Подложке хряща и аналогов ткани кожи, используя Роман пассивного смешивания единицы техники для Bioink Precellularization

Этот протокол соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований человеческого Чалмерского университета. Примечание: Все шаги должны выполняться в стерильных биобезопасности кабинета. 1. подготовка расходных материалов, Bioink, и клетки Получить две шприцы, один шприц(рис. 1) для суспензии клеток, в то время как другой шприц предназначен для bioink (рис. 1б). Получения стерильной пассивной смесительного узла (рис. 1c), который может использоваться в сочетании с двойной шприцев через соединение Luer lock. Получите дозирующее устройство (рис. 1d), который можно выдавливать тома из двух стерильных шприцев одновременно с контролируемой скоростью.Примечание: Смешивая коэффициент, используемые в данном исследовании составляет 10:1. Таким образом используйте 12 мл шприц и 1 мл шприц как предусмотрено блок смешивания 10:1. Стерильные картриджа (рис. 1e) и стерильные девушки-Luer блокировки разъем непосредственно смешанной bioink и клеток подвеска в получите. Получить или подготовить bioink для смешивания с суспензию клеток.Примечание: В настоящем Протоколе, использовался Наноцеллюлоза/альгината на основе bioink. Этот bioink сшитого путем добавления раствора стерильную 100 мм CaCl2 после печати. Отсоединить клетки, 0,5% раствором трипсина/ЭДТА и подсчитать общее количество клеток с использованием Трипановый синий исключения метод17.Примечание: В настоящем Протоколе, были использованы фибробластов. Определите, какие плотность клеток желательно в окончательной печатной конструкции. Вычислите с помощью следующих уравнений концентрация заготовленных клеток, которые должны быть ослаблены достичь этой цели окончательный клеток плотности.Примечание: В настоящем Протоколе, был использован плотность окончательный клеток 5 х 106 клеток/мл. Выберите нужную ячейку концентрации для экспериментов: Cклетки (клеток/мл). Рассчитайте количество bioink необходимости, Vbioink, основанный на общее количество требуемой конструкции: Vbioink = V,построить × NContructs Примечание: К примеру, объем bioink в конструкции — 100 мкл. Если 30 конструкции печатаются, bioink объем необходимых-3 мл. Подсчитать количество ячеек необходимо: Клетки N = Cклеток (1.1 × Vbiolink) Ресуспензируйте клетки (клеткиN) в 1/10й объем bioink: Vсуспензию клеток = 0.1 × VБиоЛинк Примечание: К примеру если Vbioink = 3 мл, а затем Vсуспензию клеток = 0.1 × 3 = 0,3 мл 2. перемешивание суспензии клеток и Bioink Передача суспензию клеток в клетки подвеска шприц. Передавать bioink другой шприц или получить шприц с bioink. Потяните поршень шприца bioink и вставьте шприц в дозатор. Расположите устройство вертикально с Luer блокировки разъем вверх (рис. 1f1). Потяните поршень шприца клетки к же длины, как bioink шприц и вставьте дозатор (f2рис. 1). Придаем блок смешивания обоих шприцы путем скручивания Luer lock разъемы (Рисунок 1f3). Премьер система смешивания, нажав на дозатор для выдавливания воздух в шприц. Остановите грунтовки до решения, достигнув люэровского (g4рис. 1). После грунтования, прикрепите картридж наполнения до конца смесительного узла через разъем замком Luer (Рисунок 1g5). Убедитесь, что поршень в заполнение картриджа в нижней части до вложения. Медленно сжимайте (Рисунок 1h6) дозирующее устройство для микширования подвеска bioink и клеток в патрон (i7рис. 1). Вставьте поршень наполнения картриджа вниз с наконечником стерильные пипетки связаться смеси bioink клеток после смешивания. Держите дозирования до тех пор, пока сжаты, чтобы убедиться, что клетки/bioink смесь выдавливается не обратно в блок смешивания. Крышка картриджа и осторожно нажмите на рабочей поверхности для перемещения воздушные пузыри, в верхней части картриджа (поршневые конце).