Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa humana da Universidade de Chalmers. Nota: Todas as etapas devem ser executadas dentro de uma armário de biossegurança estéril. 1. preparação de materiais de consumo, Bioink e células Obter duas seringas, uma seringa (Figura 1um) é a suspensão de células, enquanto a outra seringa é para o bioink (Figura 1b). Obter uma estéril passiva unidade de mistura (Figura 1c) que pode ser acoplada com seringas duas através de uma conexão de fechamento de Luer. Obter uma unidade de distribuição (Figura 1d) que pode expulsar um volume de duas seringas esterilizadas simultaneamente a uma velocidade controlada.Nota: A relação de mistura utilizada neste estudo é de 10:1. Portanto, use uma seringa de 12 mL e uma seringa de 1 mL, conforme exigido pela unidade de mistura 1:10. Obter um cartucho estéril (Figura 1e) e um conector de fechamento de Luer fêmea-fêmea estéril para misturado diretamente a suspensão bioink e célula em. Obter ou preparar o bioink para misturar-se com uma suspensão de células.Nota: No presente protocolo, foi utilizado um bioink de nanocellulose/alginato com base. Este bioink é reticulado através da adição de uma solução estéril 100 mM CaCl2 post de impressão. Separar as células usando uma solução de tripsina/EDTA 0,5% e conte o número total de células usando o de método de exclusão azul trypan17.Nota: No presente protocolo, fibroblastos humanos foram utilizados. Determine a densidade de pilha que é desejada na construção final impressa. Calcule usando as seguintes equações a concentração das células colhidas que devem ser diluídos para alcançar esta densidade de final de célula de destino.Nota: No presente protocolo, foi utilizada uma densidade de célula final de 5 x 106 células/mL. Selecione uma concentração de célula desejado para os experimentos: Ccélula (células/mL). Calcule a quantidade de bioink necessário, Vbioink, com base no número total de construções desejado: Vbioink = × Vconstruir NContructs Nota: por exemplo, o volume de bioink por construção é 100 µ l. Se 30 construções são impressos, então, o volume de bioink necessário é 3 mL. Calcule o número de células necessárias: Ncélulas = Ccélula (1,1 × Vbiolink) Ressuspender as células (Ncélulas) em 1/10th o volume da bioink: Vsuspensão de células = 0,1 × Vbiolink Nota: por exemplo, se Vbioink = 3 mL, então Vsuspensão de células = 0,1 × 3 mL = 0,3 mL 2. mistura de suspensão de células e Bioink Transferi a suspensão de células para a seringa de suspensão celular. Transferir o bioink para outra seringa ou obter uma seringa contendo o bioink. Puxe o êmbolo da seringa bioink e inserir a seringa na unidade de distribuição. Posicione a unidade verticalmente com o bloqueio conector Luer para cima (Figura 1f1). Puxe o êmbolo da seringa célula para um comprimento semelhante como a seringa de bioink e inserir a unidade de distribuição (Figura 1f2). Fixe as duas seringas para a unidade de mistura rodando os conectores Luer lock (Figura 1f3). Prime o sistema de mistura empurrando na unidade aplicadora para expulsar o ar na seringa. Pare a escorva antes a solução atingindo o conector Luer-lock (Figura 1g4). Após a preparação, anexe o cartucho de enchimento até o fim da unidade misturadora através do conector Luer de bloqueio (Figura 1g5). Certifique-se de que o êmbolo no cartucho de enchimento é no fundo antes da penhora. Lentamente, comprima (Figura 1h6) unidade aplicadora para misturar a suspensão bioink e celular juntos dentro do cartucho (Figura 1i7). Empurre o êmbolo no enchimento cartucho para baixo com uma ponta de pipeta estéril para entrar em contato com a mistura de bioink-célula após a mistura. Manter a distribuição até comprimido para garantir que a mistura de célula/bioink não é expulsada volta para a unidade de mistura. Tampa do cartucho e bata levemente sobre a superfície de trabalho para mover quaisquer bolhas de ar para o topo do cartucho (final do pistão).Nota: Neste ponto, a mistura de célula/bioink está pronta para impressão. As seções a seguir irão delinear procedimentos impressão e aplicações específicas. 