Bioprinting de cartílago y piel análogos de tejido utilizando un pasivo novela mezcla de unidad técnica de Bioink Precellularization

Este protocolo sigue las directrices del Comité de ética de investigación humana de la Universidad de Chalmers. Nota: Todas las medidas deben realizarse dentro de un gabinete de bioseguridad estéril. 1. preparación de las células, Bioink y consumibles Obtener dos jeringas, una jeringa (figura 1a) es para la suspensión de células, mientras que la otra jeringa es para bioink (figura 1b). Obtener una unidad mezcladora pasiva estéril (figura 1c) que puede acoplarse con jeringas duales a través de una conexión de la cerradura de Luer. Obtener una unidad de dispensación (figura 1d) que puede sacar un volumen de dos jeringas estériles simultáneamente a una velocidad controlada.Nota: La proporción de mezcla utilizada en este estudio es de 10:1. Por lo tanto, utilizar una jeringa de 12 mL y una jeringa de 1 mL como requerido por la unidad de mezcla 10:1. Obtener un cartucho estéril (figura 1e) y un estéril conector de cierre Luer hembra-hembra mezclado directamente la suspensión bioink y celular en. Obtener o preparar el bioink para la mezcla con una suspensión.Nota: En el presente Protocolo, se utilizó un bioink de nanocellulose/alginato basado. Este bioink es reticulado por adición de una solución estéril 100 mM CaCl2 post impresión. Separar las células usando una solución de tripsina/EDTA 0.5% y cuente el número total de células mediante la exclusión azul de tripano método17.Nota: En este protocolo, se utilizaron fibroblastos humanos. Determinar qué densidad celular se desea en la construcción final del impresa. Calcular utilizando las siguientes ecuaciones la concentración de las células cosechadas que debe diluirse para lograr esta densidad de célula final de destino.Nota: En el presente Protocolo, se utilizó una densidad de célula final de 5 x 106 células/mL. Seleccione una concentración de células deseada para los experimentos: Ccelular (células/mL). Calcular la cantidad de bioink necesario, Vbioink, basado en el número total de construcciones deseado: Vbioink = Vconstruir × NContructs Nota: por ejemplo, el volumen de bioink por construir es 100 μl. Si se imprimen 30 construcciones, el volumen de bioink necesario es de 3 mL. Calcular el número de células necesarias: Nlas células = Ccelda (1,1 × Vbiolink) Resuspender las células (las célulasde N) en 1/10th el volumen de la bioink: Vsuspensión de la célula = 0,1 × Vbiolink Nota: por ejemplo, si Vbioink = 3 mL, entonces Vsuspensión de la célula = 0,1 × 3 mL = 0.3 mL 2. mezcla de la suspensión celular y Bioink Transferir la suspensión de células en la jeringa de suspensión celular. Transferencia de la bioink a otra jeringa u obtener una jeringa que contiene la bioink. Tire hacia atrás el émbolo de la jeringa bioink e Inserte la jeringa en la unidad dispensadora. Coloque la unidad verticalmente con el conector de cierre Luer hacia arriba (figura 1f1). Tire hacia atrás el émbolo de la jeringa de la célula a una longitud similar como la jeringa bioink e inserte en la unidad dosificadora (f2de lafigura 1). Coloque dos jeringas en la unidad de mezcla girando los conectores de la cerradura de Luer (f3de lafigura 1). Cebe el sistema de mezcla empujando la unidad dispensadora para sacar el aire en la jeringa. Detener la imprimación antes de la solución llegando a la cerradura de Luer (1 de figurag4). Después de preparar, colocar el cartucho de relleno hasta el final de la unidad de mezcla mediante el conector de cierre Luer (1 de figurag5). Asegúrese que el émbolo en el cartucho de relleno en la parte inferior antes de la fijación. Comprimir lentamente (figura 1h6) la unidad dispensadora para mezclar la suspensión bioink y cell en el cartucho (figura 1i7). Empujar el émbolo del cartucho de relleno hacia abajo con una punta de la pipeta estéril en contacto con la mezcla de bioink célula después de la mezcla. Mantener la dosificación hasta compactarse para que la mezcla de células/bioink no se saca en la unidad de mezcla. La tapa del cartucho y golpee suavemente sobre la superficie de trabajo para mover cualquier burbuja de aire en la parte superior del cartucho (extremo del pistón).Nota: En este punto, la mezcla celular/bioink está lista para la impresión. Las siguientes secciones esbozarán aplicaciones específicas y procedimientos de impresión. 