Uygun konumlandırma ve sıçan Hind riske odaklı yüksek kararlılık düşsel ve kemik mikro mimarisi kullanarak Vivo içinde mikro Bilgisayarlı Tomografi için kısıtlama
Summary
Bu kağıt vivo içinde mikro Bilgisayarlı Tomografi (µCT) tarayıcılar kullanıcılarının nasıl anestezi, doğru getirin ve bir fare için çok az hareket hind bacak tibia yüksek çözünürlüklü görüntüleme sırasında dizginlemek bildirir. Doğru bir şekilde kemik mikro-mimari ölçmek için işlenmiş yüksek kaliteli görüntüler sonucudur.
Abstract
Vivo mikro Bilgisayarlı Tomografi (µCT) canlı hayvan modellerinde yüksek çözünürlüklerde iç yapılarının tahribatsız görüntüleme içerir güçlü bir araç kullanmaktır. Bu zaman içinde aynı kemirgen tekrarlanan görüntüleme sağlar. Bu özellik sadece bir deneysel tasarım gerekli kemirgenler toplam sayısını azaltır ve böylece ortaya çıkabilir, ama aynı zamanda bir müdahale boyuna veya ömür boyu yanıt değerlendirmek araştırmacılar sağlar arası konu değişimini azaltır. İşlenmiş ve daha doğru sonuçlar kemik mikro mimarisinin ölçmek için analiz yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için in vivo µCT tarayıcılar kullanıcılarının gerekir düzgün rat, anestezi ve getirip hind uzuv dizginlemek. Bunu yapmak için bu fare tam gevşeme bir seviyeye anestezi ve pedal refleksleri kaybolur zorunludur. İsoflurane metabolizma hızı zorlanma ve vücut boyutuna bağlı olarak değişebilir görüldüğü bu kuralları tek tek her fare için değiştirilebilir. Vivo µCT resim alma için uygun tekniği kemik mikro-mimari içinde ve çalışmalar arasında doğru ve tutarlı ölçüm sağlar.
Introduction
Vivo mikro Bilgisayarlı Tomografi (µCT) kullanımı yüksek çözünürlüklerde kemirgen modelleri kullanarak iç yapılarının tahribatsız görüntüleme içerir güçlü bir araçtır. Vivo µCT non-yıkıcı doğa tekrarlanan aynı kemirgen zaman içinde görüntüleme için sağlar. Bu özellik sadece bir deneysel tasarım gerekli kemirgenler toplam sayısını azaltır ve böylece ortaya çıkabilir, ama aynı zamanda bir müdahale için uzun vadeli yanıt anlamaya araştırmacılar sağlar arası konu değişimini azaltır. Tekrarlanan vivo µCT kullanımı ile fare ve sıçan deneylerinde mikro mimari kemik ve kemik mineral yoğunluğu (KMY) ömrü 1,2,3 süreler boyunca için gelişimsel değişiklikleri aydınlatılmamıştır yanı sıra Kemik sağlığı yanıt müdahaleler gibi diyet 9,10, ,4,5,6,7,8 ovariectomy 7,11 ve farmakolojik ajanlar 8,12,13. BMD ve kemik mikro-Mimarlık belirli iskelet siteleri, yani proksimal tibia, femur ve Lomber omurga, gösterge genel Kemik Sağlığı ve bir kırık sürdürülmesi riski ve bu yüzden birincil önlemler vardır ne zaman yanıt-e doğru miktarının bir müdahale.
Vivo µCT resim alma iki boyutlu X-ray projeksiyon x-ışını kaynağı ve Dedektör altında soruşturma 14,15hayvan döndürürken birçok açıdan elde içerir. Sonuçta elde edilen görüntü kalitesi dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır, ancak bunlarla sınırlı değildir: Seçili edinme parametreleri (Yani, Uzaysal çözünürlük, x-ışını voltajı, amper, rotasyon adım, uygulanan filtre, çekim hızı), µCT sınırlamaları tarayıcı (Yani, streaking veya kısmi cilt etkilere neden tarayıcı tabanlı Mimariler Halka yapıları veya toz gibi) ve uygun konumlandırma ve kısıtlama hayvan. Eski iki bu faktörlerin bir dereceye kadar belirli tarama makine bağlı olarak kullanıcı tarafından manipüle edilebilir, çalışma hedefleri ve için gerekli düzeltmeler tarayıcı fonksiyonu veya edinsel görüntü işleme en iyi duruma getirme. İkinci tarama önce kemirgen uygun konumlandırma bu faktörlerin, tarayıcı tabanlı sınırlamalar veya belirli çalışma hedefe ulaşmak için seçilen edinme parametreleri bağımsız olarak elde edilebilir. Edebiyat 14,15,16,17‘ vivo görüntüleme içeren birçok yayın yayın tarihi, klasik el yazması tarzı böyle ayrıntılı iken “nasıl yapılır” bilgileri dahil edilemiyor. Bu nedenle, bu makale ve video rehber amacı bu boşluğu doldurmak için. Burada vivo içinde µCT tarayıcılar kullanıcılarının nasıl bir fare, anestezi ve getirip daha doğru sonuçlar kemik mikro mimarisinin ölçmek için analiz edilebilir yüksek kaliteli görüntüler üretmek için arka bacak dizginlemek için talimat hedefliyoruz.
