鼻粘膜および気管支の流体の吸収: 人間の呼吸器粘膜とサンプル室加工高精度サンプリング

次のプロトコルで使用される技術は、西ロンドン研究倫理委員会 (参照数 15/ロー/0444) によって承認されています。 1. 鼻吸収 (NA) NA サンプリングする前の準備 NA を遂行した場合まず手洗いと手袋、患者の前にできれば。 頭のトーチを使用して鼻腔を検査、鼻腔内を可視化する患者さんの鼻を撤回する彼らの非利き手の親指を使用して医師。注:鼻鏡は通常必要ありません。 鼻腔と下鼻甲介サンプリングの前に可視化します。注:鼻孔 (鼻孔) 円形断面では、彼らはまっすぐ後方に移動します。一般に、膨らみや、鼻孔の外側の壁にインデントとして下鼻甲介を見ることができる鼻中隔を形成スムーズ、フラット内側の壁。たいこの引け目からサンプル鼻甲介、基になる上皮は上気道44の単純な線毛上皮なので。 NA サンプリング サンプリングする場合は、下鼻甲介に対して平らであることの位置を決め、鼻孔の内腔を優しく NA サムを渡します。 人差し指を使って鼻の粘膜の上にサムを押すドナーをお願いします。NA は、わずかなくすぐり、可能な限り目の散水とマロラクティック発酵がおこるよう可能性があります。注:成人では、我々 は一般的に 60 NA を実行 s。 MLF の吸収後、鼻孔から NA デバイスを削除し、元の管に戻します。 研究室ですぐにサンプルを処理またはこのプロトコルの詳細として、それらを凍結します。注:鼻の粘膜のチャレンジ モデルの様々 な異なる気道疾患、NA が検討されています。ただし、各研究と患者人口の他の呼吸サンプリング メソッドに対する検証を行わなければなりません。 2. 気管支吸収 (BA) BA サンプリングする前の準備注:BA は、気管支鏡検査スイートの専門スタッフによって実行されます。 カテーテルを BA デバイスを配置すること、前に SAM は押し出しと、カテーテルに撤退を確認します。 患者に BA を行う前に気管支鏡下シミュレータのモック BA を実施します。 BA サンプリング 気管支気管支、右下、右中葉に分割するだけで近位のレベルに気管および右主気管支に気管支鏡を渡します。注: 私たち通常サンプルから気管支気管支気道内の他のサイトをサンプリングすることができます。カテーテルとサムを観察すると、気管支鏡先端を見ることができない 1 つ。気管支鏡が必要なサンプリング サイトに到着したら、ba、次の簡単な手順を遵守します。 白の先端が気管支鏡の端に 1 cm の最大に、気道のちょうど表示されるまで、下カテーテル: は気管支鏡の操作チャンネルを通じて BA カテーテルを挿入します。気管支内視鏡やカテーテルの先端を気道の内腔の中心にしてください。カテーテル先端と粘膜に耐摩耗性のリスクを軽減する気管支の粘膜との接触を最小限に抑えるように注意します。 サム アウト: SAM は右中または右下葉気道の内腔に押し出されますので、BA デバイスのハンドルを押し下げます。直視下気道壁にマロラクティック発酵との接触、サムが作っているように気管支鏡の先端を曲げます。30 の粘膜壁にフラットに気道内でサムを残して s。 サムの: カテーテルの端に戻って、湿ったサム プローブがストレートや曲がっていないことを確認するため, 気管支鏡に目を通します。必要なカテーテルや気管支鏡の先端が SAM をまっすぐに後ろにできます。直視下カテーテルにストレートのサムを優しくリトラクトします。注意: 難易度のカテーテルに SAM を取り消し、サムと全体のデバイスを撤回、気道から押し出されます。 カテーテル: 気管支鏡の操作チャンネルからカテーテル全体を撤回します。 サムを断つ: SAM は滅菌ハサミで切断されは氷の上を cryotube に入れています。これらのサンプルは、このプロトコルで後で説明するよう、さまざまな方法で処理できます。 3. NA と BA の処理をサンプルします。 注:NA と BA から生じるサンプルの実験室の処理のための多数のオプションがあります。これらのプロトコルは、後で使用するためのサンプルを格納し、SAM から MLF サンプルを溶出するを求めます。 NA と BA のサンプルの即時処理のオプション オプション 1: は、さらに処理する前に、いくつかの時間のため氷の上湿ったサムを格納します。 オプション 2: すぐに深い凍結 NA サムズ コレクションの管です。同様に、サンプリング デバイスからハサミで除去した後、セラム チューブで BA SAMs を凍結します。 