Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Johannes Hemmerich; Lars Freier; Wolfgang Wiechert; Eric von Lieres; Marco Oldiges

doi:10.3791/56234

JoVE Journal > Bioengineering

Bioengineering

Protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de Microbioreactor

Published: December 15, 2017

doi:

10.3791/56234

Johannes Hemmerich*^1,2, Lars Freier*^1,2, Wolfgang Wiechert^1,2,3, Eric von Lieres^1,2, Marco Oldiges^1,2,4

¹IBG-1: Biotechnology,Forschungszentrum Jülich, ²Research Center Jülich,Bioeconomy Science Center (BioSC), ³Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB),RWTH Aachen University, ⁴Institute for Biotechnology,RWTH Aachen University

Summary

Este manuscrito descreve uma abordagem genérica de design à medida dos meios de cultivo microbiano. Isso é ativado por um fluxo de trabalho iterativo combinando Kriging experimental design e microbioreactor tecnologia para throughput de cultivo suficientes, que é apoiado pela robótica de laboratório para aumentar a confiabilidade e a velocidade em mídia de manuseio de líquidos preparação.

Abstract

Um negócio em biotecnologia industrial usando fábricas de célula de produção microbiana é o processo iterativo de tensão de engenharia e otimização das condições de Bioprocessos. Um aspecto importante é a melhoria do meio de cultivo para fornecer um ambiente ideal para formação microbiana do produto de interesse. É bem aceite que a composição de mídia dramaticamente pode influenciar o desempenho geral de Bioprocessos. Otimização de média nutrição é conhecida por melhorar a proteína recombinante produção com sistemas microbianos e, portanto, este é um gratificante passo no desenvolvimento de Bioprocessos. No entanto, receitas de mídia padrão muitas vezes são tomadas a partir de literatura, desde o design à medida do meio de cultivo é uma tarefa tediosa que exige tecnologia microbioreactor para a taxa de transferência de cultivo suficientes, análise de produto rápido, bem como suporte por robótica de laboratório para permitir confiabilidade nas etapas de manuseio de líquidos. Além disso, métodos matemáticos avançados são necessários para racionalmente analisando dados de medição e projetar eficientemente experiências paralelas tais como conseguir conteúdo de informação ideal.

A natureza genérica do protocolo apresentado permite fácil adaptação ao equipamento de laboratório diferentes, outros hosts de expressão e proteínas alvo de interesse, bem como parâmetros de Bioprocessos ainda mais. Além disso, outros objetivos de otimização como taxa de produção de proteína, rendimento específico ou qualidade do produto podem ser escolhidos para caber o escopo de outros estudos de otimização. O Toolbox de Kriging aplicada (KriKit) é uma ferramenta geral para Design de experimentos (DOE) que contribui para a optimização de Bioprocessos holística melhorada. Ele também suporta otimização multi-objetiva que pode ser importante na otimização de processos de upstream e downstream.

Introduction

Tecnologia moderna genética recombinante permite a ampla utilização de enzimas técnicas para diversas aplicações na indústria farmacêutica, animal, alimentação, química orgânica e¹^,²^,³de processamento de alimentos. A produção de enzimas técnicas em grandes quantidades é um tópico importante para a biotecnologia industrial e para a produção de proteínas recombinantes otimizado e ambos Coe e engenharia de Bioprocessos é necessária. Para a geração de cepas de produção eficientemente projetado, bibliotecas genéticas diferentes estão disponíveis, por exemplo, para a expressão de gene equilibrada⁴ ou aumento da secreção de eficiência⁵.

Corynebacterium glutamicum é um importante produtor de aminoácidos em escala industrial⁶^,⁷ e representa um host atraente expressão não-convencionais para a produção de secreção de proteínas recombinantes⁸ ^,⁹. O general secretora (Sec) e via de translocação gêmeo-arginina (Tat) estão presentes em c. glutamicum e foram aplicadas com êxito para a secreção de proteína recombinante¹⁰. Vasta experiência em engenharia de Bioprocessos em matéria de produção de aminoácidos em escala industrial, bem como a capacidade de secretar proteínas g/L de montantes¹¹ e grande robustez relativa heterogeneidades de Bioprocessos, encontradas em larga escala cultivos¹²^,¹³, faça glutamicum c. um organismo plataforma promissora para a produção de secreção de proteínas heterólogos em escala industrial.

Otimização de média nutrição é conhecida para melhorar a produção de proteína recombinante com sistemas microbianos¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ e consequentemente, o ajustamento de médio composição é um passo gratificante em Bioprocessos desenvolvimento no que diz respeito a produtividade ideal¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. Intensas pesquisas sobre a aplicação de placas de microtitulação (MTPs) para cultivo microbiano²²^,²³^,²⁴ pavimentaram o caminho para o desenvolvimento e design de MTPs para cultivo microbiano²⁵ ^,²⁶ e o desenvolvimento de sistemas baseados em MTP microbioreactor (MBR) com monitoramento on-line e ambiental controle²⁷^,²⁸. MBR permite um aumento significativo na produtividade do cultivo experimental. Além disso, sistemas MBR decorrentes de outros tipos de biorreatores, por exemplo, colunas de bolhas ou mexido tanque reatores, estão disponíveis para Bioprocessos microbiana otimização²⁹^,³⁰^,³¹^, ³².

Em geral, estudos de otimização beneficiam maior throughput experimental, que se torna ainda mais poderoso em combinação com metodologias DOE, como para avaliar as interações entre as variáveis de projeto ou reduzir os espaços de busca de alta dimensão. Consequentemente, o uso combinado de MBR sistemas, automação de laboratório e DOE provou para ser um método poderoso em biotecnologia⁸^,¹⁶^,³³^,³⁴^,³⁵.

