Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

Alle chirurgischen und Tier Handhabung wurden durchgeführt, als unter der Führung für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Research Council) und die Leitlinien der Indiana Universität Schule von Medizin institutionelle Animal Care und Nutzung genehmigt Ausschuss. Die schematische Darstellung des 2-Photon imaging Setup ist in Abbildung 1dargestellt. 1. Vorbereitung des Tieres für die Bildgebung Statt steriler Gaze, Wattestäbchen und autoklaviert chirurgische Instrumente im OP-Bereich (Tabelle 1). Schalten Sie ein Mikro Perle Sterilisator für intersurgery Sterilisation chirurgischer Instrumente. Die Maus (männlich oder weiblich, 1,5 – 2,5 Monate, 20 – 25 g) durch intraperitoneale Injektion (i.p.) aus einer Mischung von Acepromazine (0,238 mg/mL) (6 µL/g Körpergewicht), Ketamin (17,2 mg/mL) und Xylazin (0,475 mg/mL) zu betäuben. Warten Sie, bis die richtige Tiefe der Narkose erreicht ist, wenn das Tier nicht mehr auf einen Zeh Prise Reiz reagieren und keine Hornhaut Reflex hat. Während der Operation geben eine Booster-Dosis von 1/3 die ursprüngliche Dosis des Betäubungsmittels als cocktail mußte die Narkose Originalzustand beibehalten. Buprenorphin subkutan zu injizieren (s.c.; 0,05-0,10 mg/kg) als schmerzstillende Mittel vor der Operation. Gelten Sie schützende Salbe für die Augen des Tieres, Hornhaut trocknen und Katarakt-Bildung zu verhindern. Legen Sie eine GCaMP6s transgenen Maus auf ein Heizkissen zu verhindern Hypothermie und bedecken Sie es mit einem sterilen OP-Tuch. Stabilisieren Sie den Kopf des Tieres mit einem Kopf halten Adapter für Mäuse. Rasieren des Kopfes über den größten Teil der Kopfhaut mit einer Rasierklinge zweischneidiges. Reinigen Sie den OP-Bereich mit einem sterilen Vorbereitung Alkoholtupfer gefolgt von Povidon-Jod-Lösung. 2. chronische kranialen Fenster Vorbereitung Machen Sie einen rechteckigen Schnitt der Kopfhaut (2 x 3 mm) mit einer Schere auf einer Seite (rechts) des Schädels. Drücken Sie die Haut mit einem Wattestäbchen erstelle ich ein Belichtungsbereich von > 3 mm im Durchmesser (Abb. 3A). Entfernen Sie das Bindegewebe befestigt an den Schädel durch vorsichtig abkratzen des Schädels mit einem stumpfen mikrochirurgischen Messer (Skalpell Klinge #10; Abbildung 3). Markieren Sie den Bereich S1 sanft einen Kreis gezeichnet (3 mm im Durchmesser, Zentrum Koordination:-1,50 mm von der Bregma und 2,5 mm von der Mittellinie) auf den Schädel mit einem Dental bohren (Abb. 2 b). Führen Sie das gleiche Verfahren auf der linken Schädel (Abb. 2 b). Wenden Sie eine dünne Schicht Cyanacrylat Super Glue bis auf die Knochen um eine Basis für dental Zement Anwendung bereitzustellen. Unter dem sezierenden Mikroskop dünn auf eine kreisförmige Nut in den Schädel um den S1-Bereich mit einem High-Speed-Microdrill (Abbildung 3D). Das Ziel ist die Schaffung eine glatte Kante für die Platzierung eines optischen Fensters drauf. Immer wieder gelten Sie künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS, Raumtemperatur) für den Schädel in regelmäßigen Abständen während der Ausdünnung Prozess zu erleichtern, Bohren und Wärme. Führen Sie das Bohren zeitweise um Reibung-induzierte eine Überhitzung zu vermeiden. Nuckeln