הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s
Summary
אנו מתארים תהליך ניסוי למדידת פעילות. עצבית מבעד לחלונות אופטי כפול מעל הדו-צדדיים העיקרי המגע corticies (S1) ב- Thy1-GCaMP6s העכברים הטרנסגניים באמצעות 2-פוטון (2p) מיקרוסקופיה ויוו.
Abstract
המוח בתרבית של תערוכות סימטריה מסומן על פני המישור sagittal. עם זאת, תיאור מפורט של דינמיקה עצבית באזורים במוח סימטרית אצל בעלי חיים יונקים בוגרים נשאר חמקמק. במחקר זה, אנו מתארים תהליך ניסוי למדידת dynamics סידן דרך חלונות אופטי כפול מעל הדו-צדדיים העיקרי המגע corticies (S1) ב- Thy1-GCaMP6s העכברים הטרנסגניים באמצעות מיקרוסקופ (2p) 2-פוטון. שיטה זו מאפשרת הקלטות וכן quantifications של פעילות עצבית באזורים במוח העכבר הדו-צדדיים אחד בכל פעם אותו ניסוי עבור יישום ממושך תקופה ויוו. היבטים מרכזיים של שיטה זו, אשר יכולה להסתיים תוך שעה, כוללים ניתוחים בפולשנות ליצירת windows אופטי כפול, ושימוש של הדמיה 2, P. למרות שאנחנו רק להדגים את הטכניקה באזור S1, ניתן להחיל את שיטת לאזורים אחרים של המוח החי הקלת הבהרה של המורכבות מבני ופונקציונאלי של רשתות עצביות במוח.
Introduction
סידן ורגולציה שלה חיוניים תיווכה מספר תהליכים פיזיולוגיים. פיקוח על דינמיקה סידן הוא שימושי להבנת תפקוד המוח נורמלי, כמו גם מצבים פתולוגיים של המוח הפרעות 1,2,3,4,5,6 7, ,8. הדמיה זריחה GCaMP6s הוא כלי רב עוצמה עבור לכימות מספרי ספייק, תזמון, תדירות, כמו גם רמות של סינפטית קלט גם במבחנה וגם ויוו 9,10,11.
המוח בתרבית של תערוכות סימטריה מסומן על פני המישור sagittal. למרות מחקרים נוירולוגיים יש לשפוך אור על שיפוץ קורטיקלית פעילות. עצבית המופעלות על-ידי טראומטי במוח או בחוט השדרה פציעה 6,7, התפקידים תפולס שלם של באופן סימטרי אזורים המתאימים לשחק השחזור הם עדיין מעורפל.
במחקר זה, אנו מתארים ניסיוני ההליכים ליצירת דו צדדיים חלונות סימטריים אופטי לדימות ויוו . באמצעות windows אופטי אלה, אנו מתארים מדידת דינמיקה סידן מן הראשית המגע cortices (S1) ב- GCaMP6s העכברים הטרנסגניים באמצעות מיקרוסקופ 2, P. במקטע ‘ תוצאות ‘, אנו גם מראים ויוו מורפולוגיה דנדריטים בנקודות זמן שונות באזור S1 העכברים הטרנסגניים EGFP באמצעות הדמיה 2, P. שיטת התבוננות לגבי הדינמיקה רשת באזורים S1 הדו-צדדיים אינה אלא דוגמא ראשונית של כפול כמה חלונות פתוחים הגולגולת יעזרו מדעני מוח כדי לחקור ומידע מקומי סימטרי, עיבוד במוח של יונקים בוגרים רגילה תנאים או מחלה שונים מודלים בתוך vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
שני הפוטונים הדמיה מאפשר המדד בו זמנית של הפעילות של תאים רבים ברזולוציה סביר-עד כ 800 מיקרומטר מתחת לפני השטח המוח. אנו משולב 2P וטכניקה חלון אופטי כפול עם GCaMP6s גנטית מקודד להתבונן סידן הדינמיקה של אוכלוסיות של שכבה V somata עצביים ממוקם > 500 מיקרומטר מתחת פיה. עם חלון פתוח אופטי בכל צד של הגולגולת, השיטה מאפשרת הקלטות של פעילות עצבית על פני אזורים במוח יונקים סימטרי עבור סידן ממושך ויציב הדמיה vivo בתוך. היבטים מרכזיים של שיטה זו כוללים את הביצועים של כירורגיה זעיר פולשנית כדי ליצור חלונות אופטי כפול הגולגולת פתוחה P 2 הדמיה של פעילות. עצבית באזורים S1 סימטרית.
בחינת הפעילות ברשת באזורים S1 הדו-צדדיים הוא שדוגמה של windows הגולגולת כפול איך יכול לשמש כדי לחקור ומידע מקומי סימטרי, עיבוד המוח למבוגרים vivo בתוך. שיטה זו גם יכול לשמש כדי לחקור את פעילות. עצבית (למשל שימוש בעכברים GCaMP6s Thy1 –) ואת הפלסטיות קורטיקלית B6. Cg-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J מרקמות שלם של האזורים סימטרי המתאימים בהתאוששות לאחר deafferentation עקב פציעה CNS חד צדדית. השיטה יכולה לשמש גם כדי לבחון פעילות קורטיקלית בתגובה לגירוי היקפיים אסטרטגיות כגון optogenetic, stimulations כימי או חשמלי. למרות שאנחנו רק להדגים את הטכניקה באזור S1, גישה זו יכולה להיות מועסק לחקור פעילויות בתחומים אחרים סימטרי במוח החי כגון הנוירונים שכבה V של קליפת מנוע ראשי (M1). תצפיות על ארגון מחדש של אזורים במוח עשויים לספק מצע עצבית להתנהגות המוטורית אדפטיבית, אשר ממלא תפקיד קריטי בשיקום postinjury של פונקציה. היא גם מאפשרת מדידה כרונית של פעילות סימטרית של תאים גנטית מזוהה במהלך התנהגות בעכברים הראש-קבוע.
