تحديد المواقع المناسبة وضبط النفس من أطرافهم هند الفئران لتصوير مركزة عالية الدقة للعظام باستخدام الهندسة المعمارية الدقيقة في فيفو المحسوبة الدقيقة التصوير المقطعي
Summary
هذه الورقة يرشد المستخدمين في فيفو الماسحات الضوئية الصغيرة المحسوبة التصوير المقطعي (µCT) كيفية تخدير، وموقف وتقييد أطرافهم هند من الفئران للحد الأدنى من الحركة أثناء التصوير عالي الدقة من الساق بشكل صحيح. والنتيجة هي صور عالية الجودة التي يمكن معالجتها بدقة تحديد مقدار العظام الصغيرة-الهندسة المعمارية.
Abstract
الاستخدام في فيفو المحسوبة الدقيقة التصوير المقطعي (µCT) هو أداة قوية الذي ينطوي على التصوير غير مدمرة للهياكل الداخلية بدقة عالية في نماذج حيوانية حية. وهذا يسمح للتصوير المتكرر للقوارض نفسها على مر الزمن. هذه الميزة لا يقلل من العدد الإجمالي للقوارض المطلوبة في تصميم تجريبي ومما يقلل من التباين بين الموضوع الذي يمكن أن تنشأ، ولكن يسمح أيضا للباحثين لتقييم استجابات الطولي أو مدى الحياة لتدخل. للحصول على صور عالية الجودة التي يمكن معالجتها وتحليلها لقياس أكثر دقة النتائج من العظام الصغيرة-الهندسة المعمارية، المستخدمين في فيفو µCT الماسحات الضوئية يجب أن بشكل صحيح تخدير الفئران، وموقف وتقييد أطرافهم هند. للقيام بهذا، من الضروري أن يتم تخديره من الفئران إلى مستوى استرخاء الكامل، وأن ردود الفعل دواسة تضيع. ويمكن تعديل هذه المبادئ التوجيهية لكل فأر الفردية، حسب معدل الأيض إيسوفلوراني يمكن أن تختلف تبعاً لحجم الجسم والإجهاد. الأسلوب السليم في فيفو µCT صورة اقتناء يتيح قياس العظام الدقيقة الهندسة المعمارية داخل وعبر دراسات دقيقة ومتسقة.
Introduction
الاستخدام في فيفو المحسوبة الدقيقة التصوير المقطعي (µCT) هو أداة قوية الذي ينطوي على التصوير غير مدمرة للهياكل الداخلية بدقة عالية باستخدام نماذج القوارض. الطبيعة غير المدمرة في فيفو µCT يسمح بتكرار التصوير للقوارض نفسها على مر الزمن. هذه الميزة ليس فقط يقلل من العدد الإجمالي للقوارض المطلوبة في تصميم تجريبي ومما يقلل من التباين بين الموضوع الذي يمكن أن تنشأ، ولكن يسمح أيضا للباحثين لفهم الاستجابات طويلة الأجل على مداخلة. مع استخدام المتكررة في فيفو µCT، قد أوضحت التجارب في الفئران والجرذان التغيرات الإنمائية العظام الصغيرة–الهندسة المعمارية والعظام الكثافة المعدنية (BMD) طوال فترات من عمر 1،2،3 ،،من45،6،،من78 ، فضلا عن الاستجابة لصحة العظام لتدخلات مثل النظام الغذائي 9،10، أوفاريكتومي 7،11 وعوامل دوائية 8،،من1213. BMD والعظام الصغيرة-الهندسة المعمارية في مواقع محددة الهيكل العظمى، إلا وهي الدانية الساق وعظم الفخذ والفقرات القطنية، إرشادية العظام الصحة بوجه عام ومن خطر إدامة وجود كسر وهي التدابير الأولية حتى عند التحديد الكمي للاستجابات التدخل.