オプション 3: 直接または深い凍結を処理する前に溶出バッファー (300 μ L) で戸建のサムを配置します。 NA と BA のサンプルの溶出バッファーのオプション注:溶出バッファーの選択は MLF サンプルで分析することに依存し、私達は 4 つの主な選択肢を提案します。 事前に用意されたアッセイバッファー イムノアッセイ プロシージャに適したを使用します。そのようなバッファーは、蛋白質、例えば、ウシ血清アルブミン (BSA) の 1% だけでなく、少量の洗剤 (0.05%) を含める必要があります。 また、セル換散が発生しますので、洗剤の量を格納するバッファーを使用します。注:1% の濃度でトリトン X または NP40 を含むバッファーを使用します。セル換散バッファーは、サムから溶出して一般的に高いレベルのサイトカインとケモカイン、サイトカイン細胞内と細胞外の両方を有効にします。これらのバッファーは、タンパク質を含める必要があり、1 %bsa と成っています。 ウイルス RNA または測定のホスト RNA の定量的 PCR などの RNA 測定湿ったサムに直接 RNA 抽出バッファーを追加します。注:カオトロ ピック RNA 抽出バッファーを含む蛋白質を変化させるため。代わりに、免疫や細胞の換散バッファーで溶出 MLF 流体に RNA 抽出バッファーを追加します。 質量分析法による評価のための代謝と脂質の抽出のため、トリフルオロ酢酸などの有機溶剤を使用します。注:これらの試薬の詳細は、マテリアル セクションに含まれます。 溶出法 いずれかの上記の溶出技術、SAM を目的抽出バッファーと共に、2 mL マイクロ遠心チューブに挿入します。 渦ミックス 30 サンプル s 緩く接続された体液と生体分子のサムを洗浄します。 サンプル全体については復旧できるようにには遠心溶出を実行するために、洗浄に使用される同じ 2 mL マイクロ遠心チューブに挿入するスピン フィルター ミニ列に湿ったサムを追加します。注:2 つのスピン フィルター ミニ列の種類を使用できます。最初には、流体における溶出を許可する場所に SAM を保持するプラスチック製のメッシュのみが含まれています。また、感染性物質を扱う場合は、0.22 μ m の細孔径を持つスピン フィルターを使用します。これらのフィルターは、試料を滅菌し、抗酸菌感染サンプルに適しています。ただし、これらのフィルターは、非特異的相互作用によってフィルターするメディエーターの結合を最小限に抑えるためのバッファーでする必要があります。 スピン フィルターに湿ったサムを転送するのに滅菌鉗子を使用します。検体の間汚染を防ぐために鉗子を変更します。 ミニ遠心分離機で 16,000 x g で 20 分間遠心分離機サンプル 4 ° C に冷却 プロトコルの概要の例 研究室では、ラベル 2 mL サンプル コレクションのマイクロ遠心チューブと溶出バッファーの適切なボリュームを追加 (通常 300 μ L NA; の ba 100 μ L)。シール蓋と氷の場所です。 次のサンプリング (すぐにまたは実験室で) SAM 鉗子を使用してハンドルから削除されコレクション チューブ (前の手順で作成した) を含むバッファーに置かれます。遠心チューブのキャップはしっかりと閉じられ、さらなる処理のために検査室に、氷の上、サンプルを転送を確認します。 30 の転送コンテナーと渦ミックスからサムと溶出バッファーを含むチューブを削除 s。 滅菌鉗子を使用して、SAM を削除し、(0.22 μ m 酢酸セルロース フィルターの有無にかかわらず) スピン列に置きます。 コレクションの管から溶出バッファーを収集し、保持します。 元のコレクションの管で、サムと、スピン列を配置 (または新しい 1 つの場合、滅菌フィルターのサンプル) 列をスピンする収集バッファーを追加。この方法では、洗浄液が SAM からサンプルを溶出するコレクションの管に回転カラムを通過します。 サンプルを遠心分離機、シール蓋 (16,000 x g, 20 分, 4 ° C)。 遠心分離機からサンプルを取り出し、ラックに置きます。 チューブのシール蓋を開き、SAM を含むスピン列を削除します。適切な廃棄容器のサムとスピンの列の処分します。 慎重に因数にチューブ内に含まれる溶出液ラベル低温管します。溶出液量とボリュームをそれぞれ因数に記録します。 シールのクライオ チューブを-80 ° C のフリーザーに転送し、使用するまで直立を格納します。