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Absorção de fluidos nasais e brônquicas: amostragem de precisão da Mucosa respiratória humana e laboratório de processamento de amostras

Published: January 21, 2018
doi:
10.3791/56413
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1National Heart and Lung Institute, Faculty of Medicine, Imperial College London,St Mary’s Hospital, 2St Mary’s Hospital,Imperial College Healthcare Trust

Summary

Este manuscrito descreve o uso de técnicas de absorção nasal e brônquica, especificamente usando matrizes absorventes sintéticas (SAM) para o fluido de mucosa (MLF) das vias aéreas superiores e inferiores da amostra. Esses métodos fornecem melhor padronização e tolerabilidade do que as técnicas de amostragem respiratória existente.

Abstract

Os métodos de absorção nasal (NA) e absorção brônquica (BA) usam matrizes absorventes sintéticas (SAM) para absorver o líquido de mucosa (MLF) do trato respiratório humano. NA é uma técnica não-invasiva que absorve o líquido do corneto inferior e causa desconforto mínimo. AT produziu resultados reprodutíveis com a capacidade de repetir frequentemente a amostragem das vias aéreas superiores.

Por comparação, métodos alternativos de mucosa respiratória, tais como a aspiração nasofaríngea (NPA) e limpeza convencional, de amostragem são mais invasivos e podem resultar em maior variabilidade de dados. Outros métodos têm limitações, por exemplo, biópsias e procedimentos brônquicos são invasivos, escarro contém muitos mortos e morrendo células e requer a liquefação, condensado do ar exalado (EBC) contém água e saliva e lavagem as amostras são diluídas e variável.

BA pode ser realizada através do canal de trabalho de um broncoscópio na clínica. A amostragem é bem tolerada e pode ser realizada em vários locais na via aérea. BA resultados em amostras MLF, sendo menos diluído do que amostras de lavado broncoalveolar (BAL) de lavagem.

Este artigo demonstra as técnicas de at e BA, bem como o processamento laboratorial das amostras resultantes, que pode ser adaptada para o biomarcador de jusante desejada sendo medido. Estas técnicas de absorção são alternativas úteis para as técnicas de amostragem convencional usadas em pesquisa clínica respiratória.

Introduction

A maioria das doenças respiratórias causam uma resposta inflamatória, e há uma necessidade urgente de amostragem da superfície da mucosa respiratória na rinite alérgica, infecções virais e fúngica, tuberculose, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, pulmonar fibrose e pulmão câncer 1. Aspirado de nasofaringe (NPA), lavagem nasal e lavagem broncoalveolar (BAL) são técnicas comuns de amostragem das vias aéreas superiores e inferiores. No entanto, essas técnicas apresentam problemas consideráveis, incluindo pobre tolerabilidade, diluição de mediadores inflamatórios e a incapacidade de se repetir com frequência de amostragem2. Uma alternativa para amostragem de NPA é o uso de cotonetes, nylon reuniram-se, o algodão ou viscose3,4, mas estas também têm limitações, uma vez que causam desconforto e danos para o epitélio nasal e em alguns ligação irreversível de casos de mediadores inflamatórios5. Essas técnicas geralmente não podem ser repetidas em série, mais de uma hora, e técnicas alternativas podem ser mais eficazes para a deteção de baixa abundância citocinas e quimiocinas5,6. Além disso, a variabilidade de usuário associada com estas técnicas pode gerar inconsistências nos dados, tendo por resultado a exigência de maiores coortes de pacientes.

Alternativamente, técnicas de absorção utilizando esponjas naturais e sintéticas têm sido usadas para coletar MLF de superfícies mucosas. Esponjas de Oftalmologia é composta por celulose natural (por exemplo, Weck-cel) têm sido usados para amostra saliva, cervical e secreções vaginais7. Além disso, esponjas sintéticas, feitas de álcool polivinílico (PVA) e acetato de polivinilo hidroxilado (HPVA) foram utilizados8. Sete diferentes materiais absorventes foram comparados para amostragem de fluido oral antes da medição anticorpos9, enquanto o miniesponjas poliuretano têm sido utilizadas para coletar as lágrimas humanas10.