Arka bacak dışındaki nesneler aracılığıyla x-ışını demetinin önlenmesi engelleri en doğru BMD ve kemik mikro mimari değerleri miktarının için zorunludur. X-ışınları nesneleri ve doku kalınlığı ve yoğunluğu değişen üzerinden geçerken, röntgen ve bazıları (zayıflatılmışYani ) onlar geçmek üzerinden malzeme tarafından emilir. Ölçülen kütle yoğunluğu örneği kalınlığı ve varlığı ve çevresindeki doku kalınlıkları etkilenir olduğundan, kalibrasyon hayaletler BMD belirlemek için kullanılan aynı şekilde taranır şarttır. Bu nedenle, röntgen ışını önce veya faiz bölgeden geçtikten sonra (Yani, kuyruk) nesneler arasında geçirmek için ise, bu nesnelerin bazı x-ışını enerji absorbe ve alınan iletim görüntüsüyle engel olacaktır. Buna ek olarak, bu taramaları örnek taramaları yakından benzer olmalıdır hayaletler tararken benzetimini yapmak çok zor olacak. Sonuç olarak, bu zayıflama farklılıklar yanlışlık KMY ölçümleri kemik değerlendirilmesinde yol açar. Böylece, kolaylık ve doğruluk için x-ışını kaynağı, ilgi ve x-ışını dedektörü bölgesi arasındaki engelleri sayısını sınırlamak en iyisidir.
Önceden klinik modelleri bir müdahale kemik yapısından boyuna değerlendirmesini protokolleri tarama sırasında kendi hareketi sınırlamak için hayvan tekrarlanan anestezi gerektirir. Enjekte edilebilir ve soluk çeken anestezi 1,2,4,5,6, de dahil olmak üzere bir µCT tarama geçiren hayvanlar bastırmak için çeşitli yöntemler genel anestezi var 12. isoflurane gibi soluk çeken anestezikler farklı olarak tekrarlanan genel anestezi enjekte edilebilir anestezikler kullanarak neden bir azalma vücut ağırlığı, cerrahi hoşgörü ve kemirgenler, diğer fizyolojik parametrelere önemli değişiklikler özellikle Fareler ve eskiden şiling şimdi pigs, önemli kontrendikasyonlar için öne kullanım 18,19,20tekrarladı. İsoflurane son derece kırılgandır ve hızlı indüksiyon ve kurtarma sağlar, enjekte edilebilir anestezik ajanların üretmek anestezi çeşitli düzeylerde ve zaman anestezi altında bağlıdır zorlanma, seks, vücut kompozisyonu, oruç devlet ve sirkadiyen döngüsü üzerinde hayvan. Gibi son derece Ulusal yönetim organları tarafından düzenlenmektedir enjekte edilebilir anestezikler da bunların kullanımı için ek engelleri oluşturmaktadır. İnhalasyon anestezi ancak solunum sistemi içine doğrudan teslim içerir; Bu yöntem daha hızlı indüksiyon ve kurtarma zaman ve uzunluğu ve derinlik anestezi19,20üzerinde daha iyi denetim sağlar. İnhalasyon anestezi yöntemi için kısıtlamaları indüksiyon, bakım ve kurtarma 18,19sırasında kalp hızı ve kan basıncı için özel vaporizing ekipman ve bazı değişiklikler için onun gereksinimi içerir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı ilk ayrıntılı kılavuz ile izleyiciler uygun anestezi, yerleştirme ve kısıtlama farenin için in vivo µCT hind uzuv tarama sırasında sağlar. Bu yönergeleri yüksek çözünürlük elde etmek için in vivo µCT sistemler taranıyor kullanıcılarının ve yüksek nitelik imge 3 boyutlu kemik mikro-mimari miktar için işlenebilir Tibia etkinleştirin. Önemli adımlar uygun konumlandırma ve kısıtlama fareyi yanı sıra diğer önemli yapıların uzak hind bacak gergin kadar uzanan uygun anestezi içeren sağlamak için gerekli protokolündeki ama doğal olmayan bir konumda değil. En iyi