Sie die Knochen-Trümmer mit einem Haus Vakuumleitung oder einer Vakuumpumpe. Nach ca. 2/3 Tiefe der Knochen gebohrt wird, langsam und vorsichtig dünn die Restknochenhöhe 1/3 bis ein rundes Stück des Schädels (Knochen-Klappe) völlig frei von den umliegenden Schädel ist. Langsam und vorsichtig entfernen Sie die kreisförmigen Knochen-Klappe mit einem paar # 5/45 Zange zu und setzen Sie die Dura (Abbildung 2; Abbildung 3E). Halten Sie die exponierten Hirnregion feucht mit ACFS (Abbildung 3E). Vermeiden Sie Schäden an pial Schiffe, da Blutung Hirndurchblutung verändert, Gehirn Schwellung zu beschleunigen und Bildqualität stark beeinträchtigen. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der linken (kontralateralen) Seite des Schädels. Benutzen Sie für die Montage der optischen Fenster optische Kleber Kleber und Heilung zwischen Deckglas Schichten zu einem Zeitpunkt. Bei Bedarf erwärmen Sie das optische Fenster (50 ° C für 12 h) in einem Inkubator, die Verklebung zu verbessern. Das optische Fenster enthält 2 Portionen: der obere Teil enthält ein einzelnes Runde Abdeckung Glas mit einem Durchmesser von 5 mm und im unteren Teil 1 – 3 Runde Deckgläser mit einem Durchmesser von 3 mm (Abb. 2D). Das optische Fenster in Ethanol (70 %, Vol/Vol) speichern und mit steriler Kochsalzlösung vor Gebrauch abspülen. Überprüfen Sie vor dem optischen Fenster Einbau das optische Fenster für Mängel, einschließlich einen falschen Betrag des optischen Klebstoff oder ungenaue Ausrichtung unter einem Stereoskop. Installieren Sie das optische Fenster über der Kraniotomie Region (Abb. 2D). Der obere Teil des optischen Fensters ruht auf den Schädel und der unteren Teil des optischen Fensters innerhalb der craniotomized Öffnung passt und beruht auf der Dura im Beisein von CSF (Abbildung 2D, E). Dichtung im oberen Teil des optischen Fensterrand an den Schädel mit den Cyanacrylat Super Glue (Abbildung 2F; Abbildung 3F). Wenn der Cyanacrylat-Super-Kleber getrocknet ist, gelten Sie schwarze dental Zement (Dentsply) zur Deckung der Glaskante. Dental Zement auf der exponierten Schädel anwenden und Wunde Margen zu blockieren, Licht (Abbildung 2-H; Abb. 3 b). Führen Sie das gleiche Verfahren auf der linken Seite. Lassen Sie das Tier erholen auf das Heizkissen und das Tier zu seinem Hause Käfig für die Wiederherstellung unter angemessene Überwachung zurückkehren. Bieten Sie Nassfutter um kauen und Flüssigkeitszufuhr zu erleichtern. Um Schmerzen zu reduzieren, verwalten Buprenorphin s.c. (0,05-2,0 mg/kg) alle 8 – 12 h Postinjury für 2 Tage. Lassen Sie die Maus zu erholen um weitere 7 – 10 Tage vor der Bildgebung. 3. zwei-Photon imaging Am Tag des Experiments betäuben Sie das Tier mit Ketamin und Xylazin (Dosen und Aufrechterhaltung der Anästhesie wie oben beschrieben). Reinigen Sie die kraniale Fenster mit 75 % (Vol/Vol) Ethanol. Platzieren Sie den Mauszeiger unter einer bildgebenden Aufbau bestehend aus einem 2P-Mikroskop und den Kopf halten Adapter, ruht auf einem Heizkissen mit seinem Kopf bewegungsunfähig durch Ohr Bars auf einen Maus-Kopf-Halter befestigt. Bild einer Seite des optischen Fensters zu einem Zeitpunkt. Zur Minimierung von optischen Aberrationen stellen Sie sicher, dass das optische Fenster und rechten Schädel