Papel de filtro, consistindo de celulose natural da planta do algodão tem sido amplamente utilizada para absorver as secreções nasais desde o papel pioneiro de Alam e colegas em 199211,12,13,14, 15,16,17. Papel de filtro discos produzidos a partir de cartões de filtro (por exemplo, Shandon) e têm sido utilizados para medir histaminas e citocinas depois de controlados os desafios alérgeno nasal e com exposição de alérgeno natural18,19 ,20,21. No entanto, diferentes lotes de papel de filtro variam em seu grau de ligação às proteínas e alguma falha ao liberar citocinas. Métodos utilizando uma matriz sintética de absorção (SAM), portanto, têm sido desenvolvidos2,22,23. SAMs agora são usadas geralmente para obter MLF nasal por NA. Estes materiais absorventes são confortáveis para usar e pode obter MLF nem do nariz inflamado em intervalos frequentes durante longos períodos de tempo.

Absorção nasal é uma forma de amostragem da mucosa de precisão usando uma SAM para a amostragem de MLF na via aérea superior. Dispositivos de at são fabricados como dispositivos médicos a marcação CE de materiais de grau médico usando quartos limpos e livres de poeira e alérgenos. O sampler at consiste de um identificador e SAM em um criotubo estéril. O SAM é composto de polímeros, fibras, normalmente, mas também está disponível como espuma, e estas são selecionadas para ser macio e absorvente, com rápida absorção para coleta de amostra. SAMs tem ligação proteína mínima para permitir que a eluição eficiente das secreções absorvidas. NA é uma técnica muito suave, não-invasivo que pode ser executada em doadores de todas as idades. Além disso, amostragem serial, mesmo em poucos minutos, é possível. AT foi validado contra as vias aéreas superiores existentes amostragem técnicas5 e amostragem repetitiva permitiu a geração de dados cinéticos seguindo o desafio da via aérea com alérgeno23,24,25, endotoxina bacteriana26 e viral-tipo TLR agonistas (JAI, a. et al., manuscrito em preparação). AT também tem sido usado em recém-nascidos para investigar a história natural da atopia27,28,29 e na bronquiolite viral30.

Bronchoscopic microsampling (BMS) é um procedimento para a coleção de MLF na via aérea inferior que foi desenvolvida por Olympus31,32,33. Infelizmente, este sistema BMS é apenas licenciado no Japão. Olympus fornecer dois sistemas BMS: um com um poliéster hidroxilado fibroso (FHPE) sonda34,35,36,37, e um com um algodão sonda n3833,, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. um obstáculo tem sido que a sonda BMS usada em pacientes com asma causados contato da mucosa, sangramento, com metade de todas as amostras contaminadas com sangue. Os autores concluíram que não era viável a amostra MLF usando este sistema BMS de vias aéreas periféricas em pacientes de asma43.

Como alternativa, temos desenvolvido BA usando uma SAM suave que pode ser executado durante a investigação bronchoscopic das vias aéreas inferiores, incluindo a infecção experimental de indivíduos asmáticos com rinovírus6a seguir. O dispositivo de BA consiste de: um cateter externo oco, uma peça de mão que na ativação extrusão o SAM e um fio-guia central de plástico que tem o SAM em sua extremidade. Quanto a AT, BA kits são fabricados com materiais de grau médico usando quartos limpos e livres de poeira e alérgenos. Além disso, dispositivos são CE marcado e são fornecidos gama irradiados. Faixa de SAM é macio, absorvente e tem rápida absorção para coleta de amostra. Também tem ligação proteína mínima para permitir que a eluição eficiente das secreções absorvidas. O dispositivo pode caber através do canal de trabalho de um broncoscópio e pode ser usado para rapidamente e com precisão da amostra MLF em locais específicos de interesse dentro das vias aéreas. Ao contrário de BAL ou BMS, BA não resulta em sangramento de contato ou após o procedimento adicional desconforto ao paciente.

