التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا
Summary
يصف لنا إجراء تجريبي لقياس نشاط الخلايا العصبية من خلال النوافذ الضوئية المزدوجة أعلاه الثنائية كورتيسيس الأولية somatosensory (S1) في Thy1-GCaMP6s الفئران المعدلة وراثيا باستخدام 2-فوتون (ف 2) الفحص المجهري في فيفو.
Abstract
معارض الدماغ الثدييات تماثل ملحوظ عبر الطائرة السهمي. ومع ذلك، وصف مفصل لديناميات العصبية في مناطق الدماغ متماثل في الحيوانات الثديية الكبار لا يزال بعيد المنال. في هذه الدراسة، يصف لنا إجراء تجريبي لقياس ديناميات الكالسيوم من خلال النوافذ الضوئية المزدوجة أعلاه الثنائية كورتيسيس الأولية somatosensory (S1) في Thy1-GCaMP6s الفئران المعدلة وراثيا باستخدام الفحص المجهري (ع 2) 2-فوتون. هذا الأسلوب من التسجيلات وكوانتيفيكيشنز للنشاط العصبي في مناطق الدماغ الماوس ثنائي واحد في وقت في التجربة نفسها لفترة طويلة فترة في فيفو. وتشمل الجوانب الرئيسية لهذا الأسلوب، الذي يمكن أن تكتمل في غضون ساعة، الجراحات الإجراءات لإنشاء windows الضوئية المزدوجة، واستخدام التصوير ف 2. على الرغم من أن نظهر فقط التقنية في مجال S1، يمكن تطبيق الأسلوب إلى مناطق أخرى من الدماغ المعيشة تسهيل توضيح تعقيدات الهيكلية والوظيفية للشبكات العصبية في الدماغ.
Introduction
الكالسيوم ولائحته ضرورية في التوسط في عمليات فسيولوجية متعددة. رصد ديناميات الكالسيوم مفيد لفهم وظيفة المخ المعتادة، فضلا عن الحالات المرضية في الدماغ اضطرابات 1،2،3،،من45،6 ،،من78. التصوير الأسفار GCaMP6s أداة قوية للتحديد الكمي لأرقام سبايك، توقيت، والتردد، فضلا عن مستويات متشابك المدخلات في المختبر و في فيفو 9،،من1011.
معارض الدماغ الثدييات تماثل ملحوظ عبر الطائرة السهمي. على الرغم من أن البحوث العصبية الأخيرة قد ألقي الضوء على يعيد البناء القشرية ونشاط الخلايا العصبية الناجمة عن صدمات الدماغ أو النخاع الشوكي إصابة 6،7، الأدوار تلك الأنسجة سليمة من شكل متناظر تلعب المناطق المقابلة في الانتعاش، لا تزال غامضة.
في هذه الدراسة، ونحن تصف الإجراءات التجريبية لإنشاء windows البصري متماثل الثنائية للتصوير في فيفو . استخدام هذه النوافذ الضوئية، ونحن تصف قياس ديناميات الكالسيوم من كورتيسيس الأولية somatosensory (S1) في الفئران المعدلة وراثيا GCaMP6s استخدام الفحص المجهري ف 2. في المقطع “النتائج”، نعرض أيضا في فيفو مورفولوجيا الجذعية في نقاط زمنية مختلفة في منطقة S1 في الفئران المعدلة وراثيا اجفب استخدام التصوير ف 2. أسلوب المراقبة فيما يتعلق بديناميات الشبكة في المجالات الثنائية S1 ولكن مثال أولى كيف المزدوج ويندوز الجمجمة مفتوحة سوف يساعد علماء الأعصاب للتحقيق المحلي ومتماثل معالجة المعلومات في الدماغ الثدييات الكبار في العادي الظروف أو في أمراض مختلفة النماذج في فيفو.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصوير اثنين-فوتون يمكن قياس نشاط العديد من الخلايا بدقة معقولة في ما يصل إلى حوالي 800 ميكرون أسفل سطح الدماغ المتزامنة. نحن متكاملة ف 2 وتقنية نافذة ضوئية مزدوجة مع GCaMP6s وراثيا المرمزة لمراقبة ديناميات الكالسيوم في سكان سوماتى الخلايا العصبية طبقة الخامس يقع > 500 ميكرومتر أدناه pia. مع نافذة بصرية مفتوحة على كل جانب من الجمجمة، يتيح الأسلوب تسجيلات للنشاط العصبي عبر مناطق الدماغ الثدييات متماثل للكالسيوم طويلة ومستقرة فيفو فيالتصوير. تشمل الجوانب الرئيسية لهذا الأسلوب أداء الجراحات لإنشاء windows الضوئية المزدوجة فتح الجمجمة وتصوير ف 2 من نشاط الخلايا العصبية في مناطق S1 متناظرة.
