Multimateriali di cartilagine e pelle tessuto analoghi utilizzando un romanzo passivo unità tecnica di miscelazione per Bioink Precellularization

Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico di Chalmers University ricerca umana. Nota: Tutti i passaggi sono eseguiti in una cappa di biosicurezza sterile. 1. preparazione dei materiali di consumo, Bioink e cellule Ottenere due siringhe, una siringa (Figura 1a) per la sospensione delle cellule, mentre altre la siringa è per il bioink (Figura 1b). Ottenere un’unità di miscelazione passiva (Figura 1c) sterile che può essere accoppiata con siringhe dual tramite un raccordo Luer lock. Ottenere un gruppo erogatore (Figura 1d) che può estrudere un volume da due siringhe sterili simultaneamente a velocità controllata.Nota: Il rapporto di miscelazione utilizzato in questo studio è di 10:1. Pertanto, utilizzare una siringa 12 mL e una siringa da 1 mL come richiesto dalle unità di miscelazione 10:1. Ottenere una cartuccia sterile (Figura 1e) e un sterile Luer lock femmina a femmina-femmina direttamente miscelare la sospensione delle cellule e bioink in. Ottenere o preparare il bioink per la miscelazione con una sospensione cellulare.Nota: In questo protocollo, è stato utilizzato un bioink nanocellulose/alginato basato. Questo bioink è con collegamenti incrociati attraverso l’aggiunta di una soluzione sterile 100 mM CaCl2 post stampa. Staccare le cellule utilizzando una soluzione di tripsina/EDTA 0.5% e contare il numero totale di celle utilizzando il metodo di esclusione blu trypan17.Nota: In questo protocollo, fibroblasti umani venivano utilizzati. Determinare quali densità cellulare è voluta nel costrutto finale stampato. Calcolare utilizzando le equazioni seguenti la concentrazione delle cellule raccolte che deve essere diluito per raggiungere questa densità di cella finale di destinazione.Nota: Nel presente protocollo, una densità di cella finale di 5 x 106 cellule/mL è stata utilizzata. Selezionare una cella desiderata concentrazione per gli esperimenti: Cdelle cellule (cellule/mL). Calcolare la quantità di bioink necessario, Vbioink, basato sul numero totale dei costrutti desiderato: Vbioink = Vcostruire × NContructs Nota: per esempio, il volume di bioink al costrutto è 100 µ l. Se 30 costrutti vengono stampate, il volume di bioink necessario è da 3 mL. Calcolare il numero di cellule necessarie: Ncelle = Ccell (1,1 × Vbiolink) Risospendere le cellule (celluledi N) in 1/10th il volume della bioink: Vsospensione cellulare = 0,1 × Vbiolink Nota: per esempio, se Vbioink = 3 mL, allora Vsospensione cellulare = 0,1 × 3 mL = 0,3 mL 2. miscelazione della sospensione cellulare e Bioink Trasferire la sospensione cellulare nella siringa di sospensione cellulare. Trasferire la bioink un’altra siringa o ottenere una siringa contenente la bioink. Tirare indietro lo stantuffo della siringa bioink e inserire la siringa nel gruppo erogatore. Posizionare l’apparecchio verticalmente con il Luer lock femmina verso l’alto (Figura 1f1). Tirare indietro lo stantuffo della siringa delle cellule ad una lunghezza simile come la siringa di bioink e inserire il gruppo erogatore (Figura 1f2). Inserire due siringhe per l’unità di miscelazione ruotandolo i connettori Luer lock (Figura 1f3). Innescare il sistema di miscelazione spingendo il gruppo erogatore per estrudere l’aria nella siringa. Interrompere l’innesco prima la soluzione raggiungendo Luer lock (Figura 1g4). Dopo l’innesco, è necessario allegare la cartuccia di riempimento alla fine dell’unità di miscelazione tramite il raccordo luer lock (Figura 1g5). Assicurarsi che lo stantuffo della cartuccia di riempimento sia nella parte inferiore prima dell’attacco. Lentamente comprimere (Figura 1h6) il gruppo erogatore per mescolare la sospensione delle cellule e bioink insieme nella cartuccia (Figura 1i7). Spingere lo stantuffo verso il basso la cartuccia di riempimento con una punta di pipetta sterilizzata per contattare la miscela di bioink-cellula dopo la miscelazione. Mantenere l’erogazione fino a comprimere per assicurare che la miscela delle cellule/bioink non viene estruso in unità di miscelazione. Tappo della cartuccia e picchiettare delicatamente sulla superficie di lavoro per spostare eventuali bolle d’aria nella parte superiore della cartuccia (fine del pistone).Nota: A questo punto, l’impasto di cella/bioink è pronto per la stampa. Le sezioni seguenti illustrerà applicazioni specifiche e procedure di stampa. 