軟骨と皮膚組織類縁ミキシング ユニット Bioink Precellularization の小説のパッシブ バイオプリンティング

このプロトコル ・ チャーマーズ大学人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。 注: すべての手順、滅菌バイオ セーフティ キャビネット内で行う。 1. 消耗品、Bioink、およびセルの準備 注射器 2 を取得、1 シリンジ (図 1、) は、細胞懸濁液、その他の注射器は、bioink (図 1b)。 ルアー ロック接続経由でデュアル シリンジと結び付けることができる滅菌パッシブ混合装置 (図 1c) を取得します。 制御された速度で同時に滅菌注射器 2 からボリュームを押し出すことができます調剤ユニット (図 1d) を取得します。注: この研究で利用する混合比は 10:1 です。したがって、10:1 の混合ユニットで必要に応じて 12 mL 注射器や 1 mL 注射器を使用します。 滅菌カートリッジ (図 1e) と直接に bioink と細胞懸濁液を混合する滅菌メス-メス ルアー ロック コネクタを取得します。 取得または細胞懸濁液とをブレンドするため、bioink を準備します。注: このプロトコル ナノセルロース/アルギン酸ベース bioink が利用されました。この bioink は、ポスト印刷滅菌 100 mM CaCl2ソリューションの追加により架橋です。 0.5%/トリプシン EDTA 溶液を使用してセルをデタッチして、トリパン ブルー排除法17を使用してセルの合計数をカウントします。注: このプロトコルで線維芽細胞が利用されました。 最終的な印刷の構成のどのような細胞密度が必要なを決定します。このターゲットの最終的な細胞密度を達成するために希釈する必要があります収穫細胞濃度次の方程式を使用して計算します。注: このプロトコル 5 x 106セル/mL の最終的な細胞密度が利用されました。 実験の目的のセルの濃度を選択: Cセル(セル/mL)。 Bioink 必要に応じて、 Vbioink、目的の構成要素の合計数に基づいて量を計算します。 Vbioink V構築× NContructsを =注: たとえば、コンストラクトあたり bioink の量は 100 μ L です。30 構造を印刷する場合は、必要な bioink 体積は 3 mL です。 必要なセルの数を計算します。 Nセル Cセル(1.1 × Vバイオリンク) を = 1/10th bioink の容積の細胞 (N細胞) を再懸濁します。 V細胞懸濁液= 0.1 × Vバイオリンク注: たとえば場合、Vbioink V細胞懸濁液3 mL = = 0.1 × 3 mL = 0.3 mL 2. 細胞懸濁液と Bioink の混合 細胞懸濁液の注射器に細胞懸濁液を転送します。 別の注射器に、bioink を転送または、bioink の入った注射を取得します。 Bioink シリンジのプランジャーを引き、注射器を調剤ユニットに挿入します。ルアー ロック コネクタ上向き (図 1f1) と垂直方向にユニットを配置します。 Bioink 注射器と同じような長さに細胞に注射器のピストンを引いて、調剤ユニット (図 1f2) 挿入します。 ルアー ロック コネクタ (図 1f3) をねじることによって混合のユニットに両方の注射器を取り付けます。 プライム調剤ユニットに注射器で空気を押し出すプッシュすることによって混合のシステム。ソリューション (図 1g4) ルアーロックに達する前にプライミングを停止します。 プライミング後ルアー ロック コネクタ (図 1g5) 経由で混合の単位の末尾に充填カートリッジを取り付けます。添付ファイルの前に下部充填カートリッジでプランジャーが確実します。 ゆっくりとカートリッジ (図 1i7) に bioink、細胞懸濁液を一緒に混合する調剤ユニット (図 1h6) を圧縮します。 充填カートリッジは、bioink 細胞の混合物を混合後連絡する滅菌ピペット先端部を下方にプランジャーを押してください。