Apresenta-se um protocolo para otimização de mídia combinando a automação de laboratório de estado-da-arte, tecnologia MBR com acompanhamento de processo on-line e análise/experimental design Kriging-base de dados. A metodologia de Kriging é implementada em um Toolbox MATLAB (“KriKit”), que pode ser baixado e usado livre de carga³⁶. Como exemplo de aplicação, maximização da produção de proteína (GFP) secretoras ﬂuorescent verde com c. glutamicum é mostrada através da otimização da composição do meio mínimo de CgXII. Título GFP foi escolhido como o objetivo de otimização, como isso pode ser quantificado facilmente e é aplicado extensamente como proteína de modelo para estudos sobre MBR sistemas³⁷^,³⁸^,³⁹.

O quadro apresentado é dividido em quatro etapas, que são ilustradas na Figura 1. As etapas são indicadas por quadros de caixa e correspondem às seções do protocolo. A primeira etapa (figura 1A) é definir os objetivos do projeto e para determinar os métodos necessários. A combinação de metodologias DOE, MBR tecnologia e automação de laboratório permite uma maior throughput experimental que exige poderosa de processamento de dados. A segunda etapa (figura 1B) visa detectar variáveis de projeto sensível (isto é, componentes médios) com alta influência sobre o objetivo de otimização. Isto leva a um número reduzido de variáveis de projeto de interesse. A terceira etapa (Figura 1) é composto por uma otimização iterativa para uma investigação mais detalhada da relação funcional entre as restantes variáveis de projeto e o objetivo de interesse. Usando o conjunto de dados sucessivamente estendido, a abordagem de Kriging é aplicada para prever o resultado experimental em locais não mensuráveis. O ciclo iterativo é interrompida assim que o modelo de Kriging prevê um ideal ou um planalto com uma precisão suficiente. Os resultados são verificados na quarta etapa (Figura 1), começando com uma nova análise de sensibilidade em torno do optimum identificado. Se inicialmente, diferenciação de componentes são encontrados para ser insensível também na região ideal, é razoável supor que isto prende verdadeiro durante o procedimento iterativo de otimização na terceira etapa. Depois disso, é aconselhável verificar resultados de otimização da aplicação dos métodos ortogonais, como um ensaio de atividade ou SDS-Page.

A natureza genérica do protocolo apresentado permite fácil adaptação ao equipamento de laboratório diferentes, outros hosts de expressão e proteínas alvo de escolha, bem como mais Bioprocessos variáveis como a temperatura de pH valor ou cultivo.Além disso, outros objetivos de otimização como taxa de produção de proteína, rendimento específico ou qualidade do produto podem ser escolhidos para caber o escopo de outros estudos de otimização.

