Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Chalmers University Humanforschung Ethikkommission. Hinweis: Alle Schritte müssen in einem sterilen Biosafety Schrank ausgeführt werden. 1. Vorbereitung von Verbrauchsmaterialien, Bioink und Zellen Erhalten zwei Spritzen, eine Spritze (Abbildung 1(ein) ist für die Zellsuspension, während die andere Spritze für die Bioink (Abbildung 1b) ist. Erhalten Sie eine sterile passive Mischeinheit (Abbildung 1c), die mit dual Spritzen über eine Luer-Lock-Verbindung gekoppelt werden kann. Erhalten Sie eine Dosiereinheit (Abbildung 1-d), die ein Volumen von zwei sterile Spritzen gleichzeitig mit kontrollierter Geschwindigkeit linear austragen kann.Hinweis: Das Mischungsverhältnis verwendet in dieser Studie beträgt 10:1. Verwenden Sie daher eine 12 mL Spritze und eine 1 mL Spritze je nach Bedarf vom Referat 10:1 mischen. Erhalten Sie eine sterile Patrone (Abbildung 1e) und sterile weiblich-weiblich Luer Lock Anschluss direkt gemischt Bioink und Zelle Aussetzung in. Zu erhalten Sie oder bereiten Sie die Bioink für die Mischung mit einem Zellsuspension.Hinweis: In diesem Protokoll war ein Nanocellulose/Alginat-basierte Bioink genutzt. Dieses Bioink ist durch die Zugabe einer sterilen 100 mM CaCl2 -Lösung post drucken vernetzt. Zellen mit einer 0,5 % Trypsin/EDTA-Lösung zu lösen und die Gesamtzahl der Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung Methode17zählen.Hinweis: In diesem Protokoll wurden menschliche Fibroblasten eingesetzt. Bestimmen Sie, welche Zelldichte in das endgültige gedruckten Konstrukt gewünscht wird. Berechnen Sie mit Hilfe der folgenden Gleichungen die Konzentration der geernteten Zellen, die verdünnt werden muss, um dieses Ziel letzte Zelle Dichte zu erreichen.Hinweis: In diesem Protokoll wurde eine endgültige Zelldichte von 5 x 106 Zellen/mL eingesetzt. Wählen Sie eine gewünschte Zelle Konzentration für die Experimente: C-Zellen (Zellen/mL). Berechnen Sie die Höhe der Bioink notwendig, VBioink, bezogen auf die Gesamtzahl Konstrukte gewünscht: VBioink = Vkonstruieren × Nkonstruierte Hinweis: zum Beispiel ist die Lautstärke des Bioink pro Konstrukt 100 µL. Wenn 30 Konstrukte gedruckt werden, dann ist das Bioink Volumen benötigt 3 mL. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen benötigt: NZellen = CZelle (1,1 × VBiolink) Aufschwemmen der Zellen (N-Zellen) in 1/10th das Volumen der Bioink: VZellsuspension = 0,1 × VBiolink Hinweis: zum Beispiel wenn VBioink = 3 mL, dann VZellsuspension = 0,1 × 3 mL = 0,3 mL 2. Mischen der Zellsuspension und Bioink Übertragen Sie die Zellsuspension in die Zelle Aussetzung Spritze. Übertragen Sie der Bioink auf eine andere Spritze oder erhalten Sie eine Spritze mit der Bioink zu. Ziehen Sie den Spritzenkolben Bioink zurück und legen Sie die Spritze in der Dosiereinheit. Positionieren Sie das Gerät senkrecht mit dem Luer Lock Anschluss nach oben (Abbildung 1-f1). Ziehen Sie den Kolben der Spritze Zelle zurück auf eine ähnliche Länge als die Bioink Spritze und stecken Sie in die Dosiereinheit (Abbildung 1f2). Die Mischeinheit zuordnen Sie beide Spritzen durch Verdrehen Luer Lock Konnektoren (Abbildung 1f3). Entlüften Sie das Mischsystem durch Drücken auf die Dosiereinheit, die Luft in der Spritze zu extrudieren. Stoppen Sie die Grundierung vor der Lösung der Luer-Lock (Abbildung 1g4) zu erreichen. Nach dem Grundieren, legen der Füllung Kartusche bis zum Ende der Mischeinheit über den Luer Lock-Anschluss (Abbildung 1g5). Stellen Sie sicher, dass unten vor der Anlage befindet sich die Kolben in der Füllung Patrone. Komprimieren Sie langsam (Abbildung 1h6) die Dosiereinheit um die Bioink und Zelle Aussetzung in die Patrone (Abbildung 1i7) vermischen. Drücken Sie den Kolben in die Füllung Patrone nach unten mit einer sterilen Pipettieren Spitze, die Bioink-Zelle-Mischung nach dem Mischen zu kontaktieren. Halten Sie die Abgabe bis komprimiert, um sicherzustellen, dass die Zelle/Bioink-Mischung zurück in die Mischeinheit nicht extrudiert wird. Verschließen der Patrone und klopfen Sie leicht auf die Arbeitsfläche, um eventuell vorhandene Luftbläschen an die Spitze der Kartusche (Kolbenende) bewegen.Hinweis: An dieser Stelle ist die Zelle/Bioink Mischung druckfertig. Den folgenden Abschnitten werden spezifische Anwendungen und Druckverfahren werden. 