מ דיסטלי בסוף ברונכוסקופ. שמור על קצה ברונכוסקופ, קטטר במרכז של לומן של דרכי הנשימה. להיות זהירים כדי למזער את הקשר בין קצה הצנתר רירית הסימפונות כדי להפחית את הסיכון של שחיקה על רירית. סאם החוצה: לדכא את נקודת האחיזה של המכשיר BA כך סאם הנמתח לתוך לומן של דרכי הנשימה האונה נכון אמצעית או הימנית התחתונה. תחת חזון ישירה, לכופף את קצה ברונכוסקופ. כדי להבטיח כי סאם עושה קשר MLF על הקיר את דרכי הנשימה. השאר את סם בתוך האוויר, שטוח לקיר הרירית ב-30 s. סאם ב: להסתכל דרך ברונכוסקופ. כדי להבטיח כי החללית סאם לח הוא ישר, לא כפוף חזרה מעל קצה הצנתר. אם נדרש, קצה הקטטר, ברונכוסקופ יכול להיגרם בחזרה כדי ליישר את סאם. תחת חזון ישירה, תמשוך את סאם ישר בעדינות בחזרה לתוך הצנתר.הערה: אם יש קושי בהתכנסות את סאם בחזרה לתוך הצנתר, למשוך את כל המתקן עם סאם extruded בחזרה דרכי הנשימה. קטטר למעלה: למשוך את הצנתר כל ערוץ הניתוחים של ברונכוסקופ.. לחתוך את סם: סם חתוך במספריים סטרילי, ואז מכניסים את cryotube על הקרח. דגימות אלה יכולים להיות מעובדים עם שיטות שונות, כפי שיפורט בהמשך פרוטוקול זה. 3. עיבוד של נה ודוגמאות BA הערה: ישנן אפשרויות רבות עבור עיבוד מעבדה של דגימות הנובע נה ו- BA. פרוטוקולים אלה מבקשים לאחסן דוגמאות לשימוש מאוחר יותר, וכדי elute הדגימה MLF סם. אפשרויות טיפול מיידי של דגימות נה ו BA אפשרות 1: אחסן את סאם לח על קרח לכמה שעות לפני עיבוד נוסף. אפשרות 2: מיד בקיפאון עמוק נה סאמס באוסף צינור. באופן דומה, להקפיא סאמס BA ב בקבוקונים קריוגני לאחר הסרת, עם מספריים, מהתקן הדגימה. אפשרות 3: מקם את סאם מנותקת במאגר • תנאי (300 µL) לפני עיבוד עמוק במישרין קפוא. אפשרויות של מאגר • תנאי לקבלת דוגמאות נה ו BAהערה: הבחירה של מאגר • תנאי תלוי מה הולך להיות מנותח במדגם MLF, אנו מציעים ארבעה חלופות עיקריות: השתמש מאגר assay מוכן מראש מתאים להליכי מתכלה. מאגרים כאלה צריך להכיל כמות קטנה של דטרגנט (0.05%) כמו גם חלבון, למשל, שור אלבומין (BSA) ב- 1%. לחלופין, השתמש מאגר המכיל כמות גדולה יותר של חומרי ניקוי, כך מתרחש פירוק התא.הערה: אנו משתמשים מאגרי המכיל טריטון-X או NP40-ריכוז 1%. תא פירוק מאגרי מאפשרים ציטוקינים תאיים והן חוץ-תאית להיות eluted של סאם, בדרך כלל לגרום רמות גבוהות יותר של ציטוקינים נוגדנים. מאגרים אלה צריך להכיל גם חלבון, מורכב עם BSA כדי 1%. מעבדתיים RNA, כגון PCR כמותי של RNA נגיפי או RNA מארח מדידה, להוסיף מאגר החילוץ RNA ישירות סאם לח.הערה: מאגרי החילוץ Chaotropic RNA מכילות guanidinium זה denatures חלבונים. אפשרות אחרת היא להוסיף מאגר החילוץ RNA הנוזל MLF eluted הכלולים במאגר פירוק חומרים או תא. השתמש ממיסים אורגניים, כגון חומצה trifluoroacetic, לחילוץ של ליפידים, מטבוליטים, להערכה על ידי ספקטרומטריית.