Figura 1 : Fluxo de trabalho de estudo de otimização. As caixas de quatro quadros correspondem às seções do protocolo, “Conceber o estudo e definição de métodos” (secção 1), “Análise de sensibilidade” (secção 2), “Optimization iterativo” (secção 3) e “Validação” (secção 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. conceber o estudo e a definição dos métodos (Figura 1: parte A) Nota: Definição do objectivo da otimização: É um tempo de curso de formação de produto necessário ou é apenas um intervalo de tempo limitado ou até mesmo um ponto fixo de tempo relevante? Além disso, considere potenciais questões como estabilidade, esforço de quantificação analítica, ou tempo de cultivo. Como uma alternativa para o título final da proteína, outros objectivos podem ser considerados como tempo de biomassa ou cultivo. Biomassa é refletida pelo rendimento do produto específico de biomassa, enquanto o tempo de cultivo é refletido pelo espaço-tempo-rendimento. Qualidade do produto (mínimo) também poderia ser um objectivo. Otimização multi-objetiva pode ser necessária em determinadas situações, como discutido em outro lugar40. Neste estudo, sendo o título de GFP após 17 h de cultivo foi escolhido como o objetivo de otimização. Fluorescência de GFP pode ser acompanhada on-line utilizando o equipamento disponível neste estudo, o que simplifica muito a determinação da concentração da proteína do modelo.Nota: Definição dos parâmetros a ser otimizada: CgXII médio consiste de 16 componentes individuais41 e investigar tudo isso em um fatorial completo resultaria em 216 ≈ 65.000 as experiências. Por conseguinte, o espaço de busca deve ser reduzido numa base racional e orientadas pela experiência. A seleção de componentes de mídia considerada para otimização pode ser suportada pelo conhecimento especializado disponível ou dados da literatura. Decida-se que a concentração média de componente não deve ser variada. Para a otimização do meio de CgXII, os seguintes componentes foram escolhidos para ser corrigido: Glicose é fixado em 10 g/L. Essa otimização é trivial, porque mais glicose produz mais GFP secretoras de biomassa. O objetivo foi revelar efeitos médios não-intuitivas. 3-(N-Morpholinos) ácido (MOPS) é fixado em 42 g/L. Isto fornece a capacidade de armazenamento em buffer suficiente durante o cultivo do lote e não é metabolizado.Nota: A adição de MOPS nessa concentração final garante um valor inicial de pH 7, mesmo com os volumes diferentes das outras soluções estoque adicionados, que não estão em pH 7. No entanto, para excluir qualquer desvio em começando a valores de pH, o pH deve ser verificado para composições médias, onde todas as soluções estoque são adicionadas em seus volumes máximos e mínimos. KH2PO4 e K2HPO4 são fixadas em 1 g/L. Estes fornecem a capacidade também armazenamento em buffer e servem como uma fonte de fosfato. Ureia é fixada em 5 g/L. Isto serve como uma fonte de nitrogênio basal e agente de estabilização de pH, suficiente para evitar a limitação de N. Biotina é fixada em 0,2 mg/L. c. glutamicum ATCC13032 é auxotróficos de biotina. Ácido protocatecuico (PCA) é fixado em 30 mg/L. Ele serve como um agente chelating de ferro. Isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) é fixado em 100 µM. Induz a expressão do gene da gfp . Selecione altas e baixas concentrações de componentes de mídia para as sessões iniciais de sensibilidade. Aqui, os componentes de três grupos típicos de componentes de mídia foram escolhidos. As concentrações de baixas e altas investigadas para cada componente são: Fonte de nitrogênio padrão: (NH4)2SO4 (8-32 g/L); a variação da fonte de nitrogênio foi relatada para ser promissor para otimização de biomassa específicos GFP sinal8. Oligoelementos: Filipa4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7 H2O (0.4-1.6 mg/L), CuSO4 ∙ 5 H2O (501-125 µ g/L), NiCl2 ∙ 6 H2O ( 8-32 µ g/L) e CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 µ g/L). A composição dos oligoelementos é herdada a partir da primeira publicação de CgXII médio41. Além disso, Na2MoO4 ∙ H2O (26-104 µ g/L) e H3BO3 (20-80 µ g/L) foram incluídos como elementos de traço, como eles são usados em uma variante publicada do CgXII médio42. Elementos de macro: MgSO4 ∙ 7 H2O (0,2 a 0,4 g/L), CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3-21,2 mg/L). Estas foram encontradas entre outros cátions divalentes para aumentar a produção de GFP secretora em outro estudo14, onde c. glutamicum estirpe R foi usado com um fundo de médias diferente e o peptídeo sinal CgR0949 Tat. Preparação de materiais e procedimentos de definiçãoNota: É aconselhável definir e fixar os métodos experimentais em um nível detalhado. Essa padronização garante que resultados diferentes podem ser rastreados até a variabilidade biológica intrínseca ou composições médias diferentes.Nota: Soluções de ações de mídia: Preparar soluções de ações individuais para todos investigados componentes de mídia. Prepare ações altamente concentradas para permitir a diluição de diferentes volumes para todos os componentes. Isto significa que, depois de combinar todas as soluções estoque no seu maior volume de acordo com o plano de projeto, isto não pode exceder o volume de cultivo final, cf. etapa de “Geração de lista de pipetagem de solução estoque médio” n. 1.3.3. Se a adição de uma solução altamente concentrada resulta em um volume muito baixo de adição, por exemplo, < noth 1/100 do volume final de cultivo, diluir a solução-mãe em conformidade. Por exemplo, neste estudo, um volume de pipetagem de menos de 10 µ l foi definido para ser inviável. Normalmente, soluções de oligoelemento concentram-se tão alto como 1,000fold com respeito à concentração padrão final no meio. É vantajoso dedicar-se componentes de mídia como múltiplos (X-dobra) com relação as concentrações da receita de referência. Ao fazê-lo, inviável volumes pipetagem de frações decimais são evitados. Receitas detalhadas para todas as soluções estoque de CgXII médio são dadas em documento complementar. Banco de células de trabalho (WCB)Nota: Para cada experimento de crescimento, é usado um WCB alíquota. Se forem necessários mais alíquotas, uso 100ml cérebro coração (BHI) de infusão médio em 1.000 mL perplexo agitar frascos ou inocular vários frascos de agitação, que são agrupados antes da adição da solução de glicerol. Prepare o única colônias da expressão recombinante estirpe glutamicum c. pCGPhoDBs- GFP43 em placas de ágar (pó BHI 37 g/L, ágar de 20 g/L, canamicina 25 mg/L). Chapeamento do material também pode vir de transformação fresca ou de uma alíquota criopreservada.Incubar a 30 ° C até o aparecimento de colônias único; Isto leva geralmente um ou dois dias. Inocular uma cultura de balão do agitador (50 mL de meio de BHI com canamicina 25 mg/L, perplexo balão de 500 mL, 250 rpm, tremendo de diâmetro de 25 mm, 30 ° C) com material de colônia e incubar durante a noite (aproximadamente 16 h). Combinar um volume de suspensão resultante da célula com um volume de solução de glicerol estéril de 500 g/L e distribuir em alíquotas de 2 mL em frascos estéreis de criopreservação. Loja a-80 ° C. Protocolo de cultivo de MBRNota: Para o sistema de BioLector MBR empregado no presente estudo, dispersa a luz (biomassa) e fluorescência de GFP são medições de intensidade, que precisam de um determinado valor de ganho atribuído. Quanto maior o ganho, maior o sinal óptico é amplificado; Isto é também por que a luz dispersa e fluorescência são medidos em unidades arbitrárias (u.a.). Determine os valores de ganho apropriado para biomassa e detecção de GFP em experimentos preliminares, juntamente com frequência a tremer apropriado e volume para evitar a limitação de oxigênio em altas concentrações de biomassa durante os estágios posteriores do processo de enchimento. As condições de cultivo empregados (“Flowerplates”, ou seja, em forma de flor 48-bem MTPs, sacudindo a frequência de 1.200 rpm, volume de 1.000 µ l, glicose 10 g/L como fonte de carbono principal de enchimento) garantiram oxigênio ilimitado de cultivos. Para taxas de transferência de oxigênio máxima resultantes de outras combinações de volumes de enchimento e agitando as frequências no MTPs de 48-poço em forma de flor, folhas de dados do fornecedor estão disponíveis. Além disso, defeitos de crescimento das culturas individuais podem ocorrer devido a baixas quantidades de substratos secundários (por exemplo, nitrogênio, oligoelementos). Portanto, verifique as concentrações de biomassa no final dos cultivos. Neste estudo, foram observados sem tais efeitos de crescimento. Defina o protocolo de cultivo para o sistema MBR (“BioLector”) como segue: Filterset 1: Biomassa, ganhar 14. Filterset 2: pH, o ganho é predefinido. Filterset 3: pO2, ganho é predefinido. 