3. a determinação da viabilidade celular usando uma unidade de mistura em comparação com espátula Manual de mistura Desanexar fibroblastos humanos (trecho 7) com uma solução de tripsina/EDTA 0,5% na confluência de 80%, contar o número e Resuspenda em meio de cultura em densidade de células suficientes para obter uma concentração final após a mistura com o bioink (01:10 célula: bioink ratio) de 5 x 10 6 células/mL. Mistura de células para o bioink usando qualquer o passivo que mistura técnica unidade (etapa 2) ou através de espátula para avaliar o efeito de ambas as técnicas na viabilidade celular. Misture as células no bioink usando o passivo mistura técnica de unidade 1, 2, ou 3 vezes antes da dispensação em um molde para cross-linking usando 100 mM CaCl2.Nota: Para executar misturas adicionais, misture a célula/bioink diretamente em uma seringa, ao invés de um cartucho. Então remix da mistura através da unidade de mistura seguindo o protocolo anterior, mas sem o componente de seringa de célula. Misture as células em um bioink separado usando mecânica manual de mistura através de uma espátula para durações de 30, 60 ou 90 s. transferência as misturas (para cada tempo de mistura) em um molde para cross-linking usando 100 mM CaCl2. Transferi as amostras para um prato bem após a conclusão do cross-linking e cultura sob condições normais. Depois de 1 dia de cultura, lave as construções (n = 3-4 por grupo) no meio de cultura celular isento de soro de 30 min. manchar as células as construções com uma solução de coloração (4 µM calceína AM, 1 µM Ethidium homodímero-1) por 30 min. Lave duas vezes adicionais e incubar as amostras em meio de cultura celular isento de soro para um total de 1 h a 37 ° C.Transferi as amostras para uma solução de imagens de células vivas. Adquirir imagens através de uma câmera digital colorida na ampliação de 10x usando um microscópio invertido com filtros FITC e Texas Red e analisar usando software de análise de imagem. Selecione aleatoriamente três imagens de cada construção para quantificação da viabilidade celular. Calcule a viabilidade com base na relação de células vivas ao número total de células. Analise os dados através de um One-Way ANOVA, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. 4. Bioprinting de análogos de cartilagem com um único tipo de células Desenhe um modelo 3D do tecido desejado analógico. Converter um arquivo Gcode para bioprinting e carregar o arquivo Gcode no bioprinter1.Nota: No presente protocolo, uma estrutura quadrada com dimensões 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 foi exportada como um arquivo STL. Um arquivo Gcode foi gerado da estrutura reticular usando as seguintes configurações: espessura de camada, 0,3 mm; padrão de preenchimento, retilíneo; densidade de enchimento, 25%; velocidade, 10 mm/s. Isolar e cryopreserve primários condrócitos humanos nasais (hNC) de pacientes seguindo o protocolo referenciado1. Descongelar e expanda hNCs criopreservado e, uma vez na cultura monocamada usando meio de cultura padrão 37 ° C. Separar células na confluência de 80-90% com uma solução de tripsina/EDTA 0,5% e contar usando um protocolo de exclusão de azul de Tripan. Todos os experimentos foram conduzidos usando hNCs no passage 2. Ressuspender o hNCs em 100 x 106 células/mL dentro de 300 µ l de meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina-estreptomicina de 1% e 50 µ g/mL o ácido ascórbico, em preparação para a mistura com o bioink. Mistura a hNC suspensão de células em um nanocellulose/alginato com base bioink seguinte protocolo de unidade em uma proporção de suspensão de 10:1 bioink:cell para obter uma concentração final de célula