הערה: הפרטים של כל ריאגנטים אלה כלולים באזור ‘ חומרים ‘. • תנאי טכניקה לכל אחת הטכניקות • תנאי לעיל, הכנס את סאם שפופרת צנטרפוגה-מיקרו 2 מ”ל, יחד עם המאגר החילוץ הרצוי. מערבולת לערבב את הדגימה ל 30 s כדי לשטוף את סאם של נוזלים באופן רופף המצורפת, מולקולות. כדי להבטיח התאוששות מלאה מדגם, לבצע • תנאי צנטריפוגלית על-ידי הוספת את סאם לח על ספין הסינון המצומצמת עמודה מוסיף לתוך הצינור מיקרו-צנטריפוגה 2 מ”ל זהה המשמש לרחצה.הערה: שני סוגים של ספין סינון העמודה מיני יכול לשמש. הראשון מכיל רק פלסטיק רשת שינוי, המחזיקה את סאם במקום, ומאפשר מלאה • תנאי של נוזלים. לחלופין, אם עובדים עם חומרים זיהומיות, השתמש במסננים ספין עם גודל הנקבוביות 0.22 מיקרומטר. מסננים אלה לעקר את דגימות ומתאימים עבור דגימות עם חשד זיהום Mycobacterial. אולם, מסננים אלה צריך להיות incubated מראש באמצעות מאגר, כדי למזער את הכריכה של מתווכים את המסנן על-ידי אינטראקציות לא ספציפית. להשתמש מלקחיים סטיריליים כדי להעביר את סאם לחות המסנן ספין. לשנות מלקחיים בין דוגמאות כדי למנוע זיהום. צנטריפוגה דגימות כעשרים דקות ב g x 16,000 ומפרידה מיני מקורר עד 4 ° C. דוגמה סיכום פרוטוקול במעבדה, תווית מיקרו-צנטריפוגה צינורות לאוסף מדגם 2 מ”ל ולהוסיף האחסון הרצוי של מאגר • תנאי (בדרך כלל 300 µL עבור נה; µL 100 עבור תואר ראשון). לסגור את המכסה ומניחים על קרח. בעקבות דגימה (מיד או במעבדה) את סאם מוסר מהידית באמצעות מלקחיים, להציב לתוך מאגר המכיל אוסף שפופרת (הופק בשלב הקודם). ודא הכובע של הצינור microcentrifuge סגורה באופן מאובטח ולהעביר את הדגימות, על קרח, למעבדה לשם עיבוד נוסף. להסיר את צינורות המכיל מאגר • תנאי וסאם מ לערבב מכולה, מערבולת שלהם העברה ל 30 s. בעזרת מלקחיים סטרילי, להסיר את סאם ולמקם לעמודה ספין (עם או בלי 0.22 מסנן אצטט תאית מיקרומטר). לאסוף את המאגר • תנאי מהצינור אוסף ולשמר. במקום העמודה ספין, עם סאם, בצינור האוסף המקורי (או אחד חדש אם סטרילי-סינון דגימות) ולהוסיף מאגר אוסף לסובב עמודה. באופן זה, נוזל שטיפת יעברו העמודה ספין בחזרה לתוך הצינורית אוסף, ובכך elute את הדגימה סם. Centrifuge את הדגימות בשלמותם אטום (16,000 x g, 20 דקות, 4 ° C). הסר את הדגימות לצנטריפוגה ומניחים בארון תקשורת. פתח את מכסה אטום של הצינורות, הסר את העמודה ספין המכיל את סם. תשליך סם ו ספין בעמודה פח אשפה המתאים. בזהירות aliquot eluate בתוך הצינור לתוך מתויג קריוגני צינורות. להקליט את הנפח הכולל של eluate ואת אמצעי האחסון בכל aliquot. העברת הצינורות קריוגני אטום מקפיא-80 ° C ולאחסן זקוף עד השימוש.