セル/bioink 混合物は混合のユニットに押し出されないように圧縮まで調剤してください。 キャップ、カートリッジ、カートリッジ (ピストン側) の上に空気の泡を移動するのには、作業面に軽きます。注: この時点で、セル/bioink 混合物は印刷用に準備です。以下のセクションには、特定のアプリケーションと印刷手順が概説されます。 3. 手動ヘラ混合と比較して混合装置を使用して細胞生存率の定量 80% 合流で 0.5%/トリプシン EDTA 溶液でひと繊維芽細胞 (通路 7) をデタッチし、数を数える、培地で培養後、bioink とブレンドすると最終的な濃度を達成するために十分な細胞密度で再懸濁します (1:10 セル: bioink 比) 5 x 10 の6セル/mL。 ミキシング ユニット (ステップ 2) どちらか受動態を使用して bioink または両者の細胞生存率に及ぼす影響を評価するためのヘラでセルをブレンドします。 ミキシング ユニット 1、2、または 3 回 100 ミリメートル CaCl2を使用して架橋用の金型に塗布する前にパッシブを使用して bioink にセルをブレンドします。注: 追加ブレンドを実行するためには、注射器ではなく、カートリッジに直接セル/bioink をミックスします。その後、以前のプロトコルに従う混合ユニットを介して、細胞注射器コンポーネントなしのブレンドをリミックスします。 手巻き 100 mM CaCl2を使用して架橋用の金型に (各の混合時間) の混合物 30、60 日、90 s. 転送の期間のヘラを介してミキシングを使用して別の bioink にセルをブレンドします。 ウェル プレートに架橋し、標準的な条件の下で文化の完成後サンプルを転送します。 文化の 1 日後の構成体を洗う (n = グループあたり 3-4) 30 分の無血清培地の染色液の構造で細胞を染色 (4 μ M カルセイン AM、1 μ M の ethidium によってホモ-1) 30 分間。 2 つの追加の時間を洗浄し、37 ° C で 1 時間の合計のための無血清培地のサンプルをインキュベートライブセル イメージング ソリューションにサンプルを転送します。 FITC とテキサス赤フィルターを用いた倒立顕微鏡 10 倍の倍率でデジタル カラー カメラを介して画像を取得し、画像解析ソフトウェアを使用して分析します。 ランダムに細胞生存率の定量化のための各構成要素から 3 つの画像を選択します。 生きているセルにセルの合計数の比に基づく生存率を計算します。テューキーの多重比較検定が続く一方通行 ANOVA を使用してデータを分析します。 4. 単一の細胞型で軟骨類縁体のバイオプリンティング アナログの目的の組織の 3 D モデルを描画します。バイオプリンティングの Gcode ファイルに変換し、bioprinter1Gcode ファイルをロードします。注: このプロトコルでは、寸法 4.8 × 4.8 × 0.9 mm3正方形の構造は、STL ファイルとしてエクスポートされました。Gcode ファイルは、次の設定を使用して格子構造の生成された: 層の厚さ、0.3 mm;インフィル パターン、直線;面材密度、25%;速度 10 mm/s。 分離し、次の参照先のプロトコル1患者からプライマリ人間鼻軟骨 (hNC) を凍結します。 融解し凍結 hNCs を展開し、37 ° C で標準培養液を用いた単層培養で一度展開80-90% 0.5%/トリプシン EDTA 溶液合流点で細胞をデタッチして、トリパン ブルー排除プロトコルを使用してカウントします。通路 2 hNCs を使用してすべての実験を行った。 100 x 106セル/ml 300 μ L、bioink とブレンドするための準備として、50 μ g/mL アスコルビン酸、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、10% 牛胎児血清を添加した培地の内、hNCs 再懸濁します。 ブレンド ナノセルロース/アルギン酸に hNC 細胞懸濁液は、混合装置プロトコル、最終的な細胞濃度が 9 x 106セル/mL の 10:1 bioink:cell 懸濁液比でパッシブを bioink 次に基づいています。 