görüntüleme sonuçları için fareyi tam gevşeme bir seviyeye anestezi ve palpebral ve pedal refleksler kaybolur zorunludur. Buna ek olarak, tarama bacak genişletilmiş ve tüm ayak ve ayak bileği içinde köpük ölçülü. En iyi tarama kısmını konumlandırma ulaşmak için yukarıda açıklanan yöntemleri bu sağlayacaktır: 1) arka bacaklarda sıçan bir çalışma içinde sürekli aynı yönde, böylece bu döndükçe her bacak aynı alanı üzerinden geçmek için röntgen ışını erişimine izin verme odaklı örnek; 2) arka bacak hem gönüllü ve istemsiz hareketi, böylece hareket eserler alınan görüntülerin kalitesi ile müdahale etmek için potansiyel en aza indirerek oluşmaz; 3) böylece yanlış BMD ve TMD ölçümleri üretmek kısmi ses efektleri karşılaşma olasılığını en aza indirgemek engellerden nesnelerinden (Yani, kuyruk) engellenir. İsoflurane metabolizma ve konumlandırma oranı zorlanma ve vücut boyutu 22bağlı olarak değişebilir görüldüğü bu kuralları tek tek her fare için değiştirilebilir. En yaygın vivo içinde tarama makineleri küçük hayvan modeller için tasarlanmıştır (Yani, fare, sıçan, tavşan, eskiden şiling şimdi pigs) ve farklı hayvan boyutlarda tarama izin vermek için değiştirilebilir hayvan aşamaları olacak. Bu nedenle, vücut ağırlıkları geniş bir hizmet verebilir.
Her ne kadar içinde vivo µCT tarama izni için yeniden konumlandırılmış ve ilk inceden inceye gözden geçirmek–dan alınan görüntüleri kalitesiz, eğer taranıp fareyi tekrar tarama radyasyon ve isoflurane anestezi için ek doz fare maruz uzun bir süre. Aylık yinelenen radyasyona maruz kalma 600 mGy sıçan tibia için dört ay içinde odaklanmış, mikro-mimari kontralateral hind bacak 1‘ e göre kemik olumsuz etkileri neden olmaz ancak bu iki taramalar içinde tekrarlanan Emanet tespit değil hemen arkaya. Kemik yapısında bazı değişiklikler çağıran hala, tutmak için uygulanan kuvvetleri ile gergin hind bacak uzatmak gerek açıklanan tekniği daha da sınırlamaları içerir. Tarama sırasında arka bacak kısıtlama şiddeti her araştırma amaçta bağlıdır iken, kortikal bir fark aylık tekrarlanan in vivo µCT görüntüleme bir arka bacak içeren bizim Laboratuarı’ndan önceki araştırma sonuçlandı mikro mimari parametresi, merkezcillik, kontralateral hind uzuv için yinelenen uzantı, istikrar ve 1tarama geçmesi değil karşılaştırıldığında. Merkezcillik kortikal kemik ve değişiklikleri yanıt taşıma değişmiş eliptik şekil ölçüsüdür. Konumlandırma ve arka bacak için yasaklama bu yöntemi kullanarak Imaging vivo içinde µCT tekrarlanan zaman, bu nedenle, değerlendirme ve yorumlama için taşıma mikro mimari parametreleri değiştiğinde dikkate yapılması gerekir.
Görüntüleme ve kemik doku analizi için yukarıdaki yönergelere verilen süre ne zaman hind ekstremite yumuşak doku görüntüleme Protokolü hafif ayarlamalar yapılması gerekir. Özellikle, geçerli yordam anormal tarama süresi için konumlandırma içine yumuşak doku (kas, yağ dokusu) yönünü artık gibi hangi hind bacak ve gövde genişletilmiş ve ölçülü bir şekilde dikkate alınması gerekir. Bu nedenle, ne zaman bu modeli hind ekstremite yumuşak doku görüntülemede kullanılmak extrapolating, bazı ayarlamalar azaltmak veya birbirlerine dokuların konumlandırmada değişiklikleri ortadan kaldırmak kısıtlama tekniği için yapılmalıdır.
