Imaging нейронной активности в первичной соматосенсорной коры, с помощью Thy1-GCaMP6s трансгенных мышей

Все хирургические и животных обработки процедуры выполнялись, утвержденных согласно руководству для ухода и использования лабораторных животных (Национальный исследовательский совет) и руководящих принципах Индиана университета Школа медицины институциональных животных ухода и использования Комитета. Схематическая Иллюстрация изображения установки 2-Фотон показан на рисунке 1. 1. Подготовка животного для изображений Стерильные марлевые место, ватные тампоны и автоклавного хирургические инструменты в области хирургии (Таблица 1). Включите микро шарик стерилизатор для intersurgery стерилизации хирургических инструментов. Анестезировать мыши (мужского или женского пола, 1,5 – 2,5 месяца, 20 – 25 g) внутрибрюшинной инъекции (и.п.) смеси кетамин (17,2 мг/мл), Ксилазина (0.475 мг/мл) и acepromazine (0,238 мг/мл) (6 мкл/г веса тела). Подождите, пока надлежащего глубины анестезии достигается, когда животное перестает реагировать на мыс щепотку стимулом и имеет не роговицы рефлекс. Во время операции, дать бустерной дозы 1/3 первоначальная доза коктейль как цистит необходимо поддерживать исходное состояние анестезии. Подкожно вводить бупренорфин (s.c.; 0,05-0,10 мг/кг) как болеутоляющее агента до операции. Применять защитные мази в глаза животного, чтобы не образовывались роговицы сушки и катаракты. Место GCaMP6s трансгенные мыши на грелку для предотвращения переохлаждения и накрыть стерильные хирургические пелерина. Стабилизируйте голова животного с главой холдинга адаптер для мышей. Бритье головы над большей частью волосистой части головы с лезвием бритвы двойной края. Очистите зоне хирургические стерильные спиртом салфеткой подготовки, следуют повидон йод раствор. 2. хронический черепной окно подготовки Сделайте прямоугольный разрез кожи головы (2 x 3 мм) с ножницами на одной стороне (справа) черепа. Нажмите сторону кожи ватным тампоном для создания экспозиции области > 3 мм в диаметре (рис. 3A). Удалите в соединительной ткани, прилагается к черепу нежно соскабливания черепа с тупым микрохирургическое лезвием (скальпель лезвие #10; Рисунок 3 c). Марк области S1, нежно Рисование круга (3 мм в диаметре, центр координации: -1,5 мм от bregma и 2,5 мм от средней линии) на черепа с помощью Стоматологическая сверла (рис. 2B). Выполните ту же процедуру на левой черепа (рис. 2B). Нанесите тонкий слой Цианакрилатный клей супер кости для обеспечения основы для стоматологического цемента приложения. Под микроскопом рассечения тонкие вниз круговой паз в черепа вокруг области S1, используя высокоскоростной microdrill (рис. 3D). Цель заключается в том, чтобы создать гладкие края для размещения оптического окна на него. Неоднократно применять искусственные спинномозговой жидкости (ФАГО, комнатной температуры) к черепу периодически во время процесса прореживания для облегчения бурения и рассеивать тепло. Выполните бурение периодически, чтобы избежать трения индуцированной перегрева. Сосать вне мусора кости с дом разрежением или вакуумного насоса. После приблизительно 2/3 глубины кости сверлится, медленно и осторожно тонкие кости оставшиеся 1/3 до тех пор, пока круговой часть черепа (костного лоскута) является полностью свободным от окружающих черепа. Медленно и осторожно удалите круговой кости лоскут с парой # 5/45 щипцов и разоблачить Дура (рис. 2 c; Рисунок 3E). Держите подвергаются мозга регионе влажным с Фаго (Рисунок 3E). Избегайте повреждений сетчаточных судам, поскольку кровоизлияния изменения мозгового кровотока, ускорит отек мозга и серьезно ухудшить качество изображения. Выполните ту же процедуру на левой стороне (контралатеральной) черепа. Для монтажа оптического окна, используйте оптический клей клей и лечения между coverglass слоями один на один раз. При необходимости, теплый Оптические окна (50 ° C за 12 ч) в инкубаторе для повышения клеевое соединение. Оптическое окно содержит 2 части: Верхняя часть содержит один раунд крышки стекла с диаметром 5 мм и в нижней части содержит 1-3 круглая крышка очки с диаметром 3 мм (рис. 2D). Хранить оптическое окно в этаноле (70%, vol/vol) и промойте его с стерильного физиологического раствора перед использованием. Перед установкой оптических окон проверьте оптическое окно на недостатки, включая неправильное количество оптических выравнивание клей или неточной под стереоскоп. Установите оптический окно над районом Краниотомия (Рисунок 