في فيفو µCT صورة اقتناء يشمل الأبعاد إسقاطات الأشعة السينية التي يتم تحصيلها في زوايا متعددة كمصدر أشعة إكس والكاشف الدوران حول هذا الحيوان تحت التحقيق 14،15. جودة الصورة الناتجة تعتمد على عوامل كثيرة بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر: تحديد معلمات اقتناء (أي، القرار المكانية، والجهد بالأشعة السينية، والتيار، وخطوة التناوب، عامل التصفية المطبق، وقت التعرض)، القيود المفروضة µCT الماسح الضوئي (أي، التحف القائم على الماسح الضوئي مثل التحف الدائري أو الغبار التي تتسبب في آثار حجم streaking أو جزئية) وتحديد المواقع المناسبة وضبط النفس للحيوان. يمكن التلاعب السابق اثنين من هذه العوامل إلى حد ما حسب المستخدم، اعتماداً على آلة المسح محددة، وأهداف الدراسة والتصحيحات اللازمة لتحسين أداء وظيفة الماسح الضوئي أو تجهيز الصور المكتسبة. يمكن أن يتحقق هذا الأخير من هذه العوامل، تحديد المواقع المناسبة للقوارض قبل المسح، بغض النظر عن القيود المفروضة على الماسح الضوئي أو اكتساب المعلمات التي تم تحديدها لتحقيق هدف دراسة محددة. بينما تم نشر العديد من المنشورات المتعلقة بالتصوير في فيفو في الأدب 14،15،،من1617، نمط المخطوطات الكلاسيكية أن هذه مفصلة “كيفية” المعلومات لا يمكن تضمين. ولذلك، هدف هذه المادة ودليل الفيديو لملء هذا الفراغ. هنا نحن نهدف إلى إرشاد المستخدمين في فيفو الماسحات µCT كيفية تخدير الفئران، وموقف وتقييد أطرافهم هند لإنتاج صور عالية الجودة التي يمكن تحليلها لقياس أكثر دقة النتائج من العظام الصغيرة-الهندسة المعمارية.
منع العوائق من شعاع الأشعة السينية من خلال كائنات بخلاف أطرافهم هند لا غنى عنه لقياس الكثافة العظمية المعدنية الأكثر دقة والقيم الصغرى-هندسة العظام. تمر الأشعة السينية من خلال الكائنات وأنسجة متفاوتة السماكة والكثافة، وبعض الأشعة السينية تمتصه المواد التي تمر عبر (أي يخفف). نظراً لكثافة كتلة قياس عينة يتأثر بسمكة، والوجود وسمك الأنسجة المحيطة، من المحتم أن أشباح المعايرة المستخدمة لتحديد BMD ضوئياً بنفس الطريقة. ولذلك، إذا كان شعاع أشعة إكس بالمرور عبر الكائنات (أي، الذيل) قبل أو بعد مرورها عبر المنطقة للاهتمام، تلك الكائنات سيتم استيعاب بعض من طاقات الأشعة السينية وسوف تتداخل مع الإرسال الصورة المكتسبة. وبالإضافة إلى ذلك، بمسح هذه ستكون صعبة للغاية لمحاكاة عند مسح الأشباح التي يجب أن تشبه بمسح عينة. ونتيجة هذه الاختلافات التوهين تؤدي إلى عدم الدقة في تقييم القياسات BMD العظام. وهكذا، لسهولة ودقة، فمن الأفضل للحد من العدد العوائق بين مصدر الأشعة السينية، المنطقة من اهتمام والأشعة السينية للكشف عن.