Ayrıca, bu kurallar özellikle tabanlı üzerinde araştırma grubumuzun deneyimler yazılmış, ancak, bunlar diğer ticari olarak mevcut vivo µCT tarayıcıları karşılamak için değiştirilebilir. Konumlandırmak ve arka bacak dizginlemek için önerilen diğer yöntemleri sistem taraması vivo içinde µCT üreticisi tarafından kullanılabilir olabilir. Polipropilen, genişletilmiş polistiren piyasada en vivo içinde µCT birimleri listelemek ve çıkıntılı bir tutmak için diş balmumu ile plastik tüpler olarak kabul edilebilir malzeme ve yöntemler tarama bacak frenleyici için ayak. Ancak, bu protokol için sunulan yöntem daha fazla kontrollü ve tutarlı konumlandırma ve taranan bacak kısıtlama sağlar ve sürekli olarak yüksek kaliteli görüntüler üretir. Mevcut yönteminde sunulan yönergeleri özel ekipman anestezi için gerekli bir Buharlaştırıcı, tüpler, maskeler, indüksiyon odaları ve oksijen gibi farenin gerektirir. Ekipman için enjekte edilebilir anestezikler göre biraz daha yüksek bir maliyet ile ilişkili olsa da, o hızla ve kesin olarak anestezi alternatif üzerinde bir avantaj sağlar bilinç belirli derinliklerde ikna yeteneği araştırmacılar bırakmak yöntemleri.
Video, mevcut yönteminde yüksek çözünürlüklü vivo içinde µCT teknolojileri kullanan araştırmacılar onların müdahale araştırmak için özetlenen yönergeleri uygulayarak ilgi doğru olarak kullanabilmek ve tutarlı bir şekilde yönlendirmek ve sıçan hind riski yüksek dizginlemek Kalite röntgen görüntüleme. Bu bir süreklilik içinde vivo µCT resim alma alanında sağlamak ve tutarlılığı ve doğruluğu çalışmaları içinde en iyi duruma getirme yolunda bir adım olarak hizmet ve çalışmalar literatürde arasında karşılaştırma etkinleştirmek. Benzer şekilde, bu iletişim kuralları ve yöntemleri bazı değişiklikler gerekli 2,10olsa da fareler, dahil olmak üzere diğer kemirgen türler olarak kullanılmak üzere genişletilebilir. Örneğin, köpük tüp ayağından kısıtlama tarama sırasında bacak hareketi olasılığını en aza indirmek için ayak bileği içerebilir. Buna ek olarak, tam ayak köpük yuvasına uyacak. Onlar ne zaman bir sıçan ayak güvenliğini sağlama gibi böylece, ayak parmakları sahibi dışında Uzatılmasının sonu değil. Buna ek olarak, vücut fare fare kadar bant ile kısıtlama aynı gerektirmez. Daha küçük bir burun konisi tarama sırasında anestezi farelerde korumak için kullanılabilir. Daha küçük bir burun konisi yoksa, bir kullanılabilir burun konisi üzerinde nitril eldiven güvenli ve burun burun çevresinde bir mühür koruyarak anestezi sağlamak için fare-ebilmek hastalık nöbeti bir alan sağlamak için eldiven içinde küçük bir kesi yapmak.
Proksimal tibia soruşturma mikro-fare yapısında kemik değişiklikleri ana site olsa da, doğru ve tutarlı uyluk kemiği ve Lomber vertebra gibi iskelet diğer sitelerin konumlandırma için yönergeler araştırıldı ve için kurulan literatürde tutarlılık. Olarak görüntüleme omurganın çevresindeki organ ve dokulara radyasyona maruz kalma sağlar ancak, lomber vertebra görüntüleme ile ilgili gelecekteki araştırma taahhüt zaman dikkat edilmesi gereken noktalar yapılmalıdır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar araştırma kabul vivo içinde mikro-CT finansmanı için bir NSERC bulma Grant (#05573) ve yenilik (#222084) Kanada Vakfı fon biz Ward bir Kanada araştırma kemik ve kas geliştirme koltuğum.
