Le positionnement et la retenue d’une patte de Rat pour l’imagerie ciblée haute résolution des os à l’aide de la micro-architecture In Vivo Micro-computed Tomography
Summary
Cet article indique au utilisateurs de scanners de micro-la tomodensitométrie (µCT) in vivo comment anesthésier, correctement positionner et immobiliser le membre postérieur d’un rat pour mouvement minimal au cours de l’imagerie à haute résolution du tibia. Il en résulte des images de haute qualité qui peuvent être traitées afin de quantifier précisément la microarchitecture osseuse.
Abstract
L’utilisation de in vivo micro-la tomodensitométrie (µCT) est un outil puissant qui implique l’imagerie non destructive des structures internes à des résolutions élevées dans des modèles animaux vivants. Cela permet une imagerie répétée du rongeur même au fil du temps. Cette fonctionnalité non seulement réduit le nombre total de rongeurs requis dans un dispositif expérimental et réduit ainsi la variation inter-sujet qui peut survenir, mais permet également aux chercheurs d’évaluer les réponses longitudinales et toute la vie à une intervention. Pour acquérir des images de haute qualité qui peuvent être traitées et analysées afin de quantifier plus précisément les résultats de la microarchitecture osseuse, utilisateurs de scanners de µCT en vivo doivent correctement anesthésier le rat et positionner et immobiliser le membre postérieur. Pour ce faire, il est impératif que le rat être anesthésiés à un niveau de relaxation complète, et que les réflexes pédales sont perdus. Ces lignes directrices peuvent être modifiés pour chaque rat individuel, comme le taux de métabolisme isoflurane peut varier selon la taille de la souche et le corps. La technique appropriée pour l’acquisition d’images in vivo µCT permet une mesure précise et cohérente de l’OS micro-architecture au sein et entre les études.
Introduction
L’utilisation de in vivo micro-la tomodensitométrie (µCT) est un outil puissant qui implique l’imagerie non destructive des structures internes à haute résolution en utilisant les modèles de rongeurs. La nature non destructifs de in vivo µCT permettant des recherches répétées d’imagerie du rongeur même au fil du temps. Cette fonctionnalité non seulement réduit le nombre total de rongeurs requis dans un dispositif expérimental et réduit ainsi la variation inter-sujet qui peut survenir, mais permet également aux chercheurs de comprendre les réactions à long terme à une intervention. Avec l’utilisation de répétées en vivo µCT, expériences sur des souris et des rats ont élucidé des changements développementaux pour la microarchitecture d’os et OS de densité minérale (BMD) tout au long de la durée de vie 1,,2,3 périodes ,4,5,6,7,8 ainsi que la réponse de la santé des os aux interventions comme alimentation 9,10, une ovariectomie 7,11 et agents pharmacologiques 8,12,13. BMD et microarchitecture osseuse à des sites squelettiques spécifiques, à savoir le tibia proximal, un fémur et des vertèbres lombaires, sont indicatifs de santé osseuse et du risque de fractures et sont donc les mesures primaires lors de la quantification des réponses à un intervention.
Acquisition d’images in vivo µCT implique les projections de radiographie bidimensionnelles absorbées à angles multiples, comme la source de rayons x et le détecteur tournent autour de l’animal sous enquête 14,15. La qualité de l’image résultante est tributaire de nombreux facteurs, y compris, mais non limité à : sélection des paramètres d’acquisition (c’est-à-dire, résolution spatiale, rayons x tension, ampérage, étape de rotation, filtre appliqué, durée d’exposition), limitations de le µCT Scanner (c.-à-d., axée sur le scanner artefacts tels que des artefacts de bague ou de la poussière qui provoquent des effets de volume formant des stries ou partielle) et un positionnement correct et retenue de l’animal. Les deux premiers de ces facteurs peuvent être manipulés dans une certaine mesure par l’utilisateur, selon la machine de balayage spécifique, les objectifs de l’étude et les corrections qui sont nécessaires pour optimisent la fonction du scanner ou traitement des images reçues. Le dernier de ces facteurs, le bon positionnement du rongeur avant l’analyse, peut être réalisé indépendamment des limitations axée sur le scanner ou les paramètres d’acquisition qui sont sélectionnés pour atteindre un objectif d’étude spécifique. Alors que de nombreuses publications portant sur l’imagerie in vivo ont été publiées dans la littérature 14,15,16,17, style manuscrit classique est telle que détaillée « how to » information ne peut pas être inclus. Par conséquent, du présent article et le guide vidéo vise à combler cette lacune. Ici, nous voulons apprendre aux utilisateurs de scanners de µCT in vivo à anesthésier un rat et à positionner et à immobiliser le membre postérieur pour produire des images de haute qualité qui peuvent être analysés pour quantifier plus précisément les résultats de la microarchitecture osseuse.