Cuidadosa consideração deve ser dada para o processamento de amostras de at e BA. As amostras podem ser directamente congelado e processadas em lotes ou pode ser processada imediatamente. O tipo de processamento pode ser adaptado para determinadas aplicações a jusante, incluindo os imunoensaios de quimiocinas e citocinas, imunoglobulinas ou elutions de viral, bacteriana, e a célula hospedeira associado do RNA. Apresentamos a coleção clínica e o laboratório associadas at e BA como um guia para os investigadores clínicos de técnicas de processamento.

Protocol

As técnicas usadas no protocolo a seguir foram aprovadas pelo Comitê de ética de pesquisa (número de referência 15/lO/0444) West London. 1. nasal absorção (NA) Preparação antes da amostragem de at Ao efectuar at, primeiro lave as mãos e colocar luvas, de preferência na frente do paciente. Inspecionar a cavidade nasal usando uma lanterna e tem o médico usar seu polegar não-dominante para retrair o nariz do paciente para visualizar a cavidade nasal.Nota: Um espéculo nasal não é geralmente necessário. Visualize a cavidade nasal e inferior corneto antes da amostragem.Nota: Narinas (nariz) não são redondas em secção transversal e vão direto para trás. Geralmente, corneto inferior pode ser visto como uma protuberância ou recuo na parede lateral da narina, com septo nasal formando a parede lisa, plana medial. Queremos amostra neste inferior Corneto, uma vez que o epitélio subjacente é um epitélio ciliado simples do trato respiratório44. Amostragem de at Quando a amostragem, passe o SAM at suavemente até o lúmen da narina, orientando-o para ser plana contra corneto inferior. Pergunte o doador para usar um dedo para pressionar o SAM para a mucosa nasal. AT pode causar uma ligeira cócegas, com possível olho molhando, como o MLF é absorvida.Nota: Em adultos, geralmente realizamos at para 60 s. Após a absorção da MLF, remova o dispositivo NA narina e colocar de volta no tubo original. Processar as amostras imediatamente em laboratório ou congelá-los, conforme detalhado no final deste protocolo.Nota: AT está sendo estudada em uma variedade de modelos de desafio da mucosa nasal e também em doenças de vias aéreas diferentes. No entanto, validação contra outros métodos de recolha de amostras respiratórias deve ser executada para cada população de estudo e paciente. 2. brônquica absorção (BA) Preparação antes da amostragem de BANota: BA é executada por pessoal especializado em uma suíte de broncoscopia. Antes de colocar o dispositivo de BA para baixo o cateter, verifique se o SAM está expulsando e retirada de volta dentro do cateter. Antes da realização BA em um paciente, realizar um BA simulado em um simulador de broncoscopia. Amostragem de BA Passe o broncoscópio para baixo a traqueia e o brônquio principal direito para o nível do brônquio intermedius, imediatamente proximal à divisão nos lobos inferiores direito e meio.Nota: Nós normalmente amostra do brônquio intermedius, embora outros sites dentro das vias aéreas podem ser saboreados. Ao observar o cateter e o SAM, um não pode ver a ponta do broncoscópio. Observamos os seguintes passos simples para BA, uma vez que o broncoscópio alcançou o local de amostragem desejada. CATETER para baixo: Introduza