Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

Todos os procedimentos de manipulação cirúrgica e animais foram realizados conforme aprovado sob o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório (National Research Council) e as diretrizes da Indiana University School de medicina institucional Cuidado Animal e uso Comitê. A ilustração esquemática da instalação da imagem latente do 2-fóton é mostrada na Figura 1. 1. preparar o Animal para a imagem latente Coloque gaze estéril, cotonetes e autoclavados instrumentos cirúrgicos na área de cirurgia (tabela 1). Liga um Micro grânulo esterilizador para intersurgery esterilização de instrumentos cirúrgicos. Anestesia o mouse (macho ou fêmea, 1,5 – 2,5 meses, 20-25 g) por injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (17,2 mg/mL), xilazina (0,475 mg/mL) e acepromazina (0,238) mg/mL (6 µ l/g de massa corporal). Espere até a profundidade apropriada de anestesia é alcançada quando o animal deixa de responder a um estímulo de pitada de dedo do pé e não tem nenhum reflexo corneal. Durante a cirurgia, dar uma dose de reforço de 1/3 da dose original do cocktail como anestésico necessária para manter o estado original de anestésico. Injetar buprenorfina por via subcutânea (s.c.; 0,05 – 0,10 mg/kg) como agente analgésico antes da cirurgia. Aplica a pomada protetora para os olhos do animal para evitar a formação da córnea de secagem e catarata. Coloque um rato transgênico GCaMP6s em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia e cubra com um pano cirúrgico estéril. Estabilize a cabeça do animal com um adaptador segurando de cabeça para os ratos. Raspe a cabeça sobre a maioria do couro cabeludo com uma lâmina de dois gumes. Limpe a área cirúrgica com uma almofada de preparação de álcool estéril seguida de solução de iodo-povidona. 2. crônica janela craniana preparação Fazer um corte retangular do couro cabeludo (2 mm x 3 mm) com um par de tesouras, de um lado (direita) do crânio. Empurre a pele à parte com um cotonete de algodão para criar uma área de exposição de > 3 mm de diâmetro (Figura 3A). Remova o tecido conjuntivo anexado ao crânio raspando suavemente o crânio com uma lâmina cega microcirúrgica (lâmina de bisturi n º 10; A Figura 3). Marque a área S1 suavemente desenhando um círculo (3 mm de diâmetro, centro de coordenação:-1,50 mm do bregma e 2,5 mm da linha média) no crânio usando um dental da broca (Figura 2B). Execute o mesmo procedimento no crânio à esquerda (Figura 2B). Aplique uma camada fina de cola de cianoacrilato Super ao osso para fornecer uma base para aplicação de cimento dental. Sob um microscópio de dissecação, fina para baixo um sulco circular no crânio em torno da área S1 usando um microdrill de alta velocidade (Figura 3D). O objetivo é criar uma borda suave para a colocação de uma janela óptica para ele. Aplica repetidamente artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF, temperatura) no crânio periodicamente durante o processo de desbaste para facilitar a perfuração e dissipar o calor. Realize a perfuração intermitentemente para evitar o atrito induzido por superaquecimento. Sugam os restos de osso com uma linha de vácuo de casa ou uma bomba de vácuo. Após cerca de 2/3 de profundidade do osso é perfurada, lentamente e com cuidado fina do osso remanescente de 1/3 até um pedaço circular do crânio (retalho ósseo) é completamente grátis do crânio do circundante. Lentamente e com cuidado retire a aba óssea circular com um par de pinças de # 5/45 e expor a dura-máter (Figura 2; Figura 3E). A região do cérebro exposto manter húmida com ACSF (Figura 3E). Evite quaisquer danos aos navios pial, desde que a hemorragia irá alterar o fluxo sanguíneo cerebral, acelerar o cérebro inchaço e severamente degradar a qualidade de imagem. Execute o mesmo procedimento do lado esquerdo (contralateral) do crânio. Para montar a janela óptica, uso ótico adesivo para colagem e cura entre lamela camadas uma de cada vez. Se necessário, aqueça a janela óptica (50 ° C por 12h) na incubadora para realçar a ligação adesiva. A janela óptica contém 2 partes: a parte superior contém um único vidro tampa redondo com um diâmetro de 5 mm e a parte inferior contém 1 – 3 copos de tampa redondos com um diâmetro de 3 mm (Figura 2D). Armazenar a janela óptica no álcool etílico (70 %), vol/vol) e enxague com soro fisiológico estéril antes do uso. Antes da instalação da janela óptica, verifique a janela óptica para imperfeições, incluindo uma quantidade incorreta de alinhamento óptico do adesivo ou imprecisa sob um estereoscópio. Instale a janela óptica sobre a região de craniotomia (Figura 2D). A parte superior da janela óptica repousa