4: GFP, ganho 80. Frequência de agitação: 1.200 rpm. Temperatura: 30 ° C. Tempo de ciclo: 15 min. Tempo de experiência: manual (cultivo não será interrompido automaticamente). Geração de lista de pipetagem de solução estoque médioNota: Quase qualquer líquido sistema robô de manipulação é capaz de ler ações pipetagem de arquivos externos. Basicamente, a informação mínima necessária é o volume de transferência e a posição da fonte de reagente, assim como o destino de cada um representado por uma posição de labware sobre a plataforma robótica e uma cavidade específica dentro do material de laboratório. No entanto, devem ser considerados diferentes sintaxes para líquido de diferente sistemas de tratamento. A Figura 2 mostra uma estrutura de arquivo de exemplo para o sistema de pipetagem empregada neste estudo. Quatro tipos de Soluções conservadas em estoque são pipetados em cada cultivo bem: Soluções de componentes de mídia que são o estoque variado (“Variação existências”). Água para compensar diferentes volumes cumulativos de acima de estoques. Uma solução de reserva (“Resto de estoque”) que contém todos os componentes que são fixos. Esta solução pode ser composta de ações contendo os diferentes componentes que são, por exemplo, armazenada em diferentes temperaturas ou esterilizado por diferentes métodos. Inóculo, que deve ser adicionado como o último componente e coloque a mesa de trabalho antes de adição para evitar a sedimentação das células. Por cultivo, calcule os volumes para ser transferido para todos os componentes de mídia de acordo com: O volume a ser adicionado para determinadas Unidades populacionais de variação talvez zero, ou seja, quando este componente específico é omitido. Revise todos os volumes calculados Veu para números adequados. Pipetagem incrementos de volume nas etapas de volume não devem ser muito pequenos. Se necessário, ajuste as concentrações de Variação de existências. Por exemplo, o volume mínimo de pipetagem aqui foi definido como 10 µ l, e o incremento mínimo foi definido como 5 µ l. Em geral, estes volumes devem ser definidos com base em determinado experimentalmente precisão e exatidão para o líquido usado tratamento estação15,44. Calcule o volume de Estoque de resto que contém os componentes fixos para todos os poços da seguinte forma: onde o volume acumulado máximo da Variação populacional é usado. Consequentemente, calcule as concentrações exigidas dos componentes fixos no Resto de estoque como segue: Prepare o Resto Stock em conformidade. Por cultivo, calcule o volume de água a ser adicionado da seguinte maneira: Por cultivo bem, listar todos os volumes a serem adicionados na seguinte ordem de adição: VH2O, VRestStock, Veu, VInok. Formate a lista pipetagem de acordo com as especificações do líquido manipulação estação, como mostrado por exemplo na Figura 2. Cultura de sementes, preparação de meios automatizados e início da cultura principal Crie um protocolo para o robô de manipulação de líquidos. Ver Figura 3 e Figura 4 para um protocolo de exemplo para um sistema de “Janus”, implementado no software correspondente de “WinPREP”. O protocolo deve considerar os seguintes aspectos: Incluem uma duração suficiente de habitação estéril antes da preparação de meios de comunicação. Incluem uma inicial excessiva limpeza e lavagem de todas as dicas de pipetagem e tubulação. Escolha o equipamento laboratorial adequado recipientes para soluções conservadas em estoque. Aqui, placas de poço profundo com 12 colunas são adequadas para armazenamento de Variação de existências, como todas as oito dicas de pipetagem podem mergulhar em um arranjo paralelo nas colunas de bem. Isto grandemente acelera a preparação de meios de comunicação. Se os tubos de 15 mL ou 50 mL reagente são usados como reservatórios, apenas uma dica de pipetagem pode mergulhar ao mesmo tempo.Para outras ações como água e Resto de estoque, são utilizados bebedouros de 100 mL, como essas soluções estoque exigem maiores volumes no total. Fornecer um volume total suficiente para cada solução compensar volumes de resíduos, deslocamentos de pipetagem de altura, etc. Inserir um prompt do usuário antes que a etapa de inoculação, garantindo que esta etapa é realizada imediatamente antes do procedimento de cultura de sementes. Prepare todas as soluções estoque em uma loja e forma estéril até o uso, em recipientes apropriados, por exemplo, estéril 15 mL e provetas de 50 mL. Esterilize as placas de poço profundo para armazenamento de solução estoque em uma mesa de trabalho, por exemplo, limpando com 70% de etanol e posterior secagem em uma capa de fluxo laminar. Inicie a cultura de sementes por inocular 50 mL de meio de BHI contendo canamicina 25 mg/L, com uma alíquota do WCB. Antes do cultivo de MBR, prepare inóculo fresco, vital a partir de culturas de sementes em uma quantidade suficiente de crescimento exponencial. Coloque todos os materiais de laboratório necessários sobre o worktable robótico e despeje as soluções a labware correspondente. Inicie o fluxo de trabalho robótico para preparação de meios de comunicação, para que a última etapa (inoculação), é atingido no tempo com o início da cultura de sementes. O tempo de execução total de fluxo de trabalho robótico deve ser avaliado anteriormente. Aqui, o tempo de execução total foi cerca de 1,5 h. A cultura de sementes da amostra após aproximadamente 2 h, em seguida, cada hora, para monitorar o crescimento, a densidade óptica (OD600). Após cerca de 5 h, a cultura atinge 3-4 OD600 e é utilizada para inocular as principais culturas. Coloque a cultura de sementes sobre o worktable manipulador líquido e continuar o protocolo de preparação de mídia. Sele o cultivo MTP após a inoculação. Coloque o cultivo selado MTP no dispositivo BioLector e iniciar o protocolo de cultivo pré-definidos. Descarte as soluções estoque remanescentes, de acordo com as normas de biossegurança, se necessário e propagar a cultura do worktable robótico. Limpar o equipamento laboratorial re-utilizável e iniciar o protocolo de descontaminação de líquidos manipulador. Quantificação de produto e pré-processamento dos dados brutos para análise Pare a cultura principal após um tempo de execução 17 h. Transferi os dados de medição de dispositivo BioLector MBR para o computador conectado usando o pacote de software de BioLection de acordo com o manual de instruções do fabricante. Uso o “gerenciamento de dados → transformar dados” função do pacote de software “BioLection” que acompanha o sistema MBR para converter o arquivo de dados brutos em um formato de planilha de fácil acesso. Copie os dados de sinal de boas práticas agrícolas para todos os poços de cultivo da coluna timestamp mais próxima às 17 h. identificar o GFP sinais a partir dos poços de cultivo