o cateter de BA através do canal de funcionamento do broncoscópio até a ponta branca é apenas visível na via aérea, até um máximo de 1 cm distal à extremidade do broncoscópio. Mantenha a ponta broncoscópio e cateter no centro do lúmen das vias aéreas. Tenha cuidado para minimizar o contato entre a ponta do cateter e a mucosa dos brônquios para reduzir o risco de abrasão da mucosa. SAM OUT: Pressione o punho do dispositivo, BA para que o SAM é extrudado no lúmen das vias aéreas no lobo inferior direito ou meio. Sob visão direta, dobre a ponta do broncoscópio para garantir que o SAM está fazendo contato com o MLF na parede das vias aéreas. Deixar o SAM dentro das vias aéreas, plana para a parede da mucosa por 30 s. SAM IN: Olhe através do broncoscópio para garantir que a sonda de SAM a úmido é em linha reta e não dobrados volta sobre a extremidade do cateter. Se necessário, a ponta do cateter e broncoscópio pode ser trazida de volta para endireitar o SAM. Sob visão direta, retrai o SAM reta suavemente para o cateter.Nota: Se houver dificuldade para retrair o SAM volta dentro do cateter, retirar o dispositivo com SAM expulsado para fora das vias aéreas. CATETER acima: Retire o cateter inteiro do canal de funcionamento do broncoscópio. CORTAR o SAM: O SAM é cortado com uma tesoura esterilizada e é então colocado um criotubo no gelo. Estas amostras podem ser processadas com diferentes métodos, como detalhado mais tarde no presente protocolo. 3. processamento de at e amostras de BA Nota: Existem inúmeras opções para o processamento laboratorial das amostras resultantes de at e BA. Estes protocolos visam armazenar amostras para uso posterior e eluir a amostra MLF o SAM. Opções para manipulação de imediata das amostras at e BA Opção 1: Armazene o SAM húmido no gelo por algumas horas antes da transformação. Opção 2: Imediatamente deep freeze at SAMs na coleção do tubo. Da mesma forma, congele BA SAMs em frascos criogênicos após a remoção, com tesouras, do dispositivo de amostragem. Opção 3: Coloque o SAM destacado em tampão de eluição (300 µ l) antes da transformação direta ou profunda congelando. Opções de tampão de eluição para amostras at e BANota: A escolha do tampão de eluição depende o que vai ser analisado na amostra MLF e sugerimos quatro alternativas principais: Use um buffer de ensaio pré-preparadas apropriado para procedimentos de imunoensaio. Tais buffers devem conter uma pequena quantidade de detergente (0.05%) bem como de proteínas, por exemplo, albumina de soro bovino (BSA) em 1%. Como alternativa, use um buffer que contém uma maior quantidade de detergente, para que a lise celular ocorre.Nota: Nós usamos buffers contendo Triton-X ou NP40 na concentração de 1%. Buffers de lise celular ativar citocinas intracelulares e extracelulares ser eluída do SAM e geralmente resultam em níveis mais elevados de citocinas e quimiocinas. Esses buffers também devem conter proteínas e são compostos com BSA 1%. Para medições de RNA, como a PCR quantitativo de RNA viral ou medição do RNA do hospedeiro, adicionar o buffer de extração de RNA diretamente para o SAM húmido.Nota: Buffers de extração de RNA caotrópicas contêm guanidínio que desnatura as proteínas. Uma alternativa é adicionar o buffer de