טכנית, חוקרים כדאי לשים לב זהירה איכות ועקביות של windows הגולגולת כפול. חלון הגולגולת מדולל-הגולגולת טכניקה 12 מומלץ מאוד למתחילים להתאמן. קוצים הם תאים סידן בגלל מנגנוני זרימה, שחול המקומי ומורפולוגיה שלהם. במחקר זה, השתמשנו B6. Cg-Tg (Thy1– YFP) עכברים HJrs/J כדוגמה להפגין דנדריטים בעמוד השדרה dynamics ויוו (איור 4). התקנת חלון זכוכית פתוח-הגולגולת עלולה לגרום תחלופה גבוהה עמוד השדרה ותגובות גליה תגובתי אחרי ניתוח 12. לעומת זאת, עם טכניקה מדולל-הגולגולת חלון, קוצים, דנדריטים יכולים טוב להישמר.
הבחירות של מידות עוביים של windows אופטי יהיו תלויים בתחום התצוגה הרצוי, את העקמומיות הגולגולת, עובי הגולגולת, הסוג של הדמיה 13. לחץ לא מספיק coverglasses אופטי על השכבה הקשה של המוח עלול לגרום עיבוי של דורה, לצמיחה מחודשת של הגולגולת, והגדילה את המוח תנועה. לעומת זאת, לחץ מופרז של coverglasses אופטי עשוי לעכב זרימת דם בקליפת המוח.
להרכבה חלון אופטי, דבק ולרפא שכבות נוספות של coverglasses אחד בכל פעם עם דבק אופטי, אור UV ארוך באורך הגל. עזרה לחיזוק לקשר דבק, לחמם את החלון המפוברקת (50 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות) בתוך אינקובטור. לאחסן את coverglass חלון אופטי ב- 70% (vol/כרך) אתנול, לפני הניתוח, לשטוף אותו עם סליין סטרילי. החלון אופטי צריך להיבדק על פגמים (כגון סכום שגוי של יישור דבק או לא מדויקים אופטי) תחת סטריאוסקופ לפני השימוש כדי למנוע כשל. אם הדבק אופטי דק מדי, מקומות האוויר עשוי להיות מקומט, אשר יכול לגרום שיבושים אופטי או כיסוי זכוכית בחבורה השרשה. לעומת זאת, דבק אופטי מדי יכול לגרום גלישה מעבר לקצוות של החלון הגולגולת.
לסיכום, כאן אנו מתארים תהליך ניסוי למדידת dynamics סידן או הדנדריטים מורפולוגיה מבעד לחלונות הגולגולת 2 סימטרי העיקרי המגע קורטיקלית אזורים ב- Thy1-GCaMP6s ו- Thy1– YFP העכברים הטרנסגניים, בהתאמה, באמצעות מיקרוסקופ 2, P. טכניקה זו עשויה להקל מאוד לנתח את היחסים המורכבים מבניים ופונקציונליים של רשתות עצביות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מאוד גן Wenbiao (המכון ע ש סקירבל, במחלקה לפיזיולוגיה, מדעי המוח, ניו יורק אוניברסיטת בית הספר לרפואה, ארצות הברית) עבור הדרכה טכנית מצוינת, פאטי Raley, עורך רפואי (המחלקה לכירורגיה נוירולוגיות, אינדיאנה אוניברסיטת בית הספר לרפואה), לצורך עריכת כתב היד. אנו מודים ד ר צ’ן Jinhui (מכון מחקר מדעי המח סטארק, לרפואה אוניברסיטת אינדיאנה, ארה ב) למתן B6. עכברים HJrs/J cg-Tg (Thy1– YFP). עבודה זו נתמך בחלקה על ידי היסוד של מנהל בית החולים הכללי של ג’ינאן צבאי באזור של Chines PLA 2016ZD03 (XJL), ו- NIH NS059622, NS073636, משרד ההגנה CDMRP W81XWH-12-1-0562, BX002356 I01 של פרס סקירה ההצטיינות מן המחלקה המנוסות של ארה ב . ענייני, קרייג H Neilsen קרן 296749, חוט השדרה אינדיאנה, קרן מחקר של פגיעה במוח, מרי Hulman ג’ורג הקרן כספים (XMX)
Materials
| C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
| B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
| Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
| Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
| Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
| Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
| Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
| Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
| Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
| Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | – | – | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. Functional specialization of mouse higher visual cortical areas. Neuron. 72 (6), 1025-1039 (2011).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475 (7357), 501-505 (2011).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat Neurosci. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Katona, G., et al. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Zhang, K., et al. Remodeling the Dendritic Spines in the Hindlimb Representation of the Sensory Cortex after Spinal Cord Hemisection in Mice. PLoS One. 10 (7), e0132077 (2015).
- Keck, T., et al. Synaptic scaling and homeostatic plasticity in the mouse visual cortex in vivo. Neuron. 80 (2), 327-334 (2013).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular resolution functional imaging in behaving rats using voluntary head restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Luongo, F. J., Horn, M. E., Sohal, V. S. Putative Microcircuit-Level Substrates for Attention Are Disrupted in Mouse Models of Autism. Biol Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
- Wachowiak, M., et al. Optical dissection of odor information processing in vivo using GCaMPs expressed in specified cell types of the olfactory bulb. J Neurosci. 33 (12), 5285-5300 (2013).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