تقييم طولية لهيكل العظام من تدخل في نماذج ما قبل السريرية تنطوي التخدير المتكررة من الحيوان الحد من تحركاتهم أثناء المسح البروتوكولات. توجد عدة طرق للتخدير العام من أجل إخضاع الحيوانات تمر بفحص µCT، بما في ذلك التخدير عن طريق الحقن ومواد التنشق 1،2،4،،من56، 12-خلافا لمواد التنشق المسكنات مثل إيسوفلوراني، يسبب التخدير العام المتكررة باستخدام المسكنات عن طريق الحقن انخفاضا في وزن الجسم والتسامح الجراحية وتغييرات هامة للمعلمات الفسيولوجية الأخرى في القوارض، على وجه التحديد الفئران وخنازير غينيا، مما يوحي بموانع كبيرة لتكرار استخدام 18،،من1920. بينما isoflurane متقلبة للغاية ويسمح للاستقراء السريع والانتعاش، وكلاء مخدر الحقن تنتج مستويات متفاوتة من التخدير والوقت تحت التخدير ويعتمد على السلالة والجنس، وتكوين الجسم، صام الدولة، ودورة الإيقاعية الحيوان. المسكنات عن طريق الحقن أيضا تشكل حواجز إضافية لاستخدامها كما أنها عالية تنظم هيئات الإدارة الوطنية. ومع ذلك، ينطوي التخدير استنشاق التسليم المباشر في الجهاز التنفسي؛ يسمح هذا الأسلوب لأسرع التعريفي واسترداد الوقت والتحكم بشكل أفضل على طول وعمق التخدير19،20. القيود المفروضة على طريقة التخدير استنشاق تنطوي على احتياجاتها من المعدات المتخصصة تبخر وبعض التغييرات لمعدل ضربات القلب وضغط الدم خلال التعريفي، وصيانة واستعادة 18،19.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول المشاهدين مع المبادئ التوجيهية التفصيلية الأولى للتخدير المناسب، والتنسيب، وضبط النفس من الفئران خلال في فيفو المسح µCT من أطرافهم هند. هذه المبادئ التوجيهية تمكين المستخدمين في فيفو µCT المسح نظم الحصول على دقة عالية وصور ذات جودة عالية من الساق التي يمكن معالجتها للتحديد الكمي للعظام 3-الأبعاد الصغرى-الهندسة المعمارية. خطوات حاسمة في البروتوكول اللازم لضمان تحديد المواقع المناسبة وضبط النفس إشراك التخدير المناسبة للفئران، فضلا عن توسيع أطرافهم هند بعيداً عن جميع الهياكل الحيوية الأخرى حتى يكون مشدود، ولكن ليس في وضع غير طبيعي. لنتائج التصوير الأمثل، يتحتم أن تكون تخديره من الفئران إلى مستوى استرخاء الكامل، وأن ردود الفعل بالبيبرال ودواسة تضيع. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يمتد الساق المسح وينبغي تقييد كامل القدم والكاحل في الرغاوي. الأساليب المذكورة أعلاه تحقيق لتحديد المواقع المثلى لمسح الساق سوف يكفل: 1) هي دائماً موجهة نحو أطرافه هند من الفئران في دراسة في نفس الاتجاه، مما يسمح بشعاع أشعة إكس بالمرور عبر المنطقة نفسها كل ساق الاستدارة حول العينة؛ 2) سوف لا تحدث حركة أطرافهم هند سواء الطوعي وغير الطوعي، وبالتالي التقليل إلى أدنى حد من الإمكانات للتحف حركة للتدخل في نوعية الصور المكتسبة؛ 3) يتم منع عوائق من الكائنات (أي، الذيل)، وبالتالي التقليل إلى أدنى حد احتمالات الآثار حجم جزئي لإنتاج قياسات BMD وأنظمة الدفاع الصاروخي التكتيكي غير دقيقة. ويمكن تعديل هذه المبادئ التوجيهية لكل فأر الفردية، حسب معدل الأيض isoflurane وتحديد المواقع يمكن أن تختلف تبعاً لحجم الجسم والإجهاد 22. الأكثر شيوعاً في فيفو آلات المسح مصممة للنماذج الحيوانية الصغيرة (أي، والفئران والجرذان، أرانب، خنازير غينيا) وسيكون مراحل الحيوان للتبادل للسماح بفحص مختلف الأحجام الحيوانية. ولذلك، أنها يمكن أن تستوعب مجموعة واسعة من وزن الجسم.