extração de RNA ao fluido eluted MLF contido em tampão de Lise imunoensaio ou célula. Use solventes orgânicos, tais como ácido trifluoroacético, para extração de lipídios e seus metabolitos, para avaliação por espectrometria de massa.Nota: Detalhes de todos estes reagentes são incluídos na seção materiais. Técnica de eluição Para qualquer uma das técnicas de eluição acima, insira o SAM um mL 2 microcentrífuga, juntamente com o buffer de extração desejada. Vórtice misturar a amostra por 30 s para lavar o SAM de fluidos vagamente anexados e biomoléculas. Para garantir a recuperação completa de amostras, execute eluição centrífuga adicionando o SAM úmido para uma rotação filtro mini coluna que insere-se no tubo de 2 mL de microcentrífuga mesmo usado para lavar roupa.Nota: Dois tipos de rotação filtro mini coluna podem ser usados. O primeiro contém apenas um engranzamento plástico, que detém o SAM no lugar, permitindo que a eluição completa de fluidos. Alternativamente, se trabalhar com materiais infecciosos, use filtros de rotação com um tamanho de poros de 0,22 µm. Estes filtros vão esterilizar amostras e são adequados para amostras com suspeita de infecção por micobactérias. Entretanto, estes filtros devem ser pré-incubado com buffer, para minimizar a vinculação dos mediadores para o filtro por interacções não-específicas. Use Pinças esterilizadas para transferir o SAM úmido para o filtro de rotação. Alterar o fórceps entre amostras para evitar a contaminação. Amostras de centrifugar por 20 min a 16.000 x g em uma centrífuga mini resfriado a 4 ° C. Protocolo de exemplo do Resumo No laboratório, rotular 2ml microcentrífuga tubos para coleta de amostra e adicionar o volume desejado de tampão de eluição (tipicamente 300 µ l para at; 100 µ l de BA). Feche a tampa e colocar no gelo. Após a amostragem (imediatamente ou no laboratório), o SAM é retirado o identificador usando fórceps e colocados no buffer que contém o tubo de coleta (produzido na etapa anterior). Certifique-se a tampa do tubo microcentrifuga está bem fechada e transferir as amostras, no gelo, ao laboratório para processamento adicional. Remover os tubos contendo o tampão SAM e eluição de seu mix de contêiner e vórtice de transferência por 30 s. Usando a pinça estéril, remover SAM e colocar em uma coluna de rotação (com ou sem filtro de acetato de celulose 0,22 µm). Coletar o tampão de eluição do tubo da coleção e reter. Coloque a coluna de rotação, com SAM, no tubo da coleção original (ou uma nova se filtragem estéril amostras) e adicionar o buffer de coleção para girar a coluna. Desta forma, o fluido de lavagem passará através da coluna de rotação volta no tubo de coleta, ajudando a eluir a amostra do SAM. Centrifugar as amostras com tampas seladas (16.000 x g, 20 min, 4 ° C). Remover as amostras da centrífuga e coloc em uma cremalheira. Abra a tampa selada dos tubos e remover a coluna de rotação contendo o SAM. Descarte de SAM e girar a coluna em um recipiente de recolha apropriado. Cuidadosamente a alíquota o eluato contido dentro do tubo em rotulados criogênico tubos. Registre o volume total de eluato e o volume em cada alíquota. Transferir os tubos criogênicos selados para um freezer-80 ° C e armazenar na vertical até o uso.