Des obstacles empêchant du faisceau de rayons x à travers des objets autres que le membre postérieur sont indispensables pour quantifier les BMD plus précis et les valeurs de microarchitecture osseuse. Comme les rayons x traversent les objets et tissus des différentes épaisseurs et densités, certains des rayons x sont absorbés (c.-à-d. atténuée) par les matériaux qu’ils traversent. Puisque la masse volumique mesurée d’un échantillon est remis en cause par son épaisseur et la présence et l’épaisseur des tissus environnants, il est impératif que les fantômes d’étalonnage utilisées pour déterminer les BMD sont analysés de la même manière. Par conséquent, si le faisceau de rayons x doit passer à travers des objets (c’est-à-dire, la queue) avant ou après avoir traversé la zone d’intérêt, ces objets vont absorber une partie des énergies des rayons x et n’interférera avec l’image de transmission acquise. En outre, ces scans serait très difficiles de simuler en scannant les fantômes qui doivent ressemblent étroitement à des analyses de l’échantillon. En conséquence, ces différences d’atténuation entraîner inexactitude dans l’évaluation des mesures de BMD de l’OS. Ainsi, pour la facilité et de précision, il est préférable de limiter le nombre d’obstacle entre la source de rayons x, région d’intérêt et des rayons x détecteur.
Une évaluation longitudinale de la structure osseuse d’une intervention dans des modèles précliniques impliquent l’anesthésie répétée de l’animal afin de limiter leur mouvement pendant l’analyse des protocoles. Plusieurs méthodes d’anesthésie générale existent afin de dompter les animaux subissant un balayage µCT, y compris les injectables et inhalant anesthésie 1,2,4,5,6, 12. Contrairement aux anesthésiques inhalants tels qu’isoflurane, répétée anesthésie générale à l’aide d’anesthésiques injectables entraîner une réduction du poids corporel, de tolérance chirurgicale et de modifications importantes apportées aux autres paramètres physiologiques chez les rongeurs, spécifiquement des rats et des cobayes, suggérant des contre-indications importantes pour répété utilisation 18,19,20. Tandis qu’isoflurane est très volatile et permet l’induction rapide et de récupération, des agents anesthésiques injectables produisent des niveaux variables de l’anesthésie et temps sous anesthésie dépend de la souche, le sexe, composition corporelle, à jeun et cycle circadien de la animal. Anesthésiques injectables posent des obstacles supplémentaires à leur utilisation comme ils sont très réglementés par les organes directeurs nationaux. Anesthésie par inhalation implique toutefois, la livraison directe dans le système respiratoire ; Cette méthode permet plus rapidement pour l’induction et la récupération du temps et mieux contrôlent la longueur et la profondeur de l’anesthésie19,20. Limites de la méthode d’anesthésie par inhalation impliquent son exigence pour équipement spécialisé de vaporisation et des changements de pression artérielle et fréquence cardiaque durant l’induction, entretien et restauration 18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole offre aux téléspectateurs la première directive détaillée pour l’anesthésie correcte, placement et retenue du rat au cours en vivo µCT numérisation du membre postérieur. Ces lignes directrices permettre aux utilisateurs d’en vivo µCT, analyse de systèmes pour obtenir une résolution élevée et des images de haute qualité du tibia qui peuvent être traitées pour la quantification de la microarchitecture osseuse 3 dimensions. Étapes cruciales dans le protocole nécessaire pour assurer le bon positionnement et retenue pour impliquent l’anesthésie correcte du rat ainsi que l’extension du membre postérieur, loin de toutes les autres structures critiques jusqu’à ce qu’elle est bien tendue, mais pas dans une