3. determinación de la viabilidad de las células usando una unidad de mezcla en comparación con espátula Manual de mezcla Fibroblastos humanos (paso 7) con una solución de tripsina/EDTA 0.5% en 80% confluencia de separar, contar el número y resuspender en medio de cultivo a la densidad de células suficiente para lograr una concentración final después de mezclar con la bioink (1:10 cociente celular: bioink) de 5 x 10 6 células/mL. Mezcla de células en el bioink usando el pasivo ya sea mezcla técnica de la unidad (paso 2) o a través de la espátula para evaluar el efecto de ambas técnicas sobre la viabilidad celular. Las células se funden el bioink usando la voz pasiva mezcla técnica de la unidad 1, 2, o 3 veces antes de la distribución en un molde para el cross-linking con 100 mM de CaCl2.Nota: Para realizar mezclas adicionales, mezcle el celular/bioink directamente en una jeringa en lugar de un cartucho. Entonces remix la mezcla a través de la unidad de mezcla siguiendo el protocolo anterior pero sin el componente de la jeringa de la célula. Las células se mezclan en un bioink separado usando mecánica manual de mezcla mediante una espátula durante períodos de 30, 60 o 90 s. transferencia de las mezclas (por cada mezcla tiempo) en un molde para el cross-linking con 100 mM CaCl2. Transferir las muestras a una placa bien después de la finalización del cross-linking y cultivo bajo condiciones estándar. Después de 1 día de la cultura, lave las construcciones (n = 3-4 por grupo) en medio de cultivo celular sin suero durante 30 minutos la mancha las células en las construcciones con una solución de tinción (4 μm calceína AM, 1 homodímero de etidio μm-1) durante 30 minutos. Lavar dos veces más e incubar las muestras en medio de cultivo celular sin suero para un total de 1 h a 37 ° C.Transferir las muestras a una solución de imágenes de células vivas. Adquirir imágenes a través de una cámara color digital con 10 aumentos utilizando un microscopio invertido con filtro FITC y Texas Red y analizar utilizando software de análisis de imagen. Seleccionar al azar tres imágenes de cada constructo para la cuantificación de la viabilidad celular. Calcular la viabilidad basado en la relación de células vivas en número total de células. Analizar los datos a través de un ANOVA unidireccional seguida de prueba de comparaciones múltiples de Tukey. 4. Bioprinting de análogos de cartílago con un solo tipo de células Dibujar un modelo 3D del tejido deseado analógico. Convertir un archivo de Gcode para bioprinting y cargar el archivo de Gcode en el bioprinter1.Nota: En este protocolo, una estructura cuadrada con dimensiones 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 fue exportada como un archivo STL. Se genera un archivo de Gcode de la estructura del enrejado usando los siguientes valores: espesor de la capa, de 0,3 mm; patrón de relleno, rectilínea; densidad de relleno, 25%; velocidad, 10 mm/seg. Aislar y criopreservar condrocitos nasal humano primario (hNC) de los pacientes siguiendo el protocolo de referencia1. Descongelar y expanda hNCs criopreservados y, una vez en cultivo monocapa utilizando el estándar medio de cultivo a 37 ° C. Separar las células en la confluencia de 80-90% con una solución de tripsina/EDTA 0.5% y cuenta con un protocolo de exclusión azul de tripano. Todos los experimentos se realizaron utilizando hNCs en el paso 2. Resuspender el hNCs en 100 x 106 células/mL en 300 μL de medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal 10%, 1% de penicilina-estreptomicina y 50 μg/mL el ácido ascórbico, en preparación para la mezcla con la bioink. Mezcla la suspensión de células de hNC en un alginato de nanocellulose base bioink siguiente pasivo protocolo de unidad en una proporción de 10:1 bioink:cell suspensión