على الرغم من أن المسح في فيفو µCT تصاريح للفئران ليتم إعادة تحديد موضعها وإعادة فحص إذا كانت الصور التي تم الحصول عليها من المسح الأولى نوعية رديئة، وكرر المسح سوف تعرض الفئران لجرعة إضافية من التخدير الإشعاع وإيسوفلوراني ل فترة طويلة من الزمن. التعرض للإشعاع المتكررة الشهرية من 600 مجي ركزت على الساق الفئران أكثر من أربعة أشهر لا تسبب آثاراً ضارة للعظام الصغيرة-الهندسة المعمارية مقارنة ب أطرافهم هند كونترالاتيرال 1، ولكن هذا ليس التأكد من سلامة الآخران بالأشعة المتكررة في الخلافة فورا. وتشمل القيود المزيد من الأسلوب الموصوفة الحاجة إلى تمديد أطرافهم هند مشدود مع قوات المطبق عليه للحفاظ على أنها لا تزال، التي يجوز الاحتجاج ببعض التغييرات في بنية العظام. رغم شدة ضبط النفس أطرافهم هند أثناء المسح سيعتمد على كل هدف من أهداف البحث، البحوث السابقة من مختبر لدينا تشمل الشهرية المتكررة في فيفو µCT تصوير لأحد أطرافهم هند أسفرت عن فرق في القشرية المعلمة الصغيرة المعمارية، انحراف، مقارنة بأطرافهم هند كونترالاتيرال التي لم تطرأ التمديد المتكرر، وتحقيق الاستقرار والمسح 1. الانحراف مقياس للشكل البيضاوي العظام القشرية والتغيرات في الاستجابة تغيير الحاملة. لذلك، عند استخدام هذا الأسلوب لتحديد المواقع، والتقييد من أطرافهم هند لتكرار في فيفو µCT التصوير، ينبغي بذل النظر فيها عند تقييم وتفسير التغييرات إلى المعالم المعمارية الدقيقة الحاملة.
في حين قدمت المبادئ التوجيهية المذكورة أعلاه لتصوير وتحليل أنسجة العظام، يجب جعل تعديلات طفيفة على البروتوكول عند تصوير الأنسجة اللينة من أطرافهم هند. على وجه التحديد، بالطريقة التي تمتد من الجذع وتقييد أطرافهم هند يجب أن تؤخذ في الاعتبار، كما أن الإجراء الحالي ميسشابيس اتجاه الأنسجة الرخوة (العضلات، والأنسجة الدهنية) في الموضع غير طبيعية لمدة المسح الضوئي. ولذلك، عند استقراء هذا النموذج للاستخدام في تصوير الأنسجة اللينة من أطرافهم هند، ينبغي إجراء بعض التعديلات لأسلوب ضبط النفس الحد من أو القضاء على التغييرات في تحديد المواقع للأنسجة بالنسبة لبعضها البعض.
وعلاوة على ذلك، المبادئ التوجيهية قد كتب على وجه التحديد استناداً إلى تجارب مجموعتنا البحثية، بيد أنها يمكن تعديلها لاستيعاب الأخرى المتاحة تجارياً في فيفو µCT الماسحات الضوئية. أساليب أخرى مقترحة الموقف وتقييد أطرافهم هند قد تكون متاحة من قبل الشركة المصنعة µCT في فيفو فحص النظام. قائمة الوحدات المتاحة تجارياً آخر في فيفو µCT البوليسترين والبولي بروبيلين، وتوسيع نطاق، وأنابيب بلاستيكية مع الشمع الأسنان عقد بارزة القدم كمواد مقبولة وأساليب لكبح الساق المسح. بيد أن الطريقة التي عرضت في هذا البروتوكول تقديم المزيد الخاضعة للرقابة ومتسقة لتحديد المواقع وضبط النفس في الساق الممسوحة ضوئياً، واستمرار تنتج صوراً عالية الجودة. المبادئ التوجيهية الواردة في الطريقة الحالية تتطلب المعدات المتخصصة اللازمة للتخدير من الفئران، مثل المبخر، وأنابيب، وأقنعة، والدوائر التعريفي، والأكسجين. على الرغم من المعدات المرتبطة بها بتكلفة أعلى إلى حد ما مقارنة بالمسكنات عن طريق الحقن، فإنه يسمح الباحثين القدرة على الحث على سرعة ودقة التخدير في أعماق معينة من الوعي، الذي يوفر ميزة على البديل أساليب.