Representative Results

AT tem sido utilizada em uma série de estudos para facilmente e não invasiva mede a inflamação da mucosa. Após a administração do alérgeno para o nariz, observam-se níveis de prostaglandina-D2 (PGD2) para subir e descer em poucos minutos (Figura 1), em consonância com a degranulação de mastócitos (Thwaites et al., manuscrito em preparação). Além disso, os mediadores da inflamação do tipo II, tais como IL-5 (Figura 2, reproduzido com permissão de 24), podem ser medidos após alérgeno nasal desafio23,24horas. Na infecção experimental de asmáticos alérgicos e controles saudáveis, at foi usado para medir um painel de mediadores, incluindo o interferão-gama (IFN-γ), ao longo de 7 dias (Figura 3, reimpresso com permissão de 6). Além disso, na infecção natural pelo vírus sincicial respiratório (RSV) dos lactentes, at demonstrou RSV para ser associado com os níveis elevados de citocinas inflamatórias, tais como IFN-γ, em relação ao não-RSV lactentes com bronquiolite e controles saudáveis ( Figura 4, reimpresso com permissão de 30). Curiosamente, esta discriminação entre RSV e não-RSV bronquiolite não foi significativa em vez de correspondência amostras NPA (Figura 4). BA também foi usada durante a infecção experimental de asmáticos alérgicas com rinovírus. No dia 4 de infecção por rinovírus, níveis de IFN-γ, CXCL11, IL-10 e IL-5 foram elevados da linha de base (Figura 5; A, B, C e D, respectivamente). Além disso, esta técnica demonstrou elevados níveis de IL-5 na via aérea inferior de asmáticos alérgicas durante a infecção por rinovírus, em relação a controles saudáveis (Figura 5) (Figura 5 reimpresso com permissão de 6). Estes resultados representativos foram gerados de amostras eluídas usando buffer de ensaio contendo 0.05% Tween-20% e 1% de BSA (ver Tabela de materiais). Figura 1 : Geração rápida e liberação de prostaglandina-D2, seguindo o desafio de alérgeno nasal. Os níveis de prostaglandina-D2 (PGD2) medido a partir eluídos absorção nasal em amostras seriais seguindo o desafio de alérgeno nasal com o pólen de grama Timothy (n = 5). Cada linha representa dados de um indivíduo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Medição cinética de IL-5, seguindo o desafio de alérgeno nasal. Produção de IL-5, em amostras de absorção nasal serial seguindo o desafio de alérgeno nasal. 3 repita o alérgeno desafio estudos foram realizados, com os participantes (n = 19) receberam placebo (azul), baixa de prednisona oral dose (10 mg) (laranja), ou prednisona oral de alta dose (25 mg) (vermelha) uma hora antes da administração do alérgeno. As linhas indicam a média geométrica e barras de erro são intervalos de confiança de 95% de todos os participantes. (Figura reimpresso com permissão da Leaker et al, Imunologia da mucosa, 2017). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Indução de Interferon-γ durante infecção rinovírus. Durante o desafio de infecção de adultos saudáveis (n = 11, azul) e asmáticos alérgicos (n = 28, vermelho) com 16-rinovírus, amostragem de absorção nasal foi utilizada para medir os níveis de interferon-γ (IFN-γ). Dados são representados como parcelas de espaguete A) cru dos indivíduos e níveis B) medianos com barras de erro que indicam faixas de percentis. (Figura reimpresso com permissão da Hansel et al 6). clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Nasosorption discrimina Interferon-γ elevado associado com infecção pelo VSR dos lactentes. Absorção nasal e aspiração nasofaríngea (NPA) foram usados para medir os níveis de interferão-γ em lactentes com bronquiolite associada com infecção por vírus sincicial respiratório (VSR) (vermelho, n = 12), um patógeno respiratório não-RSV (verde, n = 12) e saudável controles (azul, n = 9). Os dados foram analisados usando um teste de Kruskall-Wallis com correção de Dunn para comparações múltiplas (* * *p< 0,001). Linhas denota valores medianos e barras de erro são faixas de percentis. (Figura modificada com a permissão de Thwaites et al 30). clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 : Mediadores inflamatórios em amostras de absorção brônquica durante a infecção de rinovírus.Após infecção do rinovírus-16 de controles saudáveis (n = 10, azul) e alérgicos asmáticos voluntários (n = 23, vermelho), absorção brônquica foi usada para medir os níveis de IFN-γ A), CXCL11 B), C) IL-10 e IL-5 D) na linha de base e no dia 4 de infecção. Dados analisados por Wilcoxon assinaram rank test (amostras correspondentes) e teste de Mann-Whitney (incomparáveis amostras). Figura reimpresso com permissão da Hansel et al 6 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Resultados de técnicas de amostragem de vias aéreas existentes são considerados altamente variável; técnicas de amostragem alternativos são necessários para padronizar a pesquisa dentro deste campo5. NA BA permitir a amostragem de MLF de forma não-invasiva e têm potencial emocionante para medir respostas imunes nas vias aéreas saudáveis e doentes. Estas técnicas oferecem inúmeras vantagens potenciais sobre técnicas existentes, incluindo maior tolerabilidade, velocidade de amostragem, a capacidade de repetir frequentemente a amostragem, baixa variabilidade inter-user e diminuíram a diluição dos mediadores imunes5 . A duração da absorção e da técnica de processamento usado deve ser otimizada para cada estudo e rigorosamente mantida entre eventos de amostragem. Além disso, no caso de BA, o local de amostragem dentro das vias aéreas deve ser cuidadosamente replicado entre indivíduos.