de referência e a média. Normalize todos os restantes sinal GFP pelo sinal de referência de média. Quantificar o título GFP usando métodos adicionais (se necessário) Transferir as suspensões celulares de todos os poços de cultivo em tubos de reação prelabeled e obter o célula livre sobrenadante após centrifugação durante 10 minutos na velocidade máxima, usando uma centrífuga de bancada. Transferir 200 µ l de cada célula livre sobrenadante para um preto MTP de 96 poços, com fundo transparente, e ler a fluorescência específica de GFP em 488/520 nm, utilizando um leitor de microplacas apropriado. Normalize o sinal GFP de todos os poços com sinal médio de cultivos de referência, como na etapa 1.5.3.Nota: Os sinais de fluorescência de GFP absolutos não podem ser comparados para dispositivos de medição diferentes. Portanto, as 5 cepas de referência de todos os principais cultivos servem como um padrão interno. A melhoria da concentração GFP pode ser expressa em relação ao padrão interno. Isto permite a comparação dos resultados de diferentes experiências e diferentes métodos de quantificação de GFP (ver duas próximas etapas). Determinação do teor de proteína dos sobrenadantes sem célula com protocolos padrão, por exemplo, ensaio de Bradford ou BCA. Em combinação com os resultados da etapa 2, a determinação de um título GFP proteína específica é possível.Nota: Após a medida de fluorescência, use a amostra directamente a partir deste microplaca. Uso de pipetas multicanais facilita muito o líquido necessário etapas de manipulação. Realizar uma visualização de SDS-Page de célula livre sobrenadantes seguir protocolos padrão para verificar que a maioria do conteúdo de proteína do aumento é devido ao aumento da secreção GFP.Nota: SDS-Page é mais trabalhoso do que os métodos mencionados anteriormente, especialmente com uma carga alta de amostra. Para fins de verificação, muitas vezes é suficiente executar que SDS-páginas de sobrenadantes sem célula de referência média e final otimizado de cultivos médio15. 2. sensibilidade análise (Figura 1: parte B). Nota: O objetivo desta parte é identificar os fatores importantes que têm um efeito significativo sobre o objetivo. Escolha um intervalo de concentração inicial dos componentes de mídia. A composição média de referência deve estar dentro das faixas de concentração escolhida. Escolha um apropriado DOE. Tais projetos podem ser encontrados na literatura, por exemplo, do NIST/SEMATECH e-manual de métodos estatísticos (disponível em www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). O desenho escolhido depende do número de componentes de mídia de interesse (aqui, 11) e o número de experimentos realizados (aqui, 32). No exemplo dado, o projeto “2IV11-6” foi escolhido que resulta em 32 experimentos e permite a estimativa do efeito de aumentar a concentração de um dos onze componentes no objectivo de interesse. Para ser mais específico, os principais efeitos não são confundidos com interações fator por pares. Eles podem ser confundidos com interações de ordem superiores que são, no entanto, muito provável não significativo. Use os restantes poços (aqui, 16) para a realização de várias repetições com o meio de referência para avaliar a reprodutibilidade do processo. Repetições devem ser igualmente espalhadas sobre a placa para descobrir efeitos posicionais. O valor médio da saída medido das experiências de referência é usado para normalização. Ou seja, cada saída medida da análise de sensibilidade é dividida pelo valor médio da saída de referência. Calcular o principal e se possível os efeitos combinatórios utilizando software de estatísticas adequadas. O design clássico do experimento é baseado em uma aproximação polinomial45. Por exemplo, o MATLAB função mvregress pode ser usado para o cálculo dos coeficientes polinomiais.A função mvregress é parte da caixa de ferramentas de aprendizagem de máquina e estatísticas. Identifica os efeitos relevantes de vários componentes de mídia sobre o objetivo usando um teste t. No exemplo, NH4+ tem um efeito negativo significativo, e Ca2 + e Mg2 + mostram os efeitos positivos mais fortes (Figura 5). Porque o sinal GFP foi normalizado, os coeficientes representam a variação média relativa no sinal de GFP ao aumentar a concentração do componente particular de seu valor de centro, , para seu valor máximo. Elementos fixos sem um efeito relevante são pelo seu valor de referência durante a otimização. 3. iterativa otimização (Figura 1: parte C) Nota: A ferramenta MATLAB Danilo foi usado para a interpretação e análise de dados estatísticos36. Danilo permite ao usuário construir um modelo de Kriging orientado a dados. Este modelo de Kriging prevê a relação funcional entre os componentes de mídia e o objetivo. Ele também fornece informações sobre a incerteza da previsão. Elevada incerteza indica dados ruidosos e/ou a densidade de dados insuficientes. CORÇANota: Novas experiências iterativamente destinam-se, com base nos resultados da execução anterior. Na primeira iteração, projete novas experiências para investigação detalhada dos componentes identificados meios de interesse. Resultados experimentais da seção 2 não podem ser transferidos para a otimização iterativa (seção 3), como as concentrações dos componentes sem efeito relevante são agora corrigidas para o valor de referência respectivos. Consequentemente, as experiências a partir da análise de sensibilidade e iterativa otimização não são comparáveis. Caso contrário, segui o esquema ilustrado na Figura 1, quadro “Optimização iterativa”. Se o potencial ideal está dentro do intervalo de concentração definidas, novas experiências são projetadas usando a melhoria esperada de40,46. O delineamento experimental baseado na melhoria esperada é integrado na caixa de ferramentas Danilo. Se o ideal fica na fronteira, expanda o intervalo de concentração. Realize experiências em pontos de amostra projetado de acordo com os métodos experimentais definidos na secção 2. Análise estatística Construa um modelo de Kriging utilizando dados combinados de todas as iterações, incluindo o atual. Investiga a modelo de saída pelo visualização usando as ferramentas abrangentes de Danilo (2/3D interpolação, filme análise, triagem, enredo, etc.). Se uma área ideal foi estimada com suficiente precisão, pare de otimização. Se não, continue com o passo 3.1.Nota: A Figura 6 ilustra a optimização iterativa para o estudo de teste. O intervalo de concentração foi sucessivamente ampliado até um platô foi encontrado (iteração 1-6). A sétima iteração foi usada para explorar os limites mais detalhadamente. 4. verificação dos resultados (Figura 1: parte D) Nota: Depois de terminar a otimização iterativa, os pressupostos iniciais precisam ser verificadas para validade. Refazer a análise de sensibilidade (secção 2) para a composição média ideal. Ou seja, as concentrações dos componentes que são investigados na Figura 1 (parte C) são fixos para seus valores ideais. Concentrações de outros componentes são variadas de acordo com um DOE apropriado.Nota: Resultados semelhantes em ambas as projecções indicam que os níveis de concentração dos componentes investigados não alteram o efeito dos outros componentes. Se o rastreio mostra diferenças significativas para os resultados da parte B, componentes com efeito alterado devem ser adicionados ao pool de componentes investigadas e parte C deve ser repetida. No caso de avaliação indirecta (por exemplo, a fluorescência como indicador para a concentração do produto), aplicação de abordagens de medição ortogonal (por exemplo, ensaio da atividade, Bradford ou quantificação de proteína BCA, SDS page) para confirmar a alteração no o objetivo de interesse, comparando os resultados do meio de referência e o médio otimizado15.