Representative Results

נה יש כבר מנוצל מספר מחקרים כדי בקלות ומדידת לא פולשני דלקת הרירית. בעקבות ניהול של אלרגן האף, רמות פרוסטגלנדין-D2 (PGD2) יכול להיות שנצפו על עלייתה ונפילתה בתוך דקות (איור 1), בקו אחד עם degranulation תא פיטום (Thwaites et al.., כתב היד בהכנה). בנוסף, ניתן למדוד מתווכים של דלקת מסוג II, כגון IL-5 (איור 2, הודפס מחדש באישור מ 24), השעות בעקבות האף אלרגן אתגר23,24. זיהום ניסיוני של חולי אסטמה אלרגית ופקדים בריא, נה שימשה כדי למדוד את פאנל של מגשרים, כולל אינטרפרון-גמא (IFN-γ), במשך 7 ימים (איור 3, הודפס מחדש באישור מ- 6). בנוסף, בזיהום בנגיף syncytial הנשימה הטבעי (RSV) של תינוקות, נה הפגינו RSV להיות מזוהה עם רמות גבוהות של ציטוקינים דלקתיים, כגון IFN-γ, יחסית ללא-RSV תינוקות עם דלקת סימפונונות ופקדים בריא ( איור 4, הודפס מחדש באישור מ- 30). מעניין, אפליה בין RSV הלא-RSV bronchiolitis לא היה משמעותי הדגימות במתכונתם מתאימים-זמן (איור 4). BA שימש גם במהלך זיהום ניסיוני של אסטמה אלרגית עם ריינו-וירוס. באותו יום 4 של ריינו-וירוס זיהום, רמות של IFN-γ, CXCL11, IL-10 ו- IL-5 היו גבוהות מקו (איור 5; A, B, C ו- D, בהתאמה). בנוסף, טכניקה זו הראו רמות גבוהות של IL-5 בנתיב האוויר התחתון של חולי אסטמה אלרגית במהלך זיהום ריינו-וירוס, יחסית בריאים פקדים (איור 5D) (איור 5 הודפס מחדש באישור מ- 6). תוצאות נציג אלו נוצרו מדגימות eluted שימוש assay מאגר המכיל BSA Tween-20 ו 1% 0.05% (ראה טבלה של חומרים). איור 1 : דור מהירה ואישור של פרוסטגלנדין-D2 בעקבות האף אלרגן אתגר. למדוד רמות של פרוסטגלנדין-D2 (PGD2) של קליטה באף eluates בדגימות טורי בעקבות האף אלרגן אתגר עם אבקה דשא טימותי (n = 5). כל שורה מייצגת נתונים מאדם אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : מדידה קינטי של IL-5 בעקבות האף אלרגן אתגר. ייצור IL-5 בדגימות טורי קליטה באף בעקבות האף אלרגן אתגר. 3. חזור על אלרגן אתגר מחקרים נערכו, עם המשתתפים (n = 19) שקיבלו פלצבו (כחול), נמוך פרדניזון במינון (10 מ ג) דרך הפה (כתום), או פרדניזון במינון גבוה (25 מ ג) דרך הפה (אדום) שעה אחת לפני המינהל אלרגן. קווים מציינות הגיאומטרי, קווי שגיאה 95% מרווחי הביטחון של כל המשתתפים. (איור הודפס מחדש באישור של Leaker. et al., אימונולוגיה הרירית, 2017). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : אינדוקציה של אינטרפרון-γ במהלך ריינו-וירוס זיהום. במהלך האתגר זיהום של מבוגרים בריאים (n = 11, כחול), חולי אסטמה אלרגית (n = 28, אדום) עם ריינו-וירוס-16, הדגימה קליטה באף שימש כדי למדוד רמות של אינטרפרון-γ (IFN-γ). הנתונים מיוצגים כמו ספגטי א) raw חלקות רמות החציוני ב) ויחידים עם קווי השגיאה המציין טווח בין רבעוני. (איור מתפרסם באישור הנזל. et al. 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : Nasosorption מפלה מוגברות אינטרפרון-γ המשויך RSV הזיהום של תינוקות. הקליטה האף האף והלוע השאיפה (NPA) שימשו כדי למדוד רמות אינטרפרון-γ אצל תינוקות עם דלקת סימפונונות המשויך הווירוס syncytial הנשימה (RSV) זיהום (אדום, n = 12),. חיידק בדרכי הנשימה הלא-RSV (ירוק, n = 12), ובריא פקדים (כחול, n = 9). הנתונים נותחו באמצעות מבחן Kruskall-איי ווליס עם Dunns תיקון להשוואות מרובות (* * *p< 0.001). קווים מציין ערכים, קווי שגיאה נע בין רבעוני. (דמות שונה באישור Thwaites. et al. 30)- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5 : מתווכים דלקתיים בדגימות הקליטה הסמפונות במהלך ריינו-וירוס זיהום.בעקבות זיהום ריינו-וירוס-16 של פקדים בריא (n = 10, כחול) ומתנדבים אסתמה אלרגית (n = 23, אדום), הקליטה הסמפונות שימש כדי למדוד רמות של א) IFN-γ, ב) CXCL11, ג) IL-10 ו- D) IL-5 בנקודת ההתחלה, וביום 4 של זיהום. הנתונים נותחו על ידי Wilcoxon חתם על מבחן דרגה (דוגמאות בהתאמה), מבחן מאן-ויטני (תחרות דגימות). איור הודפס מחדש באישור הנזל. et al. 6 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