ND e particularmente BA, são ainda relativamente novas técnicas para a pesquisa clínica. No entanto, os benefícios destas técnicas resultaram em seu uso em numerosos estudos, incluindo validação cuidadosa contra técnicas alternativas5. Estes dispositivos estão agora disponíveis como dispositivos de marcação CE pronto para uso difundido na investigação respiratória. Enquanto nd e BA resultam em muito menores volumes de amostra do que as técnicas de amostragem alternativo, altas concentrações obtidas podem resultar em maior sensibilidade aos mediadores imunes baixa abundância.

Dependendo de aplicações a jusante desejadas, amostras at e BA diretamente podem ser congeladas para posterior processamento, realçando o estudo de viabilidade em um ambiente de pesquisa clínica. O protocolo para manuseio de amostras também pode ser adaptado às aplicações particulares a jusante. As técnicas de processamento sugerido podem ser usadas para a coleção de proteína ou imune mediadores lipídicos ou ácidos nucleicos, mas devem ser otimizadas para cada estudo. Em particular, MLF pode ser eluída com buffers diferentes. Em primeiro lugar, imunoensaio buffer pode ser usado para medir os anticorpos6,45, quimiocinas e citocinas na mucosa. Buffers com níveis mais elevados de detergente também podem ser usados para garantir a lise celular ocorre, permitindo a inclusão de citocinas intra celulares. Extração de RNA caotrópicas buffers de devem ser usados para a determinação da infecção viral, viral carregar, o apresentador de mRNA e o microbiome. Alternativamente, solventes orgânicos podem ser usados para lipidomics e espectrometria de massa.

Em conclusão, absorção direta de MLF de superfícies mucosas é uma técnica excitante com potencial de uso em doenças da mucosa respiratórias, gastrointestinal, urogenitais e outras. No entanto, essas técnicas de absorção promissor exigirá validação precisa de amostragem e técnica para ensaios individuais (biomarcadores) em cada configuração de doença de processamento. Além disso, estas técnicas de amostragem da mucosa precisão romance exigirá validação contra amostras convencionais, tais como de sangue, respiração e saliva. Com estas técnicas, MLF pode ser usado para medir os anticorpos, citocinas, quimiocinas, prostanoids e micróbios.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Instituto Nacional Imperial para centro de pesquisa biomédica (BRC) saúde pesquisa (NIHR), o NIHR saúde proteção pesquisa unidade (HPRU) em infecções respiratórias no Imperial College London, em parceria com a saúde pública Inglaterra (PHE) e o centro de investigação de translação NIHR Imperial segurança do paciente. As opiniões expressadas são as dos autores e não necessariamente os do NHS, o NIHR, departamento de saúde ou saúde pública Inglaterra.

Materials

Nasosorption (adult, 7mm width) Hunt Developments NSFL-FXI-11 Different sizes are available for different patient groups/ages.
Bronchosorption Hunt Developments BSFL-FXI-11 Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) Sigma Aldrich CLS9301-1000EA
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) Sigma Aldrich CLS8160-24EA For sterilisation of samples with infection risk.
Assay (elution) buffer Millipore AB-33k Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.
NP-40 Cell lysis buffer Life Technologies FNN0021 Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.
Buffer RLT (RNA extraction) Qiagen 79216 Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031-100ML-M For elution of samples to be used in HPLC applications
2.0ml micro-centrifuge tubes Costar 3213 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.
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Thwaites, R. S., Jarvis, H. C., Singh, N., Jha, A., Pritchard, A., Fan, H., Tunstall, T., Nanan, J., Nadel, S., Kon, O. M., Openshaw, P. J., Hansel, T. T. Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples. J. Vis. Exp. (131), e56413, doi:10.3791/56413 (2018).
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