Примечание: В этой точке, клетки/bioink смесь готова к печати. В следующих разделах будут рассматриваются конкретные приложения и печати процедуры. 3. определение жизнеспособности клеток с помощью блок смешивания, по сравнению с ручной шпатель смешивания Отсоединить фибробластов (проход 7) с 0,5% раствором трипсина/ЭДТА при впадении в 80%, подсчет и Ресуспензируйте в питательной среды на достаточную плотность клеток для достижения конечной концентрации после смешивания с bioink (1:10 соотношение клеток: bioink) 5 x 10 6 клеток/мл. Смесь клеток в bioink, с помощью пассивного, смешивания единицы техники (шаг 2) или с помощью шпателя для оценки влияния обоих методов на жизнеспособность клеток. Смесь клетки в bioink, с помощью пассивного смешивания единицы техники 1, 2, или 3 раза до розлива в форму для сшивки с помощью 100 мм2CaCl.Примечание: Для выполнения дополнительные смесей, смешайте клеток/bioink непосредственно в шприц, вместо того, чтобы картриджа. Затем ремикс смесь через блок смешивания после предыдущий протокол, но без компонента шприц клеток. Смесь клетки в отдельный bioink, с помощью ручной механический, смешивания через лопаточкой для длительности передачи 30, 60 или 90 s. смеси (для каждого времени перемешивания) в форму для сшивки с помощью CaCl 100 мм2. Передача образцов хорошо пластины после завершения cross-linking и культуры при стандартных условиях. После 1 дня культуры, мыть конструкции (n = 3-4 в группе) в среде культуры клеток сыворотки бесплатно 30 мин запятнать клетки в конструкции с окрашивание раствора (4 мкм Флуорексон AM, 1 мкм Ethidium Антуану-1) за 30 мин. Вымойте еще два раза и Проинкубируйте образцы в сыворотки свободных клеток питательной среды для в общей сложности 1 ч при 37 ° C.Передача образцов изображений решение живой клетки. Получение изображений через цифровой цветной камеры при 10-кратном с помощью инвертированного микроскопа с FITC и Техас красный фильтры и анализировать с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Случайным образом выберите три изображения из каждой конструкции для количественной оценки жизнеспособности клеток. Вычислите жизнеспособности, основанные на соотношении живых клеток на общее количество клеток. Анализ данных через односторонний дисперсионный анализ, следуют Тьюки множественные сравнения теста. 4. подложке хряща аналогов с типом одну ячейку Нарисуйте 3D модель желаемого ткани Аналоговый. Преобразовать в файл Gcode для подложке и загрузить файл Gcode на bioprinter1.Примечание: В настоящем Протоколе, квадратный структуры с размеры 4,8 х 4,8 х 0,9 мм3 было экспортировано как файл STL. Gcode файл был создан решетки структуры, используя следующие параметры: толщина слоя, 0,3 мм; шаблон заполнения, прямолинейные; плотность заполнения, 25%; скорость, 10 мм/сек. Изолировать и криоконсервировать первичного человеческого носа хондроцитов (hNC) от пациентов после указанный протокол1. Размораживание и расширять криоконсервированных hNCs и расширять один раз в монослойном культивировании с использованием стандартных питательной среды на 37 ° C. Отсоединить клетки при впадении в 80-90% с 0,5% раствором трипсина/ЭДТА и рассчитывать, с помощью протокола Трипановый синий исключения. Все эксперименты проводились с использованием hNCs Пассаж 2. Ресуспензируйте hNCs на 100 х 106 клеток/мл в течение 300 мкл питательной среды, дополненная плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллин стрептомицином и аскорбиновой кислоты 50 мкг/мл, в рамках подготовки к смешиванию с bioink. Смесь hNC суспензию клеток в Наноцеллюлоза/альгината на основе bioink следующие пассивного смешивания протокол блока в соотношении 10:1 bioink:cell