Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

すべての手術と動物の取り扱い手順を行ったガイドの下世話と実験動物の使用 (国立研究評議会)、インディアナ大学学校の医学機関動物ケアと使用のガイドラインを承認しました。委員会。2 光子イメージング セットアップの模式図を図 1に示します。 1. イメージングのため動物の準備 オートクレーブ手術器、綿棒、滅菌ガーゼを手術エリア (表 1) に配置します。手術器具の滅菌を intersurgery 用マイクロ ビーズ殺菌装置を入れます。 ケタミン (17.2 mg/mL)、キシラジン (0.475 mg/mL) とアセプロマジン (0.238 mg/mL) (6 μ L/g 体重) の混合物 (i. p.) 腹腔内投与によるマウス (男性または女性、1.5-2.5 ヶ月、20-25 g) を麻酔します。動物つま先ピンチ刺激に応答しないし、角膜反射がない適切な麻酔深度に達するまで待機します。外科の間にブースター用量を与える元の麻酔状態を維持するために必要な麻酔薬としてカクテルの量 1/3 の。 ブプレノルフィンを皮下注入 (サウスカロライナ; 0.05-0.10 mg/kg) 術前鎮痛剤として。角膜の乾燥と白内障の形成を防ぐためには、動物の目に保護軟膏を適用されます。 低体温症を防ぐため、滅菌手術用覆布でそれをカバーし加熱パッドの GCaMP6s トランスジェニック マウスを配置します。マウスの頭を保持しているアダプターと動物の頭を安定させます。 ダブル エッジかみそりの刃で頭皮のほとんどの頭部を剃る。外科領域で準備の滅菌アルコール パッド後ポビドン ヨード液に拭き取ります。 2. 慢性頭蓋ウィンドウ準備 頭蓋骨の片側 (右) にはさみのペアで頭皮 (2 mm × 3 mm) の長方形カットを作る。脇の露出領域を作成して綿棒で皮膚をプッシュ > 3 mm 直径 (図 3 a)。優しく鈍い顕微鏡視下刃 (メス刃 #10; と頭蓋骨を削って頭蓋骨に付着した結合組織を削除します。図 3)。 優しく円を描いて S1 領域のマーク (直径、センター調整 3 mm:-1.50 mm 前から、正中線から 2.5 mm)、歯科を使用して頭蓋骨にドリル (図 2 b)。 左頭蓋骨 (図 2 b) には、同じ手順を実行します。 歯科用セメントのアプリケーションの基盤を提供するために骨にシアノアクリ レート系スーパー接着剤の薄い層を適用されます。 解剖顕微鏡の下で高速ドリル (図 3 D) を使用して、S1 周辺頭蓋骨の円形溝を薄きます。目的は、その上に光学窓の配置のための滑らかなエッジを作成します。 繰り返し掘削を容易にし、熱を放散する間伐のプロセス中に定期的に頭蓋骨に人工髄液 (アプライド、部屋の温度) を適用します。摩擦誘起の過熱を避けるために断続的に掘削を実行します。家の真空ラインまたは真空ポンプと骨の残骸を吸う離れて。 後、骨の約 2/3 の深さに穴を開けて、ゆっくりと慎重に薄い残りの 1/3 骨スカル (骨フラップ) の円形の部分が周囲の頭蓋骨から完全に解放されるまで。 ゆっくりと慎重に # 5/45 鉗子のペアを持つ円形の骨弁を除去し、硬膜 (図 2; を公開図 3E)。 露出した脳の領域のアプライド (図 3E) と潤いを保ちます。出血は脳の血流を変更し、脳腫脹を加速し、画像の品質が著しく低下するので、軟膜血管への損傷を避けるため。 頭蓋骨の左側 (反対側) に同じ手順を実行します。 光学窓の組み立て、接着剤と一度に coverglass 層 1 の間治療に光学接着剤を使用します。必要に応じて、接着接合を強化するインキュベーターで光学ウィンドウ (12 h の 50 ° C) を温めます。光学窓には 2 の部分が含まれます: 最上部に直径 5 mm の単一のラウンド カバー ガラスと下の部分には (図 2 D) 3 mm の直径の 1-3 ラウンド カバー ガラスが含まれています。 エタノール (70%、巻/巻) に光学窓を格納し、使用前に滅菌生理食塩水ですすいでください。光学窓のインストールの前に欠陥、堅実で光学接着または不正確な配置の不適切な量を含む光学窓を確認します。 開領域 (図 2 D) に光学窓を取り付けます。光学窓の上の部分にかかっている頭蓋骨化と craniotomized の開口部に収まる光学窓の下の部分 (図 2 D, E) は脳脊髄液の存在下で硬膜にかかっています。 (図 2 f; シアノアクリ レート系スーパー接着剤で頭蓋骨に光学ウィンドウの端の上の部分をシールします。図 3 f)。 シアノアクリ レート系スーパー接着剤が乾燥しているときは黒歯科用セメント (デンツプライ) ガラスのエッジをカバーするために適用されます。公開されているすべての頭蓋骨に歯科用セメントを適用し、(図 2-H; 光を遮断する余白を傷図 3 b)。 左側の同じ手順を実行します。 加熱パッドで回復し、適切な監視下での回復のためのホームのケージに動物を返すには、動物を許可します。咀嚼と水分補給を容易にするウェット フードを提供します。痛みを減らすためには、管理ブプレノルフィン サウスカロライナ (0.05-2.0 mg/kg) ごとの 8-12 h postinjury 2 日間。回復には、マウスを許可するイメージングの前にさらに 7-10 日間。 3. 2 光子イメージング 実験の日、ケタミン ・ キシラジン (用量および麻酔前述のメンテナンス) を持つ動物を麻酔します。エタノール 75% (巻/巻) と頭蓋のウィンドウをクリーニングします。 2 P 顕微鏡とマウス ヘッド ホルダー耳棒を固定化した頭で加熱パッドで休んで、頭を保持のアダプターから成るイメージング設定の下にマウスを配置します。 同時に光学窓の片側をイメージします。光学収差を最小限に抑える、光学窓と右の頭蓋骨が顕微鏡の光軸に対して垂直に方向であることを確認します。 高い倍率 2 P 血管造影 (図 4 a1) に登録の参考地図として 4 倍の倍率で明視野照明と頭蓋ウィンドウの初期画像を取る。 10 倍の倍率 (図 4 a2) を使用して興味の領域を拡大します。 S1 の領域で関心のある領域 (軟膜表面の下 150 μ m) まで I または II に、皮質の層で選択します。高倍率が必要な場合は、20 × 対物を使用します。 複数のニューロンとビューのフィールドを検索します。2 P 顕微鏡 (図 4 b) を使用してイメージを取得します。露出時間と深さに基づく励起光レベル (≈910 nm) と GCaMP6s のより長い露光時間を必要とする信号が弱いと的外れ以下の時間分解能での発現レベルを決定します。我々 は通常、ピクセル露光時間あたり ~ 4 μ 秒を使用します。512 × 512 ピクセルの解像度で 3-5 Hz のフレーム レートで画像を取得します。 時系列の記録を開始します。低倍率画像の利益 (率 ROI) 血管パターンを基準にして、基準点のすべての領域の座標を格納します。時間をかけて同じ ROI をイメージします。左の脳半球の S1 領域のカルシウム動態を観察する同じ手順を実行します。各 ROI から蛍光の変化を計算します。 個別に、またはコマ撮りムービー (図 41-C3 D、E) として、画像を取得します。 2 P 顕微鏡と齧歯動物の尾静脈に注射した蛍光デキストラン染料をイメージングによる皮質血流動態体内研究します。ランドマークとして認識し、長時間にわたってセッションをイメージングで同じ ROI をイメージする血管を使用します。 4. データ処理 ImageJ と起源を画像解析に使用します。ImageJ (図 5 aB) 画像をインポートします。個々 のイメージ (または t シリーズ映画) イメージのニューロンと 2 別の近くのバック グラウンド測定法 (図 5) の領域内にある投資収益率を選択します。ROI マネージャー (図 5C) と全磁力を取得します。注:図 6代表的なカルシウムの画像を示しています。カルシウム過渡 (緑) と血管 (赤) 表示異なる時点で (図 6A-D) 秒で 7 d でマウスでウィンドウの初期インストール後。赤と緑のチャンネル (図 6 e) または緑チャネル (図 6 階) 3 分録画期間の z 投影も表示されます。Z 投影からラフとサークルの境界 (すべてのフレームに関心のオブジェクト ニューロンを含む) を手動で選択してバック グラウンド地域 (近くに独立した 2 の選択だけでなく、映画のすべての画像の圧縮イメージが表示されます。図 6)。 各投資収益率から平均蛍光バック グラウンド FB、FB を計算 (FB1 + FB2) = 2 とソーマ (F) の蛍光変化で表される/ΔF/F、ΔF/F = (F FB)/FB。 一歩一歩 ImageJ 基線補正、ピーク検索/決定、ピークの統合、ピークのフィッティング、Time-Saving ピーク解析機能などの機能を使用してピーク解析を実行します。