استخدام المبادئ التوجيهية الواردة في أسلوب هذا الفيديو والباحثين استخدام دقة عالية في فيفو µCT تكنولوجيات للتحقيق تدخلهم للفائدة سوف تكون قادرة بشكل صحيح واستمرار توجيه وتقييد أطرافهم هند الفئران لارتفاع جودة التصوير بالأشعة السينية. وهذا تتيح استمرارية في الميدان في فيفو µCT صورة اقتناء وتكون بمثابة خطوة نحو تحسين الاتساق والدقة ضمن الدراسات وتمكين إجراء مقارنات عبر دراسات في الأدب. وبالمثل، يمكن توسيع هذه البروتوكولات وطرق لاستخدامها في أنواع القوارض الأخرى، بما في ذلك الفئران، على الرغم من بعض التغييرات سوف يكون مطلوب 2،10. على سبيل المثال، يمكن أن تشمل ضبط النفس القدم في أنبوب الرغوة الكاحل للتقليل من إمكانية لحركة الساق أثناء الفحص. وبالإضافة إلى ذلك، سوف تناسب القدم كامل صاحب الرغوة. وهكذا، لا تمتد الأصابع من نهاية الحامل كما يفعلون عند تأمين سيرا على الأقدام من الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب جسم الماوس نفسه من ضبط للنفس مع الشريط كالفئران. مخروط الآنف أصغر يمكن استخدامها للحفاظ على التخدير في الفئران أثناء الفحص. إذا لم يتوفر مخروط الآنف الأصغر حجماً، يمكن للمرء تأمين قفازات النتريل فوق مخروط الآنف المتاحة وإجراء شق صغير في القفازات لتوفير مساحة التي يمكن أن تناسب آنف الماوس لتوفير التخدير مع الحفاظ على ختم حول الآنف.
بينما الساق الدانية هي الموقع الرئيسي لتحقيق تغييرات للعظام البنية الصغرى في الفئران، ينبغي التحقيق في المبادئ التوجيهية لتحديد المواقع سليمة ومتسقة للمواقع الهيكلية الأخرى مثل عظم الفخذ والفقرات القطنية والمنشأة الاتساق في الأدب. ومع ذلك، عند القيام بالبحث في المستقبل تتعلق التصوير للفقرات القطنية، يجب جعل اعتبارات كما يوفر تصوير العمود الفقري التعرض للإشعاع للأعضاء والأنسجة المحيطة بها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف الكتاب البحوث التمويل من منحة مقدمة من اكتشاف (#05573) ومؤسسة كندا للابتكار (#222084) للتمويل في فيفو الصغرى-قيراط هو وارد نحن “كرسي أبحاث كندا” في تنمية العضلات والعظام.
Materials
| Isoflurane | Fresenius Kabi Animal Health | 108737 | |
| Vaporizer | Dispomed | 990-1091-3SINEWA | |
| Scavengers/Charcoal Filters | Dispomed | 985-1005-000 | |
| Micro-CT Scanner | Bruker microCT | SkyScan 1176 | |
| Dental wax | Kerr Dental Laboratory | 623 | |
| Foam (Backer Rod) | Rona | CF12086 | 1”x10’ |
| Plastic tube | Bruker microCT | SP-3010 | |
| Carbon-fiber bed | Bruker microCT | SP-3002 | |
| Vet Wrap/Bandage | Dura-Tech | 17473 | |
| Ophthalmic Gel | OptixCare | 006CLC-4256 | Antibiotic-free |
| Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 |
References
- Longo, A. B., Sacco, S. M., Salmon, P. L., Ward, W. E. Longitudinal use of micro-computed tomography does not alter microarchitecture of the proximal tibia in sham or ovariectomized sprague-dawley rats. Calcif Tissue Int. 98 (6), 631-641 (2016).