подвеска для получения окончательного клетки концентрация 9 х 106 клеток/мл. Убедитесь, что bioprinter обеззараживается через воздействие УФ лучей и уничтожить вниз с 70% этиловом спирте. Поддерживайте стерильность, поместив в поток Ламинарный шкаф. Придаем стерильные сопла печати картриджи, содержащие смеси подвеска bioink/клеток и вставьте в bioprinter. Калибровка bioprinter вручную или протоколы, относящиеся к принтеру. Bioprint решетка структурированные, клетки Ладена конструкций, с использованием следующих параметров печати: 25G Конусный наконечник при давлении 25 кПа. Bioprint клетки свободной конструкции (смешивается с ячейки носитель, содержащий ячейки не) как элемент управления. Перекрестные ссылки конструкции, добавляя ионных решения 100 мм CaCl2 для 5 минут промыть конструкции и инкубировать в среде культуры в условиях стандартной культуры (5% CO2, 37 ° C и относительной влажности 95%). Измените СМИ каждый второй или третий день. Сбор проб для гистологического анализа на недели 2 и 4. Пятно образцы для кляп производства с использованием Альциановый синий краситель18. 5. подложке кожи аналогов с двумя типами клеток Рисовать 3D-модель желаемого ткань аналоговые и конвертировать в файл Gcode на подложке. Загрузите файл Gcode на bioprinter.Примечание: В настоящем Протоколе, квадратный структуры с размеры 4,8 х 4,8 х 0,9 мм3 было экспортировано как файл STL. Затем Gcode файл был создан решетки структуры, используя следующие параметры: толщина слоя, 0,3 мм; шаблон заполнения, прямолинейные; плотность заполнения, 25%; скорость, 10 мм/сек. Подготовка клетки для смешивания в bioink на подложке. Для изготовления кожи аналогов были использованы два типа клеток. Типы клеток два были интегрированы в bioink и подложке. Получение первичной HDF. Сохранить эти клетки в среде DMEM роста СМИ дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллин стрептомицином и аскорбиновой кислоты 50 мкг/мл. Отсоедините клетки при впадении в 80-90% с 0,5% раствором трипсина/ЭДТА и счетчика. Изолировать и криоконсервировать первичной hNC от пациентов после ссылки протокола1. Размораживание и расширять криоконсервированных hNCs в монослойном культивировании. Отсоедините клетки при впадении в 80-90% с 0,5% раствором трипсина/ЭДТА и счетчика. Ресуспензируйте обоих типов клеток на 100 х 106 клеток/мл в течение роста средств массовой информации. Смешайте клеточных суспензий вместе в соотношении 1:1 для достижения окончательного общая концентрация 100 х 106 клеток/мл в 300 мкл средств массовой информации. Смесь суспензии клеток 50: 50 HDF и hNC в Наноцеллюлоза/альгината на основе bioink следующие пассивного смешивания протокол блока в соотношении 10:1 bioink:cell подвеска для получения окончательного клетки концентрация 9 х 106 клеток/мл. Убедитесь, что bioprinter обеззараживается или помещается в поток ламинарный кабинет для поддержания стерильности. Придаем стерильные сопла печати картриджи, содержащие смеси подвеска bioink/клеток и вставьте в bioprinter. Калибровки bioprinter либо вручную или протоколы, относящиеся к принтеру. Bioprint решетка структурированные, клетки Ладена конструкций, с использованием следующих параметров печати: 25G Конусный наконечник при давлении 25 кПа. Bioprint клетки свободной конструкции (смешивается с ячейки носитель, содержащий ячейки не) как элемент управления. Перекрестные ссылки конструкции, добавляя ионных решения 100 мм CaCl2 для 5 минут промыть конструкции и инкубировать в среде культуры в условиях стандартной культуры (5% CO2, 37 ° C и относительной влажности 95%). Измените СМИ каждый второй или третий день. Сбор проб для гистологического анализа на недели 2 и 4. Пятно образцы для коллагена я производства с использованием Masson trichrome пятно19.