position non naturelle. Pour des résultats optimaux d’imagerie, il est impératif que le rat être anesthésiés à un niveau de relaxation complète, et que les réflexes palpébrales et pédales sont perdus. En outre, il convient de prolonger la balayage de la jambe et l’ensemble du pied et la cheville doivent être maintenues dans la mousse. Les méthodes décrites ci-dessus pour obtenir un positionnement optimal de la jambe de balayage vont à ce que : 1) membres postérieurs de rats dans une étude sont toujours orientées dans le même sens, permettant ainsi le faisceau de rayons x de traverser la même zone de chaque jambe comme il tourne autour de l’échantillon ; 2) mouvement volontaire et involontaire du membre postérieur ne se produira pas, ce qui minimise le risque d’artefacts de mouvement d’interférer avec la qualité des images reçues ; 3) les obstacles (par exemple, la queue) sont empêchées, ce qui minimise le risque d’effets de volume partiel obtenir des mesures inexactes de BMD et TMD. Ces lignes directrices peuvent être modifiés pour chaque rat individuel, comme le taux de métabolisme de l’isoflurane et le positionnement peut varier selon la souche et le corps de taille 22. Les plus courantes en vivo machines balayage sont conçus pour les petits modèles animaux (p. ex., souris, rats, lapins, cochons d’Inde) et aura des stades animaux interchangeables pour permettre le scannage de différentes tailles d’animaux. Par conséquent, elles peuvent accueillir un large éventail de poids corporel.
Bien qu’en vivo µCT numérisation permis pour le rat pour être repositionné et réanalysés si les images acquises de l’analyse initiale sont de mauvaise qualité, répété numérisation exposera le rat à des doses supplémentaires d’anesthésie isoflurane et de rayonnement pour une période prolongée de temps. Mensuel radioexposition répétées de 600 mGy axé sur le tibia de rat sur quatre mois ne provoque pas d’effets indésirables à l’OS micro-architecture par rapport à la patte controlatérale 1, mais ce ne pas vérifier la sécurité des deux balayages répétés dans succession immédiate. Autres limitations de la technique décrite comprennent la nécessité d’étendre le membre postérieur tendu avec les forces exercées sur elle pour ne pas bouger, qui peuvent invoquer des changements dans la structure osseuse. Alors que la gravité de la retenue du membre postérieur pendant la numérisation dépendra de chaque objectif de la recherche, des recherches antérieures de notre laboratoire impliquant mensuel répétées en vivo µCT imagerie d’un membre postérieur a entraîné une différence dans la corticale paramètre micro-architecturales, excentricité, par rapport au membre postérieur controlatéral qui n’a pas subi d’extension répétée, la stabilisation et la numérisation 1. Excentricité est une mesure de la forme elliptique de l’os cortical et modifications en réponse à modifié porteur. Par conséquent, lorsqu’à l’aide de cette méthode de positionnement et de contention du membre postérieur pour répété en vivo µCT imaging, sera examinée lorsque évaluer et interpréter devient porteuse paramètres micro-architecturaux.
Alors que les directives susmentionnées ont été fournies pour l’imagerie et l’analyse du tissu osseux, légères modifications au Protocole s’impose lorsque l’imagerie des tissus mous du membre postérieur. Plus précisément, la façon dont le membre postérieur est prolongé du torse et retenu doit tenir compte, comme la procédure actuelle misshapes l’orientation des tissus mous (muscles, tissu adipeux) en position anormale pour la durée de l’analyse. En extrapolant ce modèle pour l’utilisation dans l’imagerie des tissus mous du membre postérieur, quelques ajustements il faudrait donc à la technique retenue pour réduire ou éliminer les changements dans le positionnement des tissus par rapport à l’autre.
