Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

Tüm cerrahi ve hayvan işleme yordamlarını Kılavuzu altında bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı (Ulusal Araştırma Konseyi) ve Indiana Üniversitesi okul tıp kurumsal hayvan bakım ve kullanım yönergeleri için onaylanmış yapıldı Komitesi. 2-foton görüntüleme kurulumunun şematik resim 1′ de gösterilen. 1. hayvan görüntüleme için hazırlanması Steril gazlı bez, pamuk temizleme bezi ve autoclaved cerrahi araçlar cerrahi alan (Tablo 1) yerleştirin. Bir mikro boncuk Sterilizatör cerrahi araçlar intersurgery sterilizasyon için açın. Fare (erkek veya kadın, 1,5-2,5 ay, 20-25 g) mayi enjeksiyonu (IP) ketamin (17.2 mg/mL), xylazine (0.475 mg/mL) ve acepromazine (0,238 mg/mL) (6 µL/g vücut ağırlığı) karışımı ile anestezi. Ne zaman hayvan için bir ayak çimdik uyarıcı cevap sona erer ve hiçbir Korneal refleks uygun anestezi derinliği ulaşılana kadar bekleyin. Ameliyat sırasında bir booster doz ver 1/3’ü anestezi kokteyl olarak özgün doz özgün anestezik durumunu korumak gerekli. Buprenorfin subkutan enjekte (s.c.; 0.05-0.10 mg/kg) ameliyat öncesi bir analjezik ajan olarak. Koruyucu merhem kornea kurutma ve katarakt oluşumunu önlemek için hayvan gözler için geçerlidir. GCaMP6s transgenik fare hipotermi önlemek ve steril cerrahi örtüsü ile yeterli bir ısıtma yastığı yerleştirin. Hayvanın kafa fareler için bir kafa tutan adaptörü ile sabitleyin. Çoğu çift kenar jilet ile kafa derisi üzerinde kafa tıraş. Povidone-iyot çözüm tarafından takip steril alkol hazırlık pad ile cerrahi alanı temizleyin. 2. kronik kafatası pencere hazırlık Bir tarafta (sağda) kafatası makas ile kafa derisi (2 x 3 mm) dikdörtgen bir kesim yapmak. Bir çekim alanı oluşturmak için bir kenara bir pamuklu çubukla kabuğuyla itmek > 3 mm çapında (Şekil 3A). Kafatası Yavaşça bir künt mikrocerrahi bıçakla (neşter Blade #10; kafatası kazıma bağlı bağ dokusu kaldırmak Şekil 3 c). Yavaşça bir daire çizerek S1 alanını işaretlemek (3 mm çapında, merkezi koordinasyon: bregma ve orta hat üzerinden 2.5 mm-1.5 mm) (Şekil 2B) bir diş kullanarak kafatasında matkap. Aynı yordamı sol kafatasında (Şekil 2B) gerçekleştirin. Diş çimento uygulama için bir temel sağlamak için kemiğe Cyanoacrylate süper tutkal ince bir tabaka uygulayın. İnce diseksiyon mikroskop altında kafatası yüksek hızlı microdrill (şekil 3D) kullanarak S1 çevresinde dairesel bir oluk aşağı. Üstüne görme duyusuyla ilgili bir pencere için düz bir kenar oluşturmak için amaçtır. Sürekli olarak yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF, oda sıcaklığında) kafatası sondaj kolaylaştırmak ve ısı dağılımı için düzenli aralıklarla inceltme işlemi sırasında uygulanır. Zaman zaman sürtünme kaynaklı aşırı ısınmayı önlemek için sondaj gerçekleştirin. Uzakta bir ev vakum hattı veya bir vakum pompası ile kemik enkaz emer. Yaklaşık 2/3 derinlik kemik delinmiştir sonra yavaş ve dikkatli kafatasından (kalp kapakcıgını) dairesel bir parça çevreleyen kafatasından tamamen boşalana kadar kalan 1/3 kemik ince. Yavaş ve dikkatli bir çift # 5/45 forseps ile dairesel kalp kapakcıgını kaldırmak ve dura (Şekil 2C; maruz Şekil 3E). Maruz kalan beyin bölgesi ACSF (Şekil 3E) ile nemli tutmak. Kaçının pial gemiler, herhangi bir hasar beri kanama serebral kan akımı alter, beyin şişmesi hızlandırmak ve ciddi biçimde görüntü kalite bozulmasına yol açar. Aynı yordamı kafatası (kontralateral) sol tarafında gerçekleştirmek. Optik pencere montajı için kullanım optik yapıştırıcı tutkal ve coverglass arasında tedavi için tek tek katmanlar. Gerekirse, yapışkanlı bağ geliştirmek için bir kuluçka optik penceresinde (12 h 50 ° C) sıcak. Optik pencere 2 bölümleri içerir: üst kısmı 5 mm çapında tek bir yuvarlak kapak cam ve alt bölümü 1 – 3 yuvarlak kapak gözlük 3 mm (Şekil 2B) çapında içerir. Optik pencere etanol (% 70, vol/vol) depolamak ve kullanımdan önce steril serum fizyolojik ile durulayın. Optik pencere montaj önce kusurları, optik yapışkanlı veya yanlış hizalama’nın altında bir stereoscope yanlış bir miktarı için optik penceresini denetleyin. Optik pencere kranyotomi bölgede (Şekil 2B) yükleyin. Optik pencerenin üst kısmındaki