دراسة نشاط الشبكة في مناطق S1 الثنائية مثال عن كيف المزدوج ويندوز الجمجمة يمكن أن تستخدم للتحقيق في المعلومات المحلية ومتماثل في الدماغ الكبار فيفو فيتجهيز. كما يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة نشاط الخلايا العصبية (مثل استخدام Thy1-GCaMP6s الفئران) واللدونه القشرية B6. الفريق الاستشاري–تيراغرام (Thy1-يفب) هجرس/ي من أنسجة سليمة المناطق المقابلة متماثل في الانتعاش بعد ديفيرينتيشن نتيجة لإصابة الجهاز العصبي المركزي انفرادية. يمكن أيضا استخدام الأسلوب لدراسة نشاط القشرية استجابة لاستراتيجيات تنشيط الأجهزة الطرفية مثل أوبتوجينيتيك، التحفيز الكهربائية أو الكيميائية. على الرغم من أن نظهر فقط التقنية في مجال S1، يمكن استخدام هذا النهج للتحقيق في أنشطة في مجالات أخرى متماثل في الدماغ المعيشة مثل الخلايا العصبية طبقة الخامس من القشرة الحركية الأولية (M1). ملاحظات بشأن إعادة تنظيم مناطق الدماغ قد يوفر ركيزة العصبية للسلوك الحركي التكيفية، التي تلعب دوراً حاسما في استعادة وظيفة بوستينجوري. كما أنه يسمح لقياس نشاط الخلايا المحددة وراثيا متناظرة المزمنة خلال السلوك في الفئران ثابت رئيس.
من الناحية التقنية، المحققين ينبغي إيلاء اهتمام دقيق للجودة والاتساق في windows الجمجمة المزدوجة. نافذة الجمجمة جمجمة ضعفت تقنية 12 ينصح بشدة للمبتدئين للممارسة. هي الأشواك المقصورات الكالسيوم بسبب مورفولوجيا والآليات المحلية من تدفق والنتوء. في هذه الدراسة، استخدمنا B6. الفريق الاستشاري–تيراغرام (Thy1-يفب) هجرس/ياء الفئران كمثال لتوضيح العمود الفقري الجذعية الديناميات في فيفو (الشكل 4). قد يتسبب تثبيت نافذة زجاجية فتح الجمجمة دوران العمود الفقري عالية وردود الدبقية رد الفعل بعد الجراحة 12. على النقيض من ذلك، مع تقنية الإطار ضعفت الجمجمة، العمود الفقري و dendrites يمكن أيضا الحفاظ على.
خيارات الأبعاد وسمك من windows الضوئية سوف تعتمد على مجال الرؤية المنشودة، وانحناء الجمجمة، سمك الجمجمة، ونوع التصوير 13. عدم كفاية ضغط كوفيرجلاسيس الضوئية في بلده دوراً قد يسبب سماكة دوراً، نمو الجمجمة، وزادت الحركة الدماغ. وفي المقابل، الضغط المفرط من كوفيرجلاسيس البصرية قد تعوق تدفق الدم القشرية.
