Posicionamento adequado e a contenção de um membro posterior de ratos para concentrado de alta resolução de imagem de osso usando Microarquitetura na Vivo Microtomografia computadorizada

Este protocolo fornece os telespectadores com a primeira orientação detalhada para a anestesia adequada, colocação e retenção do rato durante na vivo µCT digitalização do membro hind. Essas diretrizes permitem que os utilizadores na vivo µCT sistemas de digitalização para obter alta resolução e imagens de alta qualidade da tíbia que pode ser processado para a quantificação da microarquitetura óssea 3-dimensional. Passos críticos no protocolo necessário para assegurar o correcto posicionamento e restrição envolvem a anestesia adequada de rato, bem como estendendo o membro posterior, longe de todas as outras estruturas críticas até é tenso, mas não em uma posição natural. Para resultados de imagem ideais, é imperativo que o rato ser anestesiada para um nível de relaxamento completo, e que reflexos palpebrais e pedais são perdidos. Além disso, deve abranger também a digitalização perna e o pé inteiro e tornozelo devem ser contidos em espuma. Os métodos descritos acima para obter um posicionamento da perna digitalização irão garantir que: 1) membros posteriores dos ratos dentro de um estudo são consistentemente orientados na mesma direção, permitindo assim que o feixe de raio-x para passar a mesma área de cada perna, pois ele gira ao redor da amostra; 2) movimento ambas voluntário e involuntário do membro hind não ocorrerá, assim, minimizando o potencial de artefatos de movimento interferir com a qualidade das imagens adquiridas; 3) obstruções de objetos (ou seja, a cauda) são impedidas, minimizando assim o potencial para efeitos de volume parcial produzir medidas imprecisas BMD e DTM. Estas orientações podem ser modificadas para cada rato individual, como a taxa de metabolismo de isoflurano e posicionamento pode variar dependendo da estirpe e corpo de tamanho ²². O mais comum na vivo varredura as máquinas é projetadas para pequenos modelos animais (ou seja, ratos, ratos, coelhos, porquinhos da Índia) e terá fases animais intercambiáveis para permitir a exploração de diferentes tamanhos de animais. Portanto, podem acomodar uma ampla gama de peso corporal.

Embora na vivo µCT digitalização licenças para o rato ser reposicionado e verificados novamente se as imagens que adquiriu a partir da digitalização inicial são de má qualidade, repetida digitalização irá expor o rato a doses adicionais de radiação e isoflurano anestesia para um período prolongado de tempo. Exposição de radiação repetidas mensal de 600 mGy focada para a tíbia de ratos durante quatro meses não causa efeitos adversos ao osso microarquitetura em comparação com o membro contralateral do posterior ¹, mas isto não verificar a segurança de duas varreduras repetidas em sucessão imediata. Outras limitações da técnica descrita incluem a necessidade de estender o membro posterior tenso com forças aplicadas a ele para mantê-lo ainda, que podem invocar algumas mudanças na estrutura óssea. Enquanto a severidade da contenção do membro hind durante a digitalização vai depender de cada objectivo da investigação, estudos prévios do nosso laboratório envolvendo mensal repetidas na vivo µCT imagem de um membro posterior resultaram em uma diferença na cortical microarquitetura parâmetro, excentricidade, em comparação com o membro posterior contralateral que não passam por extensão repetida, estabilização e digitalização ¹. Excentricidade é uma medida da forma elíptica do osso cortical e alterações em resposta a alterou a carga. Portanto, quando usar este método de posicionamento e de restrição do membro hind para repetidas na vivo µCT de imagem, consideração deve ser feita quando avaliar e interpretar alterações aos parâmetros de microarquitetura de carga.

Enquanto as orientações acima foram fornecidas para a geração de imagens e análise do tecido ósseo, pequenos ajustes no protocolo devem ser feitos quando a imagem de tecidos moles do membro hind. Especificamente, a maneira em que o membro posterior é estendido a partir do tronco e contido deve ser tomada em conta, como o atual procedimento deforma a orientação do tecido mole (músculo, tecido adiposo) em posicionamento anormal para a duração da verificação. Portanto, quando extrapolando este modelo para uso em imagens dos tecidos moles do membro hind, alguns ajustes devem ser feitos com a técnica de contenção para reduzir ou eliminar as alterações no posicionamento dos tecidos em relação um ao outro.

Além disso, as orientações foram escritas especificamente com base nas experiências do nosso grupo de pesquisa, no entanto, eles podem ser modificados para acomodar outros scanners µCT comercialmente disponíveis na vivo . Outros métodos sugeridos para posicionar e restringir o membro posterior podem estar disponíveis pelo fabricante do µCT na vivo , sistema de digitalização. Mais comercialmente disponível na vivo unidades µCT listam de poliestireno expandido, polipropileno e tubos plásticos com cera dental para segurar um saliente do pé como aceitáveis materiais e métodos para imobilizar a perna de digitalização. No entanto, o método apresentado neste protocolo fornecer mais controlado e consistente de posicionamento e contenção da perna digitalizada e, consistentemente produz imagens de alta qualidade. As diretrizes apresentadas no presente método requerem equipamento especializado necessário para a anestesia do rato, como um vaporizador, tubos, máscaras, câmaras de indução e oxigênio. Embora o equipamento esteja associado com um custo um pouco maior, em comparação com anestésicos injetáveis, permite que os pesquisadores a capacidade de rapidamente e precisamente induzir anestesia em profundidades específicas da consciência, que fornece uma vantagem sobre a alternativa métodos.

Usando as diretrizes descritas no presente método vídeo, pesquisadores utilizando tecnologias de alta resolução na vivo µCT para investigar a sua intervenção de interesse será capaz de corretamente e consistentemente orientar e conter um membro posterior de ratos para alta imagem de raio x de qualidade. Isso fornecerá um continuum em matéria de aquisição de imagens na vivo µCT e servir como um passo para otimizar a consistência e a precisão dentro de estudos e permitir comparações entre estudos na literatura. Da mesma forma, estes protocolos e métodos podem ser expandidos para uso em outras espécies de roedores, incluindo ratos, apesar de algumas mudanças serão necessárias ^2,10. Por exemplo, o apoio do pé no tubo de espuma pode incluir o tornozelo para minimizar a possibilidade de movimento da perna durante a verificação. Além disso, o pé completo vai caber no suporte da espuma. Assim, os dedos não se estendem do final do titular como fazem ao fixar o pé de um rato. Além disso, o corpo do rato não exige a mesma contenção com fita como o rato. Um cone de nariz menor pode ser usado para a manutenção de anestesia em ratos durante a verificação. Se um cone de nariz menor não estiver disponível, podemos garantir uma luva de nitrilo sobre o cone de nariz disponível e faça uma pequena incisão no porta-luvas para proporcionar um espaço que pode caber o nariz do rato para fornecer anestesia, mantendo uma vedação em volta do nariz.

Enquanto a tíbia proximal é o site principal da investigação de alterações no rato da microestrutura óssea, orientações para o posicionamento adequado e consistente de outros sites esqueléticos como o fêmur e vértebras lombares devem ser investigadas e estabelecidas para consistência na literatura. No entanto, quando a realização de futuras pesquisas envolvendo a imagem das vértebras lombares, considerações devem ser feitas como imagem da coluna vertebral fornece a exposição à radiação para os tecidos e órgãos circundantes.