- Sacco, S. M., et al. Repeated irradiation from micro-computed tomography scanning at 2, 4 and 6 months of age does not induce damage to tibial bone microstructure in male and female CD-1 mice. Bonekey Rep. 6, 855 (2017).
- Waarsing, J. H., Day, J. S., Verhaar, J. A., Ederveen, A. G., Weinans, H. Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats. J Orthop Res. 24 (5), 926-935 (2006).
- Klinck, R. J., Campbell, G. M., Boyd, S. K. Radiation effects on bone architecture in mice and rats resulting from in vivo micro-computed tomography scanning. Med Eng Phys. 30 (7), 888-895 (2008).
- Laperre, K., et al. Development of micro-CT protocols for in vivo follow-up of mouse bone architecture without major radiation side effects. Bone. 49 (4), 613-622 (2011).
- Brouwers, J. E., van Rietbergen, B., Huiskes, R. No effects of in vivo micro-CT radiation on structural parameters and bone marrow cells in proximal tibia of wistar rats detected after eight weekly scans. J Orthop Res. 25 (10), 1325-1332 (2007).
- Francisco, J. I., Yu, Y., Oliver, R. A., Walsh, W. R. Relationship between age, skeletal site, and time post-ovariectomy on bone mineral and trabecular microarchitecture in rats. J Orthop Res. 29 (2), 189-196 (2011).
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Longo, A. B., et al. Lifelong intake of flaxseed or menhaden oil to provide varying n-6 to n-3 PUFA ratios modulate bone microarchitecture during growth, but not after OVX in Sprague-Dawley rats. Mol Nutr Food Res. 61 (8), (2017).
- Sacco, S. M., Saint, C., LeBlanc, P. J., Ward, W. E. Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring. Nutrients. 9 (3), 250 (2017).
- Campbell, G. M., Buie, H. R., Boyd, S. K. Signs of irreversible architectural changes occur early in the development of experimental osteoporosis as assessed by in vivo micro-CT. Osteoporos Int. 19 (10), 1409-1419 (2008).
- De Schaepdrijver, L., Delille, P., Geys, H., Boehringer-Shahidi, C., Vanhove, C. In vivo longitudinal micro-CT study of bent long limb bones in rat offspring. Reprod Toxicol. 46, 91-97 (2014).
- Perilli, E., et al. Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized, zoledronic acid-treated, and sham-operated rats. Osteoporos Int. 21 (8), 1371-1382 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Li, H., Zhang, H., Tang, Z., Hu, G. Micro-computed tomography for small animal imaging: Technological details. Progress in Natural Science. 18 (5), 513-521 (2008).
- Campbell, G. M., Sophocleous, A. Quantitative analysis of bone and soft tissue by micro-computed tomography: applications to ex vivo and in vivo studies. Bonekey Rep. 3, 564 (2014).
- Meganck, J. A., Kozloff, K. M., Thornton, M. M., Broski, S. M., Goldstein, S. A. Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD. Bone. 45 (6), 1104-1116 (2009).
- Vazquez, C. M., Molina, M. T., Ilundain, A. Role of rat large intestine in reducing diarrhea after 50% or 80% distal small bowel resection. Dig Dis Sci. 34 (11), 1713-1719 (1989).
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats. BMC Vet Res. 10, 198 (2014).
- Schmitz, S., Tacke, S., Guth, B., Henke, J. Comparison of physiological parameters and anaesthesia specific observations during isoflurane, ketamine-xylazine or medetomidine-midazolam-fentanyl anaesthesia in male guinea pigs. PLoS One. 11 (9), e0161258 (2016).
- Stevens, W. C., et al. Comparative toxicities of halothane, isoflurane, and diethyl ether at subanesthetic concentrations in laboratory animals. Anesthesiology. 42 (4), 408-419 (1975).