sobre o crânio e a parte inferior da janela óptica se encaixa dentro da abertura craniotomized e repousa sobre a dura-máter na presença do CSF (Figura 2D, E). Selar a parte de cima da borda da janela óptica no crânio com a cola de cianoacrilato Super (Figura 2F; Figura 3F). Quando secou a Super cola de cianoacrilato, aplique o cimento dental preto (Dentsply) para cobrir a borda do vidro. Aplique o cimento dental todo o crânio exposto e ferida margens para bloquear a luz (Figura 2-H; Figura 3B). Execute o mesmo procedimento no lado esquerdo. Permitir que o animal se recuperar na rampa de aquecimento e devolver o animal para sua gaiola em casa para recuperação sob acompanhamento adequado. Fornece alimento molhado para facilitar a mastigação e hidratação. Para reduzir a dor, administrar buprenorfina s.c. (0,05 – 2,0 mg/kg) todas as postinjury de 8 – 12 h, durante 2 dias. Permitir que o mouse para recuperar por mais 7-10 dias antes de imagem. 3. dois fotões de imagem No dia do experimento, anestesia o animal com ketamina e xilazina (doses e manutenção da anestesia, como descrito acima). Limpe a janela craniana com etanol a 75% (vol/vol). Coloque o mouse sob uma configuração de imagem consistindo de um microscópio de 2P e o adaptador cabeça segurando, descansando sobre uma almofada de aquecimento com a cabeça imobilizada por meio de barras de ouvido ligadas a um suporte de cabeça de rato. Um lado da janela óptica da imagem de cada vez. Para minimizar as aberrações ópticas, certifique-se de que a janela óptica e crânio certo são orientada perpendicularmente ao eixo óptico do microscópio. Tire uma foto inicial da janela craniana com iluminação de campo claro na ampliação de 4x como um mapa de referência para o registo com angiografias de 2P maiores ampliação (Figura 4A1). Amplie a área de interesse, com ampliação de 10x (Figura 4A2). Selecione uma área de interesse na área de S1 em camadas corticais I ou II (até 150 µm na superfície pial). Se aumento for desejado, use um objectivo X 20. Busca de um campo de visão com vários neurônios. Adquira imagens usando um microscópio de 2P (Figura 4B). Determine o tempo de exposição e nível de luz de excitação (≈910 nm) com base em profundidade e nível de expressão de GCaMP6s, com sinais mais fracos que exigem tempos de exposição mais longos e mesmo menos tempo resolução. Normalmente usamos ~ 4 µs por tempos de exposição de pixel. Adquira imagens em taxas de quadro de 3 a 5 Hz em uma resolução de 512 × 512 pixels. Começa a gravar a série temporal. Armazenar as coordenadas de todas as regiões de interesse (ROI) em relação ao padrão vascular ou para pontos fiduciais em baixa ampliação de imagens. Imagem do ROI mesmo ao longo do tempo. Execute o mesmo procedimento para observar a dinâmica de cálcio da área S1 no hemisfério esquerdo. Calcule as alterações na fluorescência de cada ROI. Adquirir imagens individualmente ou como um filme lapso de tempo (Figura 41-C3, D, E). Estudo cortical sangue fluxo dinâmica na vivo por imagem corantes fluorescentes dextrano injetados na veia da cauda de roedores com microscopia 2P. Use vasculatures como Marcos a reconhecer e o mesmo ROI em sessões de imagem durante longos períodos de imagem. 4. processamento de dados Use o ImageJ e origem para a análise de imagem. Importação de sequências de imagem com ImageJ (Figura 5A-B). Para imagens individuais (ou t-series filmes), selecione um ROI dentro de um neurônio imagem e 2 separado nas proximidades de regiões para medição de fundo (Figura 5). Adquira a intensidade total com um gerente de ROI (Figura 5-C).Nota: A Figura 6 mostra imagens representativas de cálcio. Transiente de cálcio (verde) e dos vasos sanguíneos (vermelho) mostram em pontos diferentes de tempo em segundos (figura 6A-D) em um rato no 7D após a instalação inicial da janela. O z-projeção de um período de 3 min de gravação para os canais vermelhos e verdes (Figura 6E) ou canal verde (Figura 6F) também é mostrado. Uma z-projeção exibe uma imagem compactada de todas as imagens do filme do qual um limite bruto e círculo (englobando o neurônio de objeto de interesse em todos os quadros) é selecionado manualmente assim como a seleção do independente nas proximidades de regiões de fundo ( 2 Figura 6). De cada ROI, calcular o fundo média fluorescência FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 e as mudanças de fluorescência da soma (F) expressaram em ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB. Realizar a análise de pico, passo a passo usando funções do ImageJ, incluindo correção de linha de base, pico constatação/determinação, integração de pico, pico montagem e/ou recursos de análise de pico de Time-Saving.