3. Ermittlung der Zellviabilität unter Verwendung einer Mischanlage im Vergleich zu manuellen Spatel mischen Lösen von menschlichen Fibroblasten (Abschnitt 7) mit 0,5 % Trypsin/EDTA-Lösung am Zusammenfluss von 80 %, die Anzahl und Aufschwemmen in Kulturmedium bei ausreichender Zelldichte, eine Endkonzentration nach dem Mischen mit der Bioink zu erreichen (01:10 Zellen: Bioink-Verhältnis) von 5 x 10 6 Zellen/mL. Mischen Sie Zellen, in die Bioink mit entweder die Passive Einheit Mischtechnik (Schritt2) oder per Spachtel die Wirkung beider Techniken im Zellviabilität bewerten. Die Bioink mit der Passive Einheit Mischtechnik 1, 2 oder 3 Mal vor der Abgabe in eine Form zur Vernetzung mit 100 mM CaCl2verschmelzen Sie Zellen.Hinweis: Um zusätzliche Mischungen durchzuführen, mischen Sie die Zelle/Bioink direkt in eine Spritze anstatt einer Patrone. Dann die Mischung durch die Mischeinheit nach dem vorherigen Protokoll, aber ohne die Zelle Spritze Komponente remix. Eine separate Bioink mit manuelle mechanische mischen über einem Spatel für Laufzeiten von 30, 60 oder 90 S. Transfer die Mischungen (für jede Mischzeit) in eine Form zur Vernetzung mit 100 mM CaCl2verschmelzen Sie Zellen. Übertragen Sie die Proben auf einen gut Teller nach Abschluss der Vernetzung und Kultur unter Standardbedingungen. Nach 1 Tag voller Kultur, waschen die Konstrukten (n = 3-4 pro Gruppe) in serumfreien Zellkulturmedium für 30 min. Fleck der Zellen in die Konstrukte mit einer Färbelösung (4 µM Calcein AM, 1 µM Interkalation Homodimer-1) für 30 min. Zwei weitere Male zu waschen, und die Proben in serumfreien Zellkulturmedium für insgesamt 1 h bei 37 ° c inkubierenÜbertragen Sie die Proben auf ein live Cell imaging-Lösung. Abrufen von Bildern über eine digitale Farbkamera bei 10facher Vergrößerung mit einem inversen Mikroskop mit FITC und Texas Red-Filter, und analysieren Sie mittels Bildanalyse-Software. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie drei Bilder von jedem Konstrukt für die Quantifizierung der Zellviabilität. Rentabilität, basierend auf dem Verhältnis von lebenden Zellen, Gesamtzahl der Zellen zu berechnen. Analysieren Sie die Daten über eine einfache ANOVA, gefolgt von Tukey multiple Vergleiche-Test. 4. Bioprinting der Knorpel Analoga mit einem einzigen Zelltyp Zeichnen Sie ein 3D-Modell des gewünschten Gewebes analog. Umwandeln einer Datei Gcode für Bioprinting und laden Sie die Datei Gcode auf dem Bioprinter1.Hinweis: In diesem Protokoll wurde eine quadratische Struktur mit Maße 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 als STL-Datei exportiert. Eine Gcode-Datei wurde von der Gitterstruktur mit folgenden Einstellungen generiert: Schichtdicke, 0,3 mm; Füllung Muster, geradlinig; Ausfachung Dichte, 25 %; 10 mm/s Geschwindigkeit. Isolieren Sie und Tiefgefrieren Sie primären menschlichen nasale Knorpelzellen (hNC) von Patienten nach dem referenzierten Protokoll Nr.1. Tauen Sie auf und erweitern Sie kryokonservierten hNCs und einmal in der Monolayer Kultur mit standard Nährmedium bei 37 ° C. Zellen am Zusammenfluss von 80-90 % mit 0,5 % Trypsin/EDTA-Lösung zu lösen und zählen mit einem Trypan blau Ausgrenzung Protokoll. Alle Experimente wurden mit hNCs in der Passage 2 durchgeführt. Aufschwemmen der hNCs 100 x 106 Zellen/ml innerhalb von 300 µL Kulturmedium mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Penicillin-Streptomycin und 50 µg/mL Ascorbinsäure, in Vorbereitung für die Mischung mit den Bioink ergänzt. Mischung die hNC-Zellsuspension in einem Nanocellulose/Alginat basiert Bioink folgenden die Passive mischen Einheit Protokoll im Verhältnis 10:1 Bioink:cell