Representative Results

O protocolo introduzido foi aplicado para maximização do título do GFP secretado. Especificamente, o título GFP após 17 h de cultivo foi escolhido como o objetivo de otimização. Deteção de fluorescência on-line de GFP permitiu a quantificação simples produto. No entanto, a normalização do sinal GFP com dados de um cultivo de referência é indispensável para garantir a reprodutibilidade e a comparabilidade dos resultados. Uma pré-seleção de componentes de mídia foi realizada em uma base racional conforme descrito na seção 1. Foram realizados experimentos, seguindo as instruções da secção 1: os parâmetros dos procedimentos de laboratório molhado foram definidos para o estudo inteiro garantindo consistência e reprodutibilidade dos resultados. Conforme descrito na secção 2, realizou-se uma triagem inicial para identificar os componentes relevantes mostrando um impacto significativo sobre o objetivo de otimização para o estudo mais adicional, mais detalhado. O sistema MBR MTP-baseado permite 48 experimentos a ser executadas em paralelo. Tendo em conta o número máximo possível de experiências paralelas em um MTP (48) e o número total de mídia componentes (11) faz o 2IV11-6 fracionário desenha uma escolha apropriada. Este projeto experimental compreende 32 experimentos e permite a estimativa do efeito principal para cada um dos componentes de mídia investigadas. Os restantes poços de cultivo (16) foram usados para múltiplas repetições de experiências com o meio de referência para avaliar a reprodutibilidade e efeitos posicionais. Ou seja, cada experimento é executado uma vez (sem repetições), exceto o experimento de referência (cinco repetições). A tabela 1 resume os resultados da análise de rastreio. Na faixa de concentração considerada, variando a maioria dos componentes de mídia não mostrou um efeito perceptível sobre o objetivo. Componente de NH4+ mostra um forte efeito negativo, enquanto Ca2 + e Mg2 + mostram a tendência positiva mais forte. O efeito de Mg2 + não é significativo para o intervalo de concentração atual, mas pode ser para uma gama mais ampla de concentração. Consequentemente, decidiu-se omitir o NH4+ do meio e investigar o efeito de Ca2 + e Mg2 + em novas experiências. Seção 3 descreve o procedimento iterativo de otimização que é usado para maximizar o sinal de fluorescência do GFP enquanto variando as concentrações de Ca2 + e Mg2 +. Na iteração 1, foi testada a hipótese que NH4+ pode ser omitido. O intervalo de concentração de Ca2 + e Mg2 + foi adotado a partir da análise de rastreio. A concentração mínima de NH4+ foi definida como zero e a concentração máxima foi adoptada no experimento de triagem. Nos experimentos seguintes, as concentrações do componente foram distribuídas em um 3 x 3 x 3 grade dentro do intervalo de concentração definida, resultando em 27 experimentos. Durante todos os cultivos, cinco repetições do meio de referência foram incluídas, que serviu como padrão interno e para garantir que não há efeitos posicionais sobre o MTP ocorreram. Para os restantes 16 poços, as concentrações de NH4+, Ca2 +e Mg2 + foram aleatoriamente distribuídas dentro das escalas determinadas. Figura 5 A visualiza os resultados das primeiras iterações. Rótulos de eixo referem-se as concentrações do componente usadas no meio de referência original, indicado por x Ref. As superfícies de azuis representam as interpolações de krigagem que foram calculadas utilizando o software KriKit. Cada superfície é associado com um nível de concentração relativa de NH4+ (azul escuro: 0 x Ref, xadrez: 1 x Ref, luz azul: 2 x Ref). Esta representação visual revela que é favorável para omitir NH4+. Superfícies de interpolação também mostram os efeitos positivos de Mg2 + e Ca2 +, como todos os aviões ascensão com concentrações crescentes. Baseado nos resultados da iteração 1, decidiu expandir a concentração gama de Ca2 + e Mg2 + , duplicando as concentrações máximos e deslocando a janela de desenho experimental para o canto superior direito, ver Figura 5 B. dentro deste intervalo, as concentrações foram distribuídas em uma grade 6 x 6. Isso garante uma distribuição uniforme ao longo do intervalo de concentração total, levando a resultados óptimos de interpolação Kriging. Figura 5 B mostra a trama de interpolação Kriging baseada em dados combinados medido em ambas as iterações (pontos vermelhos e amarelos quadrados). Para tanto, Ca2 + e Mg2 +, o efeito positivo de aumentar suas concentrações continua. Consequentemente, o procedimento foi repetido, duplicando a concentração máxima e assim, a janela de desenho experimental foi movida para explorar os limites do canto superior direito. Figura 6 A dá uma visão geral do processo de otimização restantes. A análise do conjunto de dados recolhido até iteração 3 revelou que uma limitação do efeito positivo de Mg2 +, ou seja, uma concentração óptima gama de Mg2 + foi identificada. Por conseguinte, decidiu expandir ainda mais o intervalo de concentração apenas para Ca2 + (iteração 4). Este procedimento foi repetido duas vezes (iteração 5 e 6) até que uma saturação do sinal de GFP foi encontrada. Esta saturação é explicada pela precipitação de sais de Ca para as concentrações aplicadas de Ca2 +, que não estão disponíveis para as células. Como resultados experimentais são sempre perturbados pelo barulho, a resultante interpolação Kriging aparece irregular e inspeção visual pode levar a conclusões falsas. No entanto, o intervalo de concentração ideal de componentes de mídia para o sinal GFP saturado pode ser confiantemente identificado com o estatística z -teste, que também é implementado no Danilo. O z -teste usa diretamente a informação estatística intrínseca fornecida pela krigagem método, ou seja, valores de previsão e incertezas de previsão. Figura 6 B mostra o planalto identificado, como determinado e visualizado usando a caixa de ferramentas do Danilo.A caixa de ferramentas do Danilo é livremente disponível36 e vem com um tutorial detalhado que explica como usar seus recursos. Se mais de dois componentes relevantes são encontrados, 3D-visualização atinge seu limite. Danilo fornece vários outros métodos de representação visual possível, tais como filmes ou “trama de triagem”. Se o potencial ideal está dentro do intervalo de concentração definidas, novas experiências são projetadas automaticamente usando a melhoria esperada de40,46. O delineamento experimental baseado na melhoria esperada é integrado na caixa de ferramentas Danilo. Informações mais detalhadas podem ser encontradas na documentação do software. Após o procedimento iterativo, foi realizada uma verificação dos resultados, conforme descrito na parte D. A validade dos