de 9 x 106 células/mL de mistura o passivo. Certifique-se de que o bioprinter é esterilizado através de exposição aos raios UV e limpeza para baixo com etanol a 70%. Manter a esterilidade, colocando em um fluxo laminar do armário. Anexar os bocais de impressão estéril para os cartuchos contendo as misturas de suspensão bioink/célula e insira o bioprinter. Calibre o bioprinter manualmente ou pelos protocolos específicos para a impressora. Bioprint o retículo-estruturado, construções de célula-carregado usando os seguintes parâmetros de impressão: bocal cónico de 25G a uma pressão de 25 kPa. Bioprint célula livre de construções (misturadas com meio celular contendo sem células) como um controle. Cross-link as construções, adicionando uma solução iônica de 100 mM CaCl2 5 min. enxaguar as construções e incubar em meio de cultura sob condições padrão de cultura (37 ° C, 5% de CO2e 95% de humidade relativa). Mude a mídia cada segundo ou terceiro dia. Colete amostras para análise histológica em semanas 2 e 4. Manche as amostras para a produção de mordaça usando uma mancha azul de Alcian18. 5. Bioprinting de análogos de pele com dois tipos de células Desenhar um modelo 3D do tecido desejado analógico e converter para um arquivo Gcode para bioprinting. Carrega o arquivo Gcode sobre o bioprinter.Nota: No presente protocolo, uma estrutura quadrada com dimensões 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 foi exportada como um arquivo STL. Em seguida, um arquivo Gcode foi gerado da estrutura reticular usando as seguintes configurações: espessura de camada, 0,3 mm; padrão de preenchimento, retilíneo; densidade de enchimento, 25%; velocidade, 10 mm/s. Prepare as células para mistura com à bioink para bioprinting. Para a preparação de análogos de pele, foram utilizados dois tipos de células. Os tipos de dois célula foram misturou o bioink e bioprinting. Obter o HDF primário. Manter estas células em meios de crescimento DMEM suplementados com 10% de soro fetal bovino, penicilina-estreptomicina de 1% e 50 µ g/mL de ácido ascórbico. Separe células na confluência de 80-90% com uma solução de tripsina/EDTA 0,5% e a contagem. Isolar e cryopreserve hNC primário de pacientes seguindo o protocolo referenciado1. Descongelar e expandir hNCs criopreservado em cultura monocamada. Separe células na confluência de 80-90% com uma solução de tripsina/EDTA 0,5% e a contagem. Resuspenda os dois tipos de célula em 100 x 106 células/mL dentro de meios de crescimento. Misture as suspensões celulares juntos na proporção de 1:1 para obter uma concentração final de total de 100 x 106 células/mL em 300 µ l de mídia. Mistura a suspensão de células de 50: 50 de HDF e hNC em um nanocellulose/alginato com base bioink seguinte protocolo de unidade em uma proporção de suspensão de 10:1 bioink:cell para obter uma concentração final de célula de 9 x 106 células/mL de mistura o passivo. Certifique-se que o bioprinter é esterilizado ou é colocado em um fluxo laminar do armário para manter a esterilidade. Anexar os bocais de impressão estéril para os cartuchos contendo as misturas de suspensão bioink/célula e insira o bioprinter. Calibrar o bioprinter também manualmente ou os protocolos específicos para a impressora. Bioprint o retículo-estruturado, construções de célula-carregado usando os seguintes parâmetros de impressão: bocal cónico de 25G a uma pressão de 25 kPa. Bioprint célula livre de construções (misturadas com meio celular contendo sem células) como um controle. Cross-link as construções, adicionando uma solução iônica de 100 mM CaCl2 5 min. enxaguar as construções e incubar em meio de cultura sob condições padrão de cultura (37 ° C, 5% de CO2e 95% de humidade relativa). Mude a mídia cada segundo ou terceiro dia. Colete amostras para análise histológica em semanas 2 e 4. Manchar as amostras de colágeno produção usando de tricromo de Masson, um19.