Bioprinter は殺菌紫外線暴露とワイプを介してダウン 70% エタノールを確認します。層流の場合のキャビネットを置くことによって無菌性を維持します。 Bioink/細胞懸濁液のブレンドを含むカートリッジに滅菌印刷ノズルを接続し、bioprinter 挿入します。 手動で、またはプリンターに固有のプロトコルによって、bioprinter を調整します。 Bioprint 格子、次の印刷パラメーターを使用してセルを含んだ構造: 25 kPa の圧力で 25 G 円錐ノズル。Bioprint 無細胞構造 (細胞用培地のセルを含まない配合) コントロールとして。 100 mM CaCl2 5 分すすぎのためのイオンのソリューション構成を追加することによって、構造を架橋し、培地 (37 ° C、5% CO2、および相対湿度 95%) の標準的な培養条件下で孵化させなさい。すべての 2 番目または 3 日目のメディアを変更します。 週 2 と 4 では、組織学的解析のためのサンプルを収集します。アルシアン青染色18を使用してギャグ用サンプルを染色します。 5. 2 種類の細胞と皮膚の類縁体のバイオプリンティング アナログ目的組織の 3 D モデルを描画し、バイオプリンティングの Gcode ファイルへ変換します。上の bioprinter Gcode ファイルをロードします。注: このプロトコルでは、寸法 4.8 × 4.8 × 0.9 mm3正方形の構造は、STL ファイルとしてエクスポートされました。Gcode ファイルは、次の設定を使用して格子構造の生成された、: 層の厚さ、0.3 mm;インフィル パターン、直線;面材密度、25%;速度 10 mm/s。 バイオプリンティングの bioink ブレンドのセルを準備します。皮膚類縁体の作製、2 つのセル型活かされています。2 つのセル型は、bioink、バイオプリンティングにブレンドされました。 主な HDF を取得します。50 μ G/ml アスコルビン酸、1% ペニシリン-ストレプトマイシン, 10% 牛胎児血清を添加した DMEM 成長媒体のこれらのセルを維持します。80-90% 0.5%/トリプシン EDTA 溶液およびカウントを用いて合流でセルをデタッチします。 分離し、次の参照先のプロトコル1患者からプライマリ hNC を凍結します。解凍し、単層培養による凍結 hNCs を展開します。80-90% 0.5%/トリプシン EDTA 溶液およびカウントを用いて合流でセルをデタッチします。 100 × 106セル/mL の成長媒体内で両方の細胞の種類を再懸濁します。100 x 106セル/mL メディアの 300 μ L の最終濃度を達成するために 1:1 の比率で一緒に細胞懸濁液を混ぜます。 ブレンドの HDF と hNC ナノセルロース/アルギン酸に 50: 50 細胞懸濁液は混合装置プロトコル、最終的な細胞濃度が 9 x 106セル/mL の 10:1 bioink:cell 懸濁液比でパッシブ bioink 次を基づいています。 Bioprinter 滅菌は無菌性を維持するキャビネット層流に配置されることを確認します。 Bioink/細胞懸濁液のブレンドを含むカートリッジに滅菌印刷ノズルを接続し、bioprinter 挿入します。 手動でどちらかの bioprinter を調整またはプリンターに固有のプロトコル。 Bioprint 格子、次の印刷パラメーターを使用してセルを含んだ構造: 25 kPa の圧力で 25 G 円錐ノズル。Bioprint 無細胞構造 (細胞用培地のセルを含まない配合) コントロールとして。 100 mM CaCl2 5 分すすぎのためのイオンのソリューション構成を追加することによって、構造を架橋し、培地 (37 ° C、5% CO2、および相対湿度 95%) の標準的な培養条件下で孵化させなさい。すべての 2 番目または 3 日目のメディアを変更します。 週 2 と 4 では、組織学的解析のためのサンプルを収集します。コラーゲンのサンプルを汚す私マッソンのヒアリン汚れ19を使用して生産します。