תוצאות קיימות שיטות הדגימה דרכי הנשימה נחשבים משתנה מאוד; שיטות דגימה חלופית יש צורך לתקנן מחקר בתוך השדה הזה5. נה ו BA היתר דגימה של MLF בצורה לא פולשנית, ויש פוטנציאל מרגש למדוד את תגובות מערכת החיסון דרכי הנשימה בריאים וחולים. טכניקות אלה מציעים יתרונות פוטנציאליים רבים טכניקות הקיימים, כולל וסבילות רבה יותר, מהירות הדיגום, היכולת לחזור לעתים קרובות על הדגימה, להוריד את הבין-המשתמש השתנות, וירידה דילול של מתווכים חיסוניים5 . משך הספיגה ואת טכניקת עיבוד בשימוש צריך להיות אופטימיזציה עבור כל מחקר ומתוחזק בקפדנות בין אירועים הדגימה. בנוסף, במקרה של BA, האתר של הדגימה בתוך האוויר בקפידה תשוכפל בין אנשים.

נה, במיוחד BA, הם עדיין יחסית הרומן טכניקות למחקר קליני. עם זאת, היתרונות של טכניקות אלה גרמו בשימוש במחקרים רבים, כולל אימות זהיר נגד טכניקות חלופיות5. התקנים אלה זמינים כעת כפי המסומן CE התקנים מוכנים לשימוש נרחב במחקר בדרכי הנשימה. בעוד נה ו BA לגרום הרבה כרכים מדגם קטן יותר מאשר שיטות דגימה חלופית, ריכוז שהושג גבוה יכול לגרום רגישות עבור מתווכים חיסוניים שפע נמוכה.

בהתאם היישומים הרצויים במורד הזרם, דגימות נה ו BA שיכול להיות ישירות קפוא לצורך עיבוד מאוחר יותר, שיפור מחקר היתכנות בסביבת מחקר קליני. הפרוטוקול עבור הדגימה טיפול ניתן גם להתאים בהתאם מסוים יישומים במורד הזרם. טכניקות עיבוד המוצע יכול לשמש עבור אוסף של חלבון או חומצות גרעין או מתווכים חיסוניים השומנים, אך צריך להיות אופטימיזציה עבור כל המחקר. בפרט, MLF יכול להיות eluted עם מאגרים שונים. ראשית, מאגר חומרים ניתן למדוד ציטוקינים הרירית, נוגדנים, נוגדנים6,45. מאגרי עם רמות גבוהות יותר דטרגנט יכול לשמש גם כדי להבטיח פירוק התא מתרחשת, ומאפשר ההכללה של ציטוקינים התוך תאית. חילוץ Chaotropic RNA מאגרי ישמשו לצורך הקביעה של זיהום ויראלי, נגיפי לטעון, לארח mRNA, את microbiome. לחלופין, ניתן להשתמש בממסים אורגניים עבור lipidomics וספקטרומטר מסה.

לסיכום, קליטה ישירה של MLF של משטחים הרירית היא טכניקה מרגש עם פוטנציאל שימוש בדרכי הנשימה, העיכול, השתן, ושאר מחלות הרירית. לעומת זאת, שיטות אלה הקליטה מבטיח ידרוש אימות מדויק של דגימה ועיבוד הטכניקה של מבחני בודדים (סמנים ביולוגיים) בהגדרת כל מחלה. בנוסף, שיטות הדגימה הרירית דיוק הרומן אלה תדרוש אימות מול דגימות קונבנציונליים, כגון דם, נשימה, ברוק. עם שיטות אלה, MLF יכול לשמש כדי למדוד את החיידקים, ציטוקינים, נוגדנים, prostanoids ונוגדנים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מימון מן המכון הלאומי הקיסרי עבור לחקר הבריאות (NIHR) ביו מחקר מרכז (BRC), את NIHR בריאות הגנה מחקר יחידה (HPRU), זיהומים בדרכי הנשימה-אימפריאל קולג ‘-לונדון בשותפות עם אנגליה בריאות הציבור (PHE) ואל מרכז המחקר Translational בטיחות המטופל הקיסרית NIHR. הדעות הביע בבלוג הם אלה של המחברים ואלה לא בהכרח של בקופת חולים, את NIHR, מחלקת הבריאות או בריאות הציבור אנגליה.