للجمعية العامة نافذة ضوئية، الصق وعلاج طبقات إضافية من كوفيرجلاسيس واحد في وقت واحد مع لاصق الضوئية والطول الموجي الطويل الأشعة فوق البنفسجية. للمساعدة على تعزيز ارتباط لاصق، الحارة النافذة ملفقة في حاضنة (50 درجة مئوية، ح 12). تخزين كوفيرجلاس نافذة ضوئية في الإيثانول 70% (المجلد/المجلد)، وقبل الجراحة، شطف مع المالحة العقيمة. النافذة الضوئية يحتاج إلى دراسة لعيوب (مثل مبلغ غير صحيح لمحاذاة لاصقة أو غير دقيقة البصري) تحت ستيريوسكوبي قبل استخدامها لتجنب الفشل. إذا كان بصري لاصقة رقيقة جداً، ممنوع الهواء قد تكون مجعدة، التي يمكن أن تسبب الانحرافات البصرية أو الزجاج غطاء مفرزة في غرس. وفي المقابل، يمكن أن يسبب الكثير لاصقة الضوئية تجاوز الماضي حواف الإطار الجمجمة.
وخلاصة القول، هنا يصف لنا إجراء تجريبي لقياس ديناميات الكالسيوم أو مورفولوجيا الجذعية من خلال windows الجمجمة من 2 متماثل الأولية somatosensory القشرية المناطق في Thy1-GCaMP6s و Thy1-يفب الفئران المعدلة وراثيا، على التوالي، باستخدام الفحص المجهري ف 2. وقد يسهل هذا الأسلوب تشريح العلاقة الهيكلية والوظيفية المعقدة للشبكات العصبية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون جداً لقان وينبياو (معهد سكيربال، قسم علم وظائف الأعضاء وعلم الأعصاب، نيويورك جامعة مدرسة الطب، الولايات المتحدة الأمريكية) للإرشادات التقنية الممتازة ورالي باتي، المحرر الطبي (قسم الجراحة العصبية، إنديانا كلية جامعة الطب)، لتحرير المخطوطة. ونحن نشكر الدكتور لقي تشين (معهد بحوث علوم الأعصاب ستارك، كلية الطب بجامعة إنديانا، الولايات المتحدة الأمريكية) لتوفير B6. الفريق الاستشاري–تيراغرام (Thy1-يفب) هجرس/ياء الفئران. هذا العمل كان في الجزء التي تدعمها مؤسسة مدير المستشفى العام لمنطقة جينان العسكرية لجيش Chines 2016ZD03 (زيل)، والمعاهد الوطنية للصحة NS059622، NS073636، وزارة الدفاع كدمرب W81XWH-12-1-0562، تستحق الاستعراض جائزة I01 BX002356 من “إدارة الولايات المتحدة لقدامى المحاربين” الشؤون، كريغ ح نيلسون مؤسسة 296749، إنديانا الحبل الشوكي والدماغ إصابة مؤسسة البحوث، هولمان ماري جورج أموال الهبات (إكسمكس).
Materials
| C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
| B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
| Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
| Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
| Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
| Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
| Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
| Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
| Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
| Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | – | – | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. Functional specialization of mouse higher visual cortical areas. Neuron. 72 (6), 1025-1039 (2011).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475 (7357), 501-505 (2011).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat Neurosci. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Katona, G., et al. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Zhang, K., et al. Remodeling the Dendritic Spines in the Hindlimb Representation of the Sensory Cortex after Spinal Cord Hemisection in Mice. PLoS One. 10 (7), e0132077 (2015).
- Keck, T., et al. Synaptic scaling and homeostatic plasticity in the mouse visual cortex in vivo. Neuron. 80 (2), 327-334 (2013).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular resolution functional imaging in behaving rats using voluntary head restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Luongo, F. J., Horn, M. E., Sohal, V. S. Putative Microcircuit-Level Substrates for Attention Are Disrupted in Mouse Models of Autism. Biol Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
- Wachowiak, M., et al. Optical dissection of odor information processing in vivo using GCaMPs expressed in specified cell types of the olfactory bulb. J Neurosci. 33 (12), 5285-5300 (2013).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