2D). В верхней части окна оптических лежит на черепе и в нижней части окна оптических вписывается в craniotomized открытия и опирается на Дура присутствии CSF (Рисунок 2D, E). Печать в верхней части край оптического окна черепа с Цианакрилатный клей супер, (Рисунок 2F; Рисунок 3F). Когда Цианакрилатный клей супер высохнет, применять черный стоматологического цемента (Dentsply) для покрытия края стекла. Применить стоматологического цемента для всех выставленных черепа и ранение поля блокировать свет (Рисунок 2 g-H; Рисунок 3B). Выполните ту же процедуру с левой стороны. Разрешить животное, чтобы восстановить на грелку и вернуть его домой клетку для восстановления при необходимости мониторинга животного. Предоставлять мокрый продовольствие для облегчения жевания и гидратации. Чтобы уменьшить боль, администрировать бупренорфин s.c. (0,05 – 2,0 мг/кг) каждые 8-12 h посттравматические за 2 дня. Позволяет мыши, чтобы восстановить еще 7-10 дней до изображений. 3. два фотонных изображений В день эксперимента анестезировать животное с кетамином и ксилазина (дозы и поддержание анестезии, как описано выше). Очистите окно черепа с 75% (vol/vol) этанола. Поместите курсор мыши под изображений установка, состоящая из 2P микроскоп и холдинг адаптер голову, опираясь на грелку с его головкой, иммобилизованные через ухо баров, придает мыши держатель. Одна сторона изображения Оптические окна одновременно. Чтобы свести к минимуму оптических аберраций, убедитесь, что оптические окна и правой черепа, ориентированные перпендикулярно оптической оси микроскопа. Сфотографировать первоначального окна черепа с яркой области освещения при 4-кратном как Справочная карта для регистрации с выше увеличение 2P ангиографий (1рис. 4A). Увеличение области интересов, используя 10 крат (2рис. 4A). Выберите область интереса в области S1 в кортикального слоя I или II (до 150 мкм ниже поверхности сетчаточных). Если увеличение, используйте объектив с 20 X. Поиск поля зрения с несколькими нейронами. Получение изображений с помощью микроскопа 2P (рис. 4В). Определите время экспозиции и уровень света возбуждения (≈910 Нм), основанный на глубину и уровень экспрессии GCaMP6s, с более слабых сигналов, требующих длительного времени экспозиции и согласно меньше времени резолюции. Мы обычно используем ~ 4 микросекунды на пиксель выдержек. Получение изображений с частотой кадров 3 – 5 Гц с разрешением в 512 × 512 пикселей. Начните запись временных рядов. Хранить координаты каждого региона интерес (ROI) относительно сосудистого рисунка или координатных точек в малое увеличение изображения. Образ же рентабельность инвестиций с течением времени. Выполните ту же процедуру наблюдать динамику кальция области S1 на левом полушарии. Рассчитайте изменения в флуоресцировании от каждого ROI. Получать изображения, либо индивидуально, либо как промежуток времени фильм (Рисунок 4 c1-C3, D, E). Исследования коры головного мозга крови поток динамика в vivo изображения Краски флуоресцентные декстрана вводят в Вену хвост грызунов с 2 P микроскопии. Используйте vasculatures в качестве достопримечательности признать и изображения же ROI в imaging сессий в течение длительного периода времени. 4. обработка данных Используйте для анализа изображений ImageJ и происхождения. Импорта последовательностей изображений с ImageJ (Рисунок 5A-B). Для отдельных изображений (или t серия фильмов) выберите ROI в образ нейрон и 2 отдельных соседних регионов для фона измерения (рис. 5 c). Приобрести общая интенсивность с диспетчером ROI (рис. 5C).Примечание: На рисунке 6 показан представитель кальция изображений. Кальция переходные (зеленый) и сосудов (красный) Показать в разное время точки в секундах (рис. 6A-D) в мыши на 7 d после первоначального окна установки. Показано также z проекция периода 3 мин записи для каналов Красный и зеленый (рис. 6E) или зеленый канал (рис. 6F). Z проекция отображает сжатый образ всех изображений в фильм, из которого грубой и круг границы (включая объект нейрон интерес во всех кадрах) выбран вручную а также выбор независимых близлежащие регионы фон ( 2 Рисунок 6 g). От каждого ROI, рассчитать среднее флуоресценции фон FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 и изменения флюоресценции Сома (F) в виде ΔF/Ф, ΔF/F = (F-FB) / FB. Выполните анализ пик, шаг за шагом с помощью функций ImageJ, включая коррекция базовой линии, пик вывод/определение, интеграции пик, пик фитинг или функции анализа пик Time-Saving.