Materials

Nasosorption (adult, 7mm width) Hunt Developments NSFL-FXI-11 Different sizes are available for different patient groups/ages.
Bronchosorption Hunt Developments BSFL-FXI-11 Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) Sigma Aldrich CLS9301-1000EA
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) Sigma Aldrich CLS8160-24EA For sterilisation of samples with infection risk.
Assay (elution) buffer Millipore AB-33k Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.
NP-40 Cell lysis buffer Life Technologies FNN0021 Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.
Buffer RLT (RNA extraction) Qiagen 79216 Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031-100ML-M For elution of samples to be used in HPLC applications
2.0ml micro-centrifuge tubes Costar 3213 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hansel, T. T., Johnston, S. L., Openshaw, P. J. Microbes and mucosal immune responses in asthma. Lancet. 381 (9869), 861-873 (2013).
  2. Lu, F. X., Esch, R. E. Novel nasal secretion collection method for the analysis of allergen specific antibodies and inflammatory biomarkers. J Immunol Methods. 356 (1-2), 6-17 (2010).
  3. Esposito, S., et al. Collection by trained pediatricians or parents of mid-turbinate nasal flocked swabs for the detection of influenza viruses in childhood. Virol J. 7 (1), 85 (2010).
  4. Macfarlane, P., Denham, J., Assous, J., Hughes, C. RSV testing in bronchiolitis: which nasal sampling method is best?. Arch Dis Child. 90 (6), 634-635 (2005).
  5. Jochems, S. P., et al. Novel Analysis of Immune Cells from Nasal Microbiopsy Demonstrates Reliable, Reproducible Data for Immune Populations, and Superior Cytokine Detection Compared to Nasal Wash. PLoS One. 12 (1), e0169805 (2017).
  6. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma Increased Interferons (IFN-gamma and IFN-lambda) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. , (2017).
  7. Rohan, L. C., et al. Optimization of the weck-Cel collection method for quantitation of cytokines in mucosal secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (1), 45-48 (2000).
  8. Castle, P. E., et al. Comparison of ophthalmic sponges for measurements of immune markers from cervical secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (2), 399-405 (2004).
  9. Chang, C. K., Cohen, M. E., Bienek, D. R. Efficiency of oral fluid collection devices in extracting antibodies. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 231-235 (2009).
  10. Lopez-Cisternas, J., Castillo-Diaz, J., Traipe-Castro, L., Lopez-Solis, R. O. Use of polyurethane minisponges to collect human tear fluid. Cornea. 25 (3), 312-318 (2006).
  11. Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
  12. Sim, T. C., Grant, J. A., Hilsmeier, K. A., Fukuda, Y., Alam, R. Proinflammatory cytokines in nasal secretions of allergic subjects after antigen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 149 (2 Pt 1), 339-344 (1994).
  13. Sim, T. C., Reece, L. M., Hilsmeier, K. A., Grant, J. A., Alam, R. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. Am J Respir Crit Care Med. 152 (3), 927-933 (1995).
  14. Weido, A. J., Reece, L. M., Alam, R., Cook, C. K., Sim, T. C. Intranasal fluticasone propionate inhibits recovery of chemokines and other cytokines in nasal secretions in allergen-induced rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol. 77 (5), 407-415 (1996).
  15. Linden, M., et al. Immediate effect of topical budesonide on allergen challenge-induced nasal mucosal fluid levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-5. Am J Respir Crit Care Med. 162 (5), 1705-1708 (2000).
  16. Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
  17. Riechelmann, H., Deutschle, T., Friemel, E., Gross, H. J., Bachem, M. Biological markers in nasal secretions. Eur Respir J. 21 (4), 600-605 (2003).
  18. Wagenmann, M., et al. Bilateral increases in histamine after unilateral nasal allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 155 (2), 426-431 (1997).
  19. Wagenmann, M., Schumacher, L., Bachert, C. The time course of the bilateral release of cytokines and mediators after unilateral nasal allergen challenge. Allergy. 60 (9), 1132-1138 (2005).
  20. Baumann, R., et al. The release of IL-31 and IL-13 after nasal allergen challenge and their relation to nasal symptoms. Clin Transl Allergy. 2 (1), 13 (2012).