orientierten senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops. Nehmen Sie sich ein erstes Bild des kranialen Fensters mit Hellfeld-Beleuchtung bei 4 X Vergrößerung als eine Referenzkarte für Registrierung bei höherer Vergrößerung 2P Angiographien (Abbildung 4A1). Vergrößern Sie den gewünschten Bereich mit 10 X Vergrößerung (Abbildung 4A2). Wählen Sie ein Interessengebiet im Bereich S1 in kortikalen Schichten I oder II (bis zu 150 µm unterhalb der pial Oberfläche). Wenn höherer Vergrößerung gewünscht wird, verwenden Sie ein 20 X Objektiv. Suchen Sie ein Sichtfeld mit mehreren Neuronen. Abrufen von Bildern mit einem 2P-Mikroskop (Abb. 4 b). Bestimmen der Belichtungszeit und Anregung Licht-Ebene (≈910 nm) abhängig von der Tiefe und Ausdruck GCaMP6s, mit schwächeren Signalen erfordern längere Belichtungszeiten und übereinstimmend weniger zeitliche Auflösung. Wir verwenden in der Regel ~ 4 µs pro Pixel Belichtungszeiten. Abrufen von Bildern mit Bildraten von 3 – 5 Hz bei einer Auflösung von 512 × 512 Pixel. Die Zeitreihe Aufnahme starten. Speichern Sie Koordinaten für alle Regionen von Interesse (ROI) bezogen auf das vaskuläre Muster oder so Punkte in geringer Vergrößerung Bilder. Bild der gleichen ROI im Laufe der Zeit. Führen Sie das gleiche Verfahren, um Kalzium Dynamik von der S1-Bereich auf der linken Hemisphäre beobachten. Berechnen Sie Änderungen in Fluoreszenz von jedem ROI. Bilder zu erwerben, entweder einzeln oder als Zeitraffer-Film (Abbildung 41-C3, D, E). Studie kortikalen blood Flow Dynamics in Vivo durch bildgebende Dextran fluoreszierende Farbstoffe injiziert in die Rute Vene von Nagetieren mit 2P-Mikroskopie. Verwenden Sie Vasculatures als Wahrzeichen zu erkennen und Bild den gleichen ROI Imaging-Sitzungen über einen längeren Zeitraum. 4. Datenverarbeitung Verwenden Sie ImageJ und Herkunft für die Bildanalyse. Importieren von Bildsequenzen mit ImageJ (Abbildung 5A-B). Wählen Sie für einzelne Bilder (oder t-Serie Filme) einen ROI innerhalb einer abgebildeten Neurons und 2 separaten nahe gelegenen Regionen für Hintergrundmessung (Abbildung 5). Erwerben Sie die Gesamtintensität mit einem ROI-Manager (Abbildung 5C).Hinweis: Bild 6 zeigt repräsentative Kalzium Bilder. Kalzium Transient (grün) und Blutgefäße (rot) zeigen zu verschiedenen Zeitpunkten in Sekunden (Abbildung 6A-D) in einer Maus auf 7D nach dem ersten Fenster Einbau. Die Z-Projektion ein 3 min Aufzeichnungszeit für roten und grünen Kanal (Abb. 6E) oder Grün-Kanal (Abb. 6F) wird ebenfalls angezeigt. Eine Z-Projektion zeigt ein komprimiertes Abbild aller Bilder in dem Film aus dem Rough und Kreis Grenze (umfasst das Objekt Neuron von Interesse in allen Frames) sowie die Auswahl der unabhängigen in der Nähe Hintergrund Regionen ( 2 manuell ausgewählt ist Abbildung 6). Von jedem ROI, berechnen die durchschnittliche Fluoreszenz Hintergrund FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 und die Fluoreszenz-Änderungen von Soma (F) ausgedrückt als ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB. Führen Sie die Spitze Analyse Schritt für Schritt mit Funktionen von ImageJ einschließlich Basislinienkorrektur, Peak Finding/Bestimmung, Peak-Integration, Anpassung Peak und/oder Time-Saving-Peak-Analyse-Funktionen.