kafatasında aittir ve optik pencerenin alt kısmındaki craniotomized açılış içinde uyuyor ve dura CSF (2D rakam, E) huzurunda dayanmaktadır. Kafatası Cyanoacrylate süper yapıştırıcı (2F rakam; ile optik pencere kenarına üst kısmı mühür Şekil 3F). Cyanoacrylate süper tutkal kuruduktan siyah diş çimento (Dentsply cam kenarına karşılamak için) uygulanır. Diş çimento maruz kafatasına uygulamak ve ışık (Şekil 2 g-H; engellemek için kenar boşluklarını yara Şekil 3B). Sol taraftaki aynı yordamı gerçekleştirin. Hayvan ısıtma yastığını yeniden elde etmek ve uygun izleme altında kurtarma için ev onun kafes hayvan dönmek izin. Çiğneme ve nemlendirme kolaylaştırmak için ıslak yiyecek sağlamak. Ağrı azaltmak için buprenorfin yönetmek SC (0,05-2.0 mg/kg) 2 gün boyunca her 8 – 12 h postinjury. Fareyi kurtarmak izin vermek için ek bir 7-10 gün önce görüntüleme. 3. iki fotonlu görüntüleme Deneme günü, ketamin ve xylazine (doz ve yukarıda açıklandığı gibi anestezi bakımından) hayvanla anestezi. (vol/vol) etanol ile kafatası pencere temizle. 2 P mikroskop ve kafa tutan bir ısıtma yastığı kafasının bir fare kafa sahibine bağlı kulak barlar ile immobilize ile dinlenme adaptör, oluşan bir görüntüleme ayarı altında fareyi getirin. Optik penceresinin bir tarafında bir anda görüntü. Optik anomalileri en aza indirmek için optik pencere ve sağ kafatası mikroskop optik eksen odaklı dik olduğundan emin olun. Parlak alan aydınlatma ile kafatası penceresinin bir ilk resmi 4 x büyütme ile daha yüksek büyütme 2 P angiographies (Şekil 4A1) kaydı için bir başvuru harita olarak atın. 10 x büyütme (Şekil 4A2) kullanarak ilgi alan üzerinde yakınlaştırır. Seçin bir S1 alanda ilgi alanı kortikal katmanlarda ı ya da II (en çok 150 µm pial yüzeyinin altında). Yüksek büyütme isterseniz bir 20 X hedefi kullanın. Görüş alanı birden çok nöronlar ile arayın. 2 P mikroskop (Şekil 4B) kullanarak görüntüleri elde etmek. Pozlama süresi ve derinliği dayalı uyarma ışık (≈910 nm) ve ifade düzeyini GCaMP6s, zayıf sinyalleri uzun pozlama süreleri gerektiren ve önemlisi daha az zaman çözünürlüğü belirleyin. Biz genellikle ~ 4 µs başına piksel pozlama süreleri kullanın. 3-5 Hz kare hızları 512 × 512 piksel çözünürlükte görüntüler elde etmek. Saat serisi kaydetmeye başlayın. Faiz (ROI) indirgeme puan veya vasküler desen göre her bölgesinin koordinatlarını düşük büyütme görüntüler içinde saklar. Aynı YG zaman içinde görüntü. S1 alanının sol hemisfer dinamikleri kalsiyum gözlemlemek için aynı yordamı gerçekleştirin. Floresans her yatırım getirisi gelen değişiklikleri hesaplamak. Görüntüleri tek tek veya Hızlandırılmış film (Şekil 4 c1-C3, D, E) olarak elde. Kortikal kan akışı dynamics in vivo kemirgenler 2 P mikroskobu ile kuyruk ven içine enjekte floresan dextran boyalar Imaging tarafından çalışma. Vasculatures yerler tanımak ve uzun sürelerle oturumları Imaging’de aynı YG resim kullanın. 4. veri işleme ImageJ ve kaynak görüntü analizi için kullanın. ImageJ (Şekil 5A-B) görüntü sıralarıyla alın. Tek tek görüntüleri (veya t-serisi filmler), görüntülü bir neuron ve 2 yakın bölgeler arka plan ölçüm (Şekil 5C) için ayrı bir yatırım getirisi seçin. Toplam yoğunluğu elde etmek bir yatırım getirisi Yöneticisi (Şekil 5C).Not: Şekil 6 temsilcisi kalsiyum görüntüleri gösterir. Kalsiyum geçici (yeşil) ve kan damarı (kırmızı) farklı zaman noktalarda ilk pencere kurulumdan sonra saniye (Şekil 6A-D) 7 d Mouse göster. Z-projeksiyon için kırmızı ve yeşil kanallarını (Şekil 6E) veya yeşil kanal (Şekil 6F) 3 dk kayıt döneminin de gösterilir. Bir z-projeksiyon tüm resimler sıkıştırılmış bir görüntüsünü (tüm çerçeveleri ilgi nesnesi nöron kapsayan) bir kaba ve daire sınır el ile yanı sıra 2 arka plan bölgeleri ( bağımsız seçim seçilmiş olduğunu film görüntüler Şekil 6G). Her yatırım getirisi ortalama floresans arka FB, FB hesaplamak (FB1 + FB2) = / 2 ve soma (F) Floresan değişiklikleri ifade olarak ΔF/F, ΔF/F (F-FB) = / FB. Adım adım temel düzeltme, en yüksek bulma/belirlenmesi, tepe tümleştirme, tepe uygun, ve/veya Time-Saving en yüksek çözümleme özellikleri de dahil olmak üzere ImageJ işlevlerini kullanarak en yüksek çözümlemesi gerçekleştirin.