  21. Baumann, R., et al. Nasal levels of soluble IL-33R ST2 and IL-16 in allergic rhinitis: inverse correlation trends with disease severity. Clin Exp Allergy. 43 (10), 1134-1143 (2013).
  22. Chawes, B. L., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
  23. Scadding, G. W., et al. Optimisation of grass pollen nasal allergen challenge for assessment of clinical and immunological outcomes. J Immunol Methods. 384 (1-2), 25-32 (2012).
  24. Leaker, B. R., et al. The nasal mucosal late allergic reaction to grass pollen involves type 2 inflammation (IL-5 and IL-13), the inflammasome (IL-1beta), and complement. Mucosal Immunol. 10 (2), 408-420 (2017).
  25. Nicholson, G. C., et al. The effects of an anti-IL-13 mAb on cytokine levels and nasal symptoms following nasal allergen challenge. J Allergy Clin Immunol. 128 (4), 800-807 (2011).
  26. Dhariwal, J., et al. Nasal Lipopolysaccharide Challenge and Cytokine Measurement Reflects Innate Mucosal Immune Responsiveness. PLoS One. 10 (9), e0135363 (2015).
  27. Folsgaard, N. V., et al. Neonatal cytokine profile in the airway mucosal lining fluid is skewed by maternal atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
  28. Folsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
  29. Wolsk, H. M., et al. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
  30. Thwaites, R. S., et al. Nasosorption as a Minimally Invasive Sampling Procedure: Mucosal Viral Load and Inflammation in Primary RSV Bronchiolitis. J Infect Dis. 215 (8), 1240-1244 (2017).
  31. Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
  32. Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), L1088-L1094 (2004).
  33. Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
  34. Yamazaki, K., Ogura, S., Ishizaka, A., Oh-hara, T., Nishimura, M. Bronchoscopic microsampling method for measuring drug concentration in epithelial lining fluid. Am J Respir Crit Care Med. 168 (11), 1304-1307 (2003).
  35. Kikuchi, J., Yamazaki, K., Kikuchi, E., Ishizaka, A., Nishimura, M. Pharmacokinetics of telithromycin using bronchoscopic microsampling after single and multiple oral doses. Pulm Pharmacol Ther. 20 (5), 549-555 (2007).
  36. Kikuchi, E., et al. Comparison of the pharmacodynamics of biapenem in bronchial epithelial lining fluid in healthy volunteers given half-hour and three-hour intravenous infusions. Antimicrob Agents Chemother. 53 (7), 2799-2803 (2009).
  37. Kodama, T., et al. A technological advance comparing epithelial lining fluid from different regions of the lung in smokers. Respir Med. 103 (1), 35-40 (2009).
  38. Sasabayashi, M., Yamazaki, Y., Tsushima, K., Hatayama, O., Okabe, T. Usefulness of bronchoscopic microsampling to detect the pathogenic bacteria of respiratory infection. Chest. 131 (2), 474-479 (2007).
  39. Kipnis, E., et al. Proteomic analysis of undiluted lung epithelial lining fluid. Chest. 134 (2), 338-345 (2008).
  40. Kanazawa, H., Kodama, T., Asai, K., Matsumura, S., Hirata, K. Increased levels of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine in epithelial lining fluid from peripheral airways in patients with chronic obstructive pulmonary disease: a pilot study. Clin Sci (Lond). 119 (3), 143-149 (2010).
  41. Sugasawa, Y., et al. The effect of one-lung ventilation upon pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 25 (2), 170-177 (2011).
  42. Sugasawa, Y., et al. Effects of sevoflurane and propofol on pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 26 (1), 62-69 (2012).
  43. Cohen, J., et al. Ciclesonide improves measures of small airway involvement in asthma. Eur Respir J. 31 (6), 1213-1220 (2008).
  44. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  45. de Silva, T. I., et al. Comparison of mucosal lining fluid sampling methods and influenza-specific IgA detection assays for use in human studies of influenza immunity. J Immunol Methods. , (2017).

Tags

NasosorptionNasal MucosaRespiratory MucosaPrecision SamplingSynthetic Absorptive MatrixSAMNasal CavityInferior TurbinateMucosal Lining FluidBronchosorptionBronchial Mucosa

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Thwaites, R. S., Jarvis, H. C., Singh, N., Jha, A., Pritchard, A., Fan, H., Tunstall, T., Nanan, J., Nadel, S., Kon, O. M., Openshaw, P. J., Hansel, T. T. Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples. J. Vis. Exp. (131), e56413, doi:10.3791/56413 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image