para obtener una concentración celular final de 9 x 106 células/mL de mezcla. Asegúrese de que el bioprinter es esterilizada a través de la exposición Ultravioleta y limpie abajo con etanol al 70%. Mantener la esterilidad mediante la colocación en una cabina de flujo laminar de gabinete. Instale boquillas de impresión estériles a los cartuchos que contienen las mezclas de suspensión celular bioink e inserte en el bioprinter. Calibrar el bioprinter ya sea manualmente o por los protocolos específicos a la impresora. Bioprint la estructura de enrejado, construcciones cargadas de celulares usando los siguientes parámetros de impresión: boquilla cónica de 25G a una presión de 25 kPa. Bioprint celular libre de construcciones (mezcladas con medio celular no células) como control. Enlazará las construcciones mediante la adición de una solución iónica de 100 mM CaCl2 5 minutos enjuague los constructos e incubar en medio de cultivo bajo condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad relativa). Cambiar los medios de comunicación cada segundo o tercer día. Recoger muestras para análisis histológico en las semanas 2 y 4. Mancha de las muestras para la producción de mordaza con una mancha azul de Alcian18. 5. Bioprinting de piel análogos con dos tipos de células Dibujar un modelo 3D del tejido deseado analógico y convertirlos a un archivo Gcode para bioprinting. Cargue el archivo de Gcode en el bioprinter.Nota: En este protocolo, una estructura cuadrada con dimensiones 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 fue exportada como un archivo STL. Entonces se genera un archivo de Gcode de la estructura del enrejado usando los siguientes valores: espesor de la capa, de 0,3 mm; patrón de relleno, rectilínea; densidad de relleno, 25%; velocidad, 10 mm/seg. Preparar las células para mezclar en el bioink para bioprinting. Para la fabricación de análogos de la piel, se utilizaron dos tipos de células. Se mezclan los dos tipos celulares en el bioink y bioprinting. Obtener el principal HDF. Mantener estas células en medios de cultivo DMEM suplementados con 10% suero fetal bovino, penicilina-estreptomicina de 1% y 50 μg/mL de ácido ascórbico. Separar las células en la confluencia de 80-90% con una solución de tripsina/EDTA 0.5% y la cuenta. Aislar y criopreservar hNC primaria de pacientes siguiendo el protocolo de referencia1. Descongelar y ampliar hNCs criopreservados en cultivo monocapa. Separar las células en la confluencia de 80-90% con una solución de tripsina/EDTA 0.5% y la cuenta. Agite ambos tipos de células en 100 x 106 células/mL en medios de cultivo. Mezclar las suspensiones celulares juntos en una proporción de 1:1 para alcanzar una concentración final del total de 100 x 106 células/mL en 300 μL de medios de comunicación. Mezcla la suspensión de células de 50: 50 de HDF y hNC en un alginato de nanocellulose base bioink siguiente pasivo protocolo de unidad en una proporción de 10:1 bioink:cell suspensión para obtener una concentración celular final de 9 x 106 células/mL de mezcla. Asegúrese de que el bioprinter se esteriliza o se coloca en un flujo laminar gabinete para mantener la esterilidad. Instale boquillas de impresión estériles a los cartuchos que contienen las mezclas de suspensión celular bioink e inserte en el bioprinter. Calibrar el bioprinter ya sea manualmente o los protocolos específicos a la impresora. Bioprint la estructura de enrejado, construcciones cargadas de celulares usando los siguientes parámetros de impresión: boquilla cónica de 25G a una presión de 25 kPa. Bioprint celular libre de construcciones (mezcladas con medio celular no células) como control. Enlazará las construcciones mediante la adición de una solución iónica de 100 mM CaCl2 5 minutos enjuague los constructos e incubar en medio de cultivo bajo condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad relativa). Cambiar los medios de comunicación cada segundo o tercer día. Recoger muestras para análisis histológico en las semanas 2 y 4. Las muestras de colágeno de la mancha I producción de Tricrómico de Masson19.