Federung, eine endgültige Zellkonzentration von 9 x 106 Zellen/mL zu erhalten. Sicherstellen Sie, dass die Bioprinter über UV-Exposition und wischen sich mit 70 % Ethanol sterilisiert wird. Sterilität zu erhalten, indem man in eine laminare Strömung Kabinett. Die Kartuschen mit den Bioink/Zelle Aussetzung Mischungen sterile drucken Düsen beimessen und in die Bioprinter einfügen. Kalibrieren Sie den Bioprinter entweder manuell oder durch die Protokolle für den Drucker spezifisch. Stimmmuster der Gitter-strukturiert, Zelle-beladenen Konstrukte, die mit den folgenden Parametern Druck: 25G konische Düse mit einem Druck von 25 kPa. Stimmmuster zellfreie Konstrukte (gemischt mit Zelle Medium enthält keine Zellen) als Kontrolle. Vernetzen Sie die Konstrukte durch Hinzufügen einer Ionenlösung 100 mm CaCl2 für 5 min. Spülen die Konstrukte zu und inkubieren Sie in Kulturmedium unter standard Kulturbedingungen (37 ° C, 5 % CO2und 95 % Relative Luftfeuchtigkeit). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten oder dritten Tag. Sammeln Sie Proben zur histologischen Untersuchung bei 2 und 4 Wochen. Führen Sie die Proben für die GAG-Produktion mit Alcian Bläue18zu Flecken. 5. Bioprinting des Haut-Analoga mit zwei Zelltypen Zeichnen Sie ein 3D-Modell des gewünschten Gewebes analoge und umwandeln in eine Datei Gcode für Bioprinting. Laden Sie die Gcode-Datei auf die Bioprinter.Hinweis: In diesem Protokoll wurde eine quadratische Struktur mit Maße 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 als STL-Datei exportiert. Dann eine Gcode-Datei von der Gitterstruktur mit folgenden Einstellungen generiert wurde: Schichtdicke, 0,3 mm; Füllung Muster, geradlinig; Ausfachung Dichte, 25 %; 10 mm/s Geschwindigkeit. Bereiten Sie die Zellen zum Mischen in der Bioink für Bioprinting. Für die Herstellung von Haut-Analoga wurden zwei Zelltypen eingesetzt. Die zwei Zelltypen wurden in die Bioink und Bioprinting gemischt. Erhalten Sie primär HDF. Pflegen Sie diese Zellen in DMEM Wachstumsmedien ergänzt mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Penicillin-Streptomycin und 50 µg/mL Ascorbinsäure. Zellen am Zusammenfluss von 80-90 % mit 0,5 % Trypsin/EDTA Lösung und Graf zu lösen. Isolieren Sie und Tiefgefrieren Sie primäre hNC von Patienten nach dem referenzierten Protokoll Nr.1. Auftauen und kryokonservierten hNCs in Monolayer Kultur zu erweitern. Zellen am Zusammenfluss von 80-90 % mit 0,5 % Trypsin/EDTA Lösung und Graf zu lösen. Beide Zelltypen 100 x 106 Zellen/ml innerhalb von Wachstumsmedien aufzuwirbeln. Mischen Sie die Zellsuspensionen zusammen im Verhältnis 1:1, eine totale Endkonzentration von 100 x 106 Zellen/mL in 300 µL der Medien zu erreichen. Mischung 50: 50-Zellsuspension HDF und hNC in einem Nanocellulose/Alginat basiert Bioink folgenden die Passive mischen Einheit Protokoll im Verhältnis 10:1 Bioink:cell Federung, eine endgültige Zellkonzentration von 9 x 106 Zellen/mL zu erhalten. Sicherstellen Sie, dass die Bioprinter sterilisiert wird oder sich in einem Laminar-Flow Kabinett befindet zu Sterilität. Die Kartuschen mit den Bioink/Zelle Aussetzung Mischungen sterile drucken Düsen beimessen und in die Bioprinter einfügen. Kalibrieren der Bioprinter entweder manuell oder die Protokolle für den Drucker spezifisch. Stimmmuster der Gitter-strukturiert, Zelle-beladenen Konstrukte, die mit den folgenden Parametern Druck: 25G konische Düse mit einem Druck von 25 kPa. Stimmmuster zellfreie Konstrukte (gemischt mit Zelle Medium enthält keine Zellen) als Kontrolle. Vernetzen Sie die Konstrukte durch Hinzufügen einer Ionenlösung 100 mm CaCl2 für 5 min. Spülen die Konstrukte zu und inkubieren Sie in Kulturmedium unter standard Kulturbedingungen (37 ° C, 5 % CO2und 95 % Relative Luftfeuchtigkeit). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten oder dritten Tag. Sammeln Sie Proben zur histologischen Untersuchung bei 2 und 4 Wochen. Färben Sie die Proben für Kollagen ich Produktion mit einem Masson trichrome Fleck19.