pressupostos iniciais foi verificada através da realização de uma análise de sensibilidade adicional usando a composição ideal média. Ou seja, todos os componentes de mídia inicial de interesse eram variados, mas Ca2 + e Mg2 + foram definidas para seus níveis de concentração ideal. Neste estudo, as concentrações ideais = 32 x Ref e = 6,8 x Ref foram escolhidos. A tabela 2 mostra os resultados da análise validação. Semelhante a sensibilidade inicial de triagem (cf. quadro 1), NH4+ ainda tem uma influência negativa significativa e efeitos restantes são ainda insignificantes. Devido ao fácil acesso, o sinal de fluorescência do GFP da suspensão do cultivo foi utilizado para quantificar o título GFP extracelular durante todos os experimentos. Por razões de verificação, fluorescência de GFP foi validada contra outras medições. Porque GFP é secretada através da via-Tat, o sinal de fluorescência não pode discriminar entre intrae extracelular GFP. Assim, cultivos foram reproduzidos usando o meio de referência e o médio otimizado. Além da medição de fluorescência de sobrenadantes de cultivo sem célula, teor de proteínas foi quantificado pelo ensaio de Bradford e (semi)-melhoria qualitativa de GFP visualizado por SDS-Page15. Toda a medida resultante sinaliza aproximadamente foram dobrados para cultivos com meio otimizado em relação ao meio de referência e validado a cerca de 100% de melhoria do desempenho de secreção de médio otimizado. Por conseguinte, fluorescência específica de GFP de suspensão de cultivo pode ser considerada uma métrica adequada para o objetivo de otimização, ou seja, o título GFP extracelular. Figura 2 : Captura de tela da lista de pipetagem de volume para a análise de sensibilidade. Entradas na primeira coluna atribuir um identificador exclusivo para todos os volumes de uma linha; Esse identificador é o MTP bom número do cultivo alvo MTP o worktable líquido manipulador, cf. Figura 4C. Colunas restantes encode volumes para diferentes soluções (“Sln-01” a “15-Sln”) para ser pipetado. O volume acumulado de uma linha corresponde ao volume final de cultivo do bem correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Screenshot do líquido manipulação de software de controle “WinPREP”. Esquerda: Linha-ordenou comandos, incluindo um comando de transferência para cada solução a ser pipetado. Antes do comando final para adição do inóculo, um prompt de usuário é inserido para garantir que a cultura de semente é colocada na mesa na hora certa. Direita: Esquema de tabela de trabalho, incluindo a labware fonte para variação de existências (duas placas de poço profundo com 12 poços de coluna-como), a calha de reagente para estoque de descanso, água e inóculo e o cultivo de alvo de preparação de mídia MTP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Compilação de screenshots detalhados para instalação de pipetagem de uma solução stock. (A) desembrulhou o comando para pipetagem de estoque de Fe. Labware fonte e origem bem dentro são marcadas sobre o worktable pela leitura do quadro e coluna vermelha da placa correspondente de poço profundo. Labware de destino e destino poços dentro são marcados pelo quadro azul ao redor e azuis poços de cultivo o alvo MTP. (B) vista de exemplo detalhado na atribuição de pipetagem volumes para esta etapa (solução estoque de Fe). Número de destinos é ler a lista de pipetagem, que possui 48 linhas. Os volumes de distribuição para todos os poços de destino para solução estoque de Fe encontra-se na coluna 4 na lista de pipetagem. Observe que a primeira coluna na lista de pipetagem contém identificadores e volumes não ser transferido, ver Figura 2. (C) detalhes sobre destino bem numeração. Volumes de escritos na linha #1 da lista correspondente de pipetagem vão ser pipetados em bem marcado como #1 e assim por diante. Poços #01, 08 #, #41 e #48 correspondem aos poços A01, A08, F01 e F08 para a codificação alfa-numérico, que é também impresso em cultivo MTP em si. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 : Detalhados os resultados da primeira iteração. (A) interpolação Kriging baseado em dados experimentais de iteração 1. Pontos vermelhos indicam o conjunto de dados. Para comparação, todas as superfícies de interpolação três são sobrepostas em uma trama (azul escuro: 0 x Ref, xadrez: 1 x Ref, luz azul: 2 x Ref). Uma representação alternativa dos resultados pode ser encontrada em outros lugares15. (B) interpolação Kriging baseada em experiências realizadas em iteração 1 (pontos vermelhos) e iteração 2 (quadrados amarelos).Partes dos dados apresentados nesta figura tem sido previamente publicados15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6 : Descrição dos resultados de otimização iterativamente coletados. Kriging Final (A) modelo de previsão. (B) identificação estatística de área ideal (vermelho) baseia-se a estatística z-test, que é fornecido pelo Danilo. Caixas indicam sucessivas etapas de projeto iterativo e execução de experimentos. Partes dos dados apresentados nesta figura tem sido previamente publicados15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Componente de Valor médio do coeficiente normalizado Fe2 + -0.08 Mn2 + -0.05 Zn2 + -0.21 Cu2 + -0.21 NH4+ -2.04 Ni2 + -0.11 Co2 + -0.10 MoO42- 0,03 3BO3- 0,06 CA2 + 1.00 Mg2 + 0.45 Tabela 1: resultados da análise de sensibilidade. Valores do coeficiente que representa o efeito médio quando aumentando a concentração do componente respectivos meios de comunicação de seu valor de centro para seu valor máximo. Para ideais projetos experimentais, como encontrado na literatura padrão e usado aqui, o desvio-padrão representa diretamente a variação experimental devido à replicação do experimento referência. Valores do coeficiente foram normalizados pelo valor maxium (0.0422 para componente Ca2 +). Desvio-padrão coeficiente normalizado e absoluto é 0,54 e 0.0226, respectivamente. Componente de Valor médio do coeficiente normalizado Fe2 + -1.00 Mn2 + 1.00 Zn2 + -3.48 Cu2 + -0.52 NH4+ -15.95 Ni2 + 0,69 Co2 + -0.51 MoO42- -0.45 3BO3- -1.11 Tabela 2: resultados da análise de sensibilidade final. Valores do coeficiente que representa o efeito médio quando aumentando a concentração do componente respectivos meios de comunicação de seu valor de centro para seu valor máximo. Como um projeto experimental óptimo foi usado, o desvio padrão só depende a variação experimental usando a composição média otimizada. Variação experimental ligeiramente aumentada em comparação com a variação usando o meio de referência. Valores do coeficiente foram normalizados pelo valor maxium (0.0106 para componente Mn2 +). Desvio-padrão coeficiente normalizado e absoluto é 3.63 e 0.0385, respectivamente.