3. la determinazione della vitalità cellulare utilizzando un’unità di miscelazione rispetto al manuale spatola miscelazione Scollegare i fibroblasti umani (passaggio 7) con una soluzione di tripsina/EDTA 0,5% a 80% confluenza, contare il numero e risospendere in terreno di coltura ad una densità di cellule sufficiente per ottenere una concentrazione finale dopo la fusione con il bioink (01:10 cella: bioink ratio) di 5 x 10 6 cellule/mL. Frullare le cellule in bioink utilizzando sia il passivo unità tecnica (passaggio 2) di miscelazione o tramite spatola per valutare l’effetto di entrambe le tecniche sulla vitalità cellulare. Le cellule si fondono il bioink utilizzando il passivo unità tecnica 1, 2, o 3 volte prima dell’erogazione in uno stampo per cross-linking con 100 mM di CaCl2di miscelazione.Nota: Per eseguire ulteriori miscele, mescolare il cellulare/bioink direttamente in una siringa, piuttosto che una cartuccia. Quindi remix la miscela attraverso l’unità di miscelazione seguendo il protocollo precedente, ma senza la componente di siringa delle cellule. Le cellule si fondono in un bioink separato utilizzando manuale meccanica miscelazione tramite una spatola per durate di 30, 60 o 90 s. trasferimento delle miscele (per ogni tempo di miscelazione) in uno stampo per cross-linking utilizzando 100 mM CaCl2. Trasferire i campioni ad una piastra ben dopo il completamento del cross-linking e cultura in condizioni standard. Dopo 1 giorno di cultura, lavare i costrutti (n = 3-4 per ogni gruppo) nel mezzo di coltura privo di siero cellulare per 30 min. macchiare le cellule nei costrutti con una soluzione colorante (4 µM calceina, 1 µM etidio omodimero-1) per 30 min. Lavare due volte e incubare i campioni nel mezzo di coltura privo di siero cellulare per un totale di 1 h a 37 ° C.Trasferire i campioni a una soluzione di imaging di cellule vive. Acquisire immagini tramite una telecamera digitale a colori a 10 ingrandimenti utilizzando un microscopio invertito con filtri FITC e Texas Red e analizzare utilizzando software di analisi di immagine. Selezionare casualmente tre immagini da ogni costrutto per la quantificazione di attuabilità delle cellule. Calcolare la redditività sulla base del rapporto di cellule vive al numero totale di cellule. Analizzare i dati tramite un one-way ANOVA seguita da test di confronti multipli di Tukey. 4. multimateriali di cartilagine analoghi con un tipo di cellula Disegnare un modello 3D del tessuto desiderato analogico. Convertire un file Gcode per multimateriali e caricare il file Gcode sul bioprinter1.Nota: Nel presente protocollo, una struttura quadrata con dimensioni 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 è stata esportata come file STL. È stato generato un file Gcode della struttura della grata utilizzando le seguenti impostazioni: spessore dello strato, 0,3 mm; pattern di riempimento, rettilinee; densità di riempimento, 25%; velocità, 10 mm/s. Isolare e crioconservare chondrocytes nasale umano primario (hNC) dai pazienti che seguono il protocollo di riferimento1. Scongelare ed espandere hNCs crioconservati e una volta nella cultura dello strato monomolecolare utilizzando standard di coltura a 37 ° C. Staccare le cellule alla confluenza di 80-90% con una soluzione di tripsina/EDTA 0.5% e contare utilizzando un protocollo di esclusione del blu di trypan. Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando hNCs al passaggio 2. Risospendere il hNCs a 100 x 106 cellule/mL entro 300 µ l di terreno di coltura completato con 10% siero bovino fetale, 1% di penicillina-streptomicina e l’acido ascorbico 50 µ g/mL, in preparazione per la fusione con il bioink. Miscela la sospensione cellulare hNC in un nanocellulose/alginato basato bioink segue il passivo protocollo di unità a un rapporto di 10:1 bioink:cell sospensioni per ottenere una concentrazione di cella finale di 9 x 106 cellule/mL di miscelazione. Assicurarsi che il bioprinter è sterilizzata tramite esposizione ai raggi UV e pulire con etanolo al 70%. Mantenere la sterilità inserendo in un flusso laminare mobile. Allegare sterili stampa ugelli per le cartucce che contengono le miscele di sospensione bioink/cellulare e inserire il bioprinter. Calibrare il bioprinter manualmente o mediante i protocolli specifici per la stampante. Bioprint il reticolo-strutturato, costrutti carichi di cella utilizzando i seguenti parametri di stampa: ugello conico 25G ad una pressione di 25 kPa. Bioprint cellulare privo di costrutti (mescolati con mezzo cellulare non contenente nessuna cellula) come controllo. I costrutti del legame incrociato con l’aggiunta di una soluzione ionica di 100 mM CaCl2 per 5 min, sciacquare i costrutti e procedere all’incubazione in terreno di coltura in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità relativa). Modificare i media ogni secondo o terzo giorno. Raccogliere i campioni per l’analisi istologica alle settimane 2 e 4. Macchiare i campioni per la produzione di GAG con una macchia blu di Alcian18. 5. multimateriali di analoghi di pelle con due tipi di cellule Disegnare un modello 3D del tessuto desiderato analogico e convertire in un file Gcode per multimateriali. Caricare il file Gcode sulla bioprinter.Nota: Nel presente protocollo, una struttura quadrata con dimensioni 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 è stata esportata come file STL. È stato generato un file Gcode della struttura della grata utilizzando le seguenti impostazioni: spessore dello strato, 0,3 mm; pattern di riempimento, rettilinee; densità di riempimento, 25%; velocità, 10 mm/s. Preparare le celle per frullare in bioink per multimateriali. Per la realizzazione di analoghi di pelle, sono stati utilizzati due tipi di cellule. I due tipi cellulari sono stati miscelati nella bioink e multimateriali. Ottenere HDF primario. Mantenere queste cellule in coltura DMEM completati con 10% siero bovino fetale, 1% di penicillina-streptomicina e 50 µ g/mL di acido ascorbico. Staccare le cellule alla confluenza di 80-90% con una soluzione di tripsina/EDTA 0,5% e il conteggio. Isolare e crioconservare hNC primarie da pazienti che seguono il protocollo di riferimento1. Scongelare ed espandere crioconservati hNCs nella cultura dello strato monomolecolare. Staccare le cellule alla confluenza di 80-90% con una soluzione di tripsina/EDTA 0,5% e il conteggio. Risospendere entrambi i tipi cellulari a 100 x 106 cellule/mL all’interno dei media di crescita. Mescolare le sospensioni di cella insieme a un rapporto di 1:1 per ottenere una concentrazione finale totale di 100 x 106 cellule/mL a 300 µ l di media. Miscela la sospensione cellulare di 50: 50 di HDF e hNC in un nanocellulose/alginato basato bioink segue il passivo protocollo di unità a un rapporto di 10:1 bioink:cell sospensioni per ottenere una concentrazione di cella finale di 9 x 106 cellule/mL di miscelazione. Assicurarsi che il bioprinter è sterilizzato o viene inserito in un flusso laminare mobile per mantenere la sterilità. Allegare sterili stampa ugelli per le cartucce che contengono le miscele di sospensione bioink/cellulare e inserire il bioprinter. Calibrare manualmente il bioprinter sia o i protocolli specifici per la stampante. Bioprint il reticolo-strutturato, costrutti carichi di cella utilizzando i seguenti parametri di stampa: ugello conico 25G ad una pressione di 25 kPa. Bioprint cellulare privo di costrutti (mescolati con mezzo cellulare non contenente nessuna cellula) come controllo. I costrutti del legame incrociato con l’aggiunta di una soluzione ionica di 100 mM CaCl2 per 5 min, sciacquare i costrutti e procedere all’incubazione in terreno di coltura in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità relativa). Modificare i media ogni secondo o terzo giorno. Raccogliere i campioni per l’analisi istologica alle settimane 2 e 4. Macchiare i campioni per il collagene produzione utilizzando tricromica19 di un Masson.