En outre, les lignes directrices ont été écrites spécifiquement basé sur l’expérience de notre groupe de recherche, toutefois, elles peuvent être modifiées pour tenir compte d’autres scanners µCT disponible dans le commerce en vivo . Autres méthodes suggérées pour positionner et immobiliser le membre postérieur peuvent être obtenues par le fabricant de le µCT in vivo , système de balayage. Plus commercialement disponible en vivo les unités µCT listent polypropylène polystyrène expansé et tubes en plastique avec de la cire dentaire pour contenir une saillie du pied comme matériaux acceptables et les méthodes pour retenir la balayage de la jambe. Cependant, la méthode présentée dans le présent protocole fournir plus contrôlée et uniforme de positionnement et de retenue de la jambe numérisée et produit régulièrement des images de haute qualité. Les lignes directrices présentées dans la présente méthode requièrent des équipements spécialisés nécessaires pour l’anesthésie du rat, par exemple un vaporisateur, tubes, masques, chambres de l’induction et l’oxygène. Bien que l’équipement est associé à un coût légèrement plus élevé par rapport aux anesthésiques injectables, il permet aux chercheurs la possibilité de rapidement et précisément induisent une anesthésie à des profondeurs spécifiques de la conscience, ce qui donne un avantage sur alternative Méthodes.
En utilisant les directives énoncées dans la présente méthode vidéo, chercheurs utilisant les technologies de haute résolution en vivo µCT pour enquêter sur leur intervention d’intérêt sera capable de correctement et systématiquement orienter et empêcher un membre postérieur du rat pour la grande imagerie par rayons x de qualité. Cela fournira un continuum dans le domaine de l’acquisition d’images in vivo µCT et servir comme une étape vers l’optimisation de la cohérence et l’exactitude dans les études et permettent des comparaisons entre les études dans la littérature. De même, ces protocoles et méthodes peuvent être développés pour une utilisation dans d’autres espèces de rongeurs, y compris la souris, même si certains changements seront obligatoire 2,10. Par exemple, la retenue du pied dans le tube de mousse peut inclure la cheville pour réduire le risque de mouvement de la jambe lors de l’analyse. En outre, le plein pied s’insère dans le titulaire de la mousse. Ainsi, les orteils ne s’étendent pas par l’extrémité de la titulaire, comme ils le font lorsque vous fixez le pied d’un rat. En outre, le corps de la souris ne nécessite pas la même retenue avec du ruban adhésif comme le rat. Un petit cône de nez peut être utilisé pour le maintien de l’anesthésie chez les souris pendant l’analyse. Si un petit cône de nez n’est pas disponible, on peut fixer un gant en nitrile sur le cône de nez disponible et faire une petite incision dans le gant pour fournir un espace qui peut contenir le nez de la souris pour fournir l’anesthésie tout en conservant un joint autour du nez.
Tandis que le tibia proximal est le site principal de l’étude des changements à l’OS microstructure chez le rat, lignes directrices pour le positionnement correcte et uniforme des autres sites squelettiques tels que le fémur et la vertèbre lombaire doivent être étudiés et mis en place pour cohérence dans la littérature. Cependant, lorsqu’on entreprend des recherches futures impliquant l’imagerie des vertèbres lombaires, considérations s’imposent comme l’imagerie de la colonne vertébrale fournit radioexposition aux organes environnants et les tissus.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent recherche le financement d’une subvention à la découverte du CRSNG (#05573) et la Fondation canadienne pour l’Innovation (#222084) pour le financement de l’in vivo micro-CT. W.E. Ward est une Chaire de recherche du Canada dans les os et le développement musculaire.
Materials
| Isoflurane | Fresenius Kabi Animal Health | 108737 | |
| Vaporizer | Dispomed | 990-1091-3SINEWA | |
| Scavengers/Charcoal Filters | Dispomed | 985-1005-000 | |
| Micro-CT Scanner | Bruker microCT | SkyScan 1176 | |
| Dental wax | Kerr Dental Laboratory | 623 | |
| Foam (Backer Rod) | Rona | CF12086 | 1”x10’ |
| Plastic tube | Bruker microCT | SP-3010 | |
| Carbon-fiber bed | Bruker microCT | SP-3002 | |
| Vet Wrap/Bandage | Dura-Tech | 17473 | |
| Ophthalmic Gel | OptixCare | 006CLC-4256 | Antibiotic-free |
| Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 |
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