Materials
| Isoflurane | Fresenius Kabi Animal Health | 108737 | |
| Vaporizer | Dispomed | 990-1091-3SINEWA | |
| Scavengers/Charcoal Filters | Dispomed | 985-1005-000 | |
| Micro-CT Scanner | Bruker microCT | SkyScan 1176 | |
| Dental wax | Kerr Dental Laboratory | 623 | |
| Foam (Backer Rod) | Rona | CF12086 | 1”x10’ |
| Plastic tube | Bruker microCT | SP-3010 | |
| Carbon-fiber bed | Bruker microCT | SP-3002 | |
| Vet Wrap/Bandage | Dura-Tech | 17473 | |
| Ophthalmic Gel | OptixCare | 006CLC-4256 | Antibiotic-free |
| Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 |
References
- Longo, A. B., Sacco, S. M., Salmon, P. L., Ward, W. E. Longitudinal use of micro-computed tomography does not alter microarchitecture of the proximal tibia in sham or ovariectomized sprague-dawley rats. Calcif Tissue Int. 98 (6), 631-641 (2016).
- Sacco, S. M., et al. Repeated irradiation from micro-computed tomography scanning at 2, 4 and 6 months of age does not induce damage to tibial bone microstructure in male and female CD-1 mice. Bonekey Rep. 6, 855 (2017).
- Waarsing, J. H., Day, J. S., Verhaar, J. A., Ederveen, A. G., Weinans, H. Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats. J Orthop Res. 24 (5), 926-935 (2006).
- Klinck, R. J., Campbell, G. M., Boyd, S. K. Radiation effects on bone architecture in mice and rats resulting from in vivo micro-computed tomography scanning. Med Eng Phys. 30 (7), 888-895 (2008).
- Laperre, K., et al. Development of micro-CT protocols for in vivo follow-up of mouse bone architecture without major radiation side effects. Bone. 49 (4), 613-622 (2011).
- Brouwers, J. E., van Rietbergen, B., Huiskes, R. No effects of in vivo micro-CT radiation on structural parameters and bone marrow cells in proximal tibia of wistar rats detected after eight weekly scans. J Orthop Res. 25 (10), 1325-1332 (2007).
- Francisco, J. I., Yu, Y., Oliver, R. A., Walsh, W. R. Relationship between age, skeletal site, and time post-ovariectomy on bone mineral and trabecular microarchitecture in rats. J Orthop Res. 29 (2), 189-196 (2011).
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Longo, A. B., et al. Lifelong intake of flaxseed or menhaden oil to provide varying n-6 to n-3 PUFA ratios modulate bone microarchitecture during growth, but not after OVX in Sprague-Dawley rats. Mol Nutr Food Res. 61 (8), (2017).
- Sacco, S. M., Saint, C., LeBlanc, P. J., Ward, W. E. Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring. Nutrients. 9 (3), 250 (2017).
- Campbell, G. M., Buie, H. R., Boyd, S. K. Signs of irreversible architectural changes occur early in the development of experimental osteoporosis as assessed by in vivo micro-CT. Osteoporos Int. 19 (10), 1409-1419 (2008).
- De Schaepdrijver, L., Delille, P., Geys, H., Boehringer-Shahidi, C., Vanhove, C. In vivo longitudinal micro-CT study of bent long limb bones in rat offspring. Reprod Toxicol. 46, 91-97 (2014).
- Perilli, E., et al. Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized, zoledronic acid-treated, and sham-operated rats. Osteoporos Int. 21 (8), 1371-1382 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Li, H., Zhang, H., Tang, Z., Hu, G. Micro-computed tomography for small animal imaging: Technological details. Progress in Natural Science. 18 (5), 513-521 (2008).
- Campbell, G. M., Sophocleous, A. Quantitative analysis of bone and soft tissue by micro-computed tomography: applications to ex vivo and in vivo studies. Bonekey Rep. 3, 564 (2014).
- Meganck, J. A., Kozloff, K. M., Thornton, M. M., Broski, S. M., Goldstein, S. A. Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD. Bone. 45 (6), 1104-1116 (2009).
- Vazquez, C. M., Molina, M. T., Ilundain, A. Role of rat large intestine in reducing diarrhea after 50% or 80% distal small bowel resection. Dig Dis Sci. 34 (11), 1713-1719 (1989).
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats. BMC Vet Res. 10, 198 (2014).
- Schmitz, S., Tacke, S., Guth, B., Henke, J. Comparison of physiological parameters and anaesthesia specific observations during isoflurane, ketamine-xylazine or medetomidine-midazolam-fentanyl anaesthesia in male guinea pigs. PLoS One. 11 (9), e0161258 (2016).
- Stevens, W. C., et al. Comparative toxicities of halothane, isoflurane, and diethyl ether at subanesthetic concentrations in laboratory animals. Anesthesiology. 42 (4), 408-419 (1975).