Discussion

A natureza genérica do protocolo apresentado permite várias adaptações, por exemplo, para estudar a expressão microbiana anfitriões⁹^,⁴⁷^,,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^, ⁵¹, ou para otimizar a outras propriedades da proteína alvo, como títulos do padrão ou dissulfureto de glicosilação. O protocolo também pode precisar de ser adaptado para o equipamento de laboratório disponíveis. A integração de um sistema MBR permite aumentando o throughput experimental, que permite grande economia no tempo. No entanto, quando substituindo biorreatores totalmente instrumentados e controláveis pelos sistemas MBR, escalabilidade dos resultados deve ser considerada⁸^,³⁷^,⁵²^,⁵³. O uso de metodologias DOE e modelagem matemática ajuda a maximizar o conteúdo de informação de dados de medição em relação a objetiva estudados⁵⁴ por eficiente planejamento experimental e de interpretação de dados baseados em modelo¹⁵.

Modificações para o método
Ao lado de múltiplos propósito e expansível robótico líquido manipulação de sistemas como o usado neste estudo, deve-se mencionar que existem vários líquido menor manipulação sistemas comercialmente disponíveis, que são capazes de executar esta tarefa e podem ser colocados dentro bancada de trabalho de fluxo laminar. Se nenhum sistema automatizado de pipetagem é disponível, composições de meios diferentes de acordo com o plano DOE também podem ser realizadas por pipetagem manual usando pipetas única e/ou multi-canal. Desde a preparação manual é mais propenso a erros e exigirá trabalho altamente concentrado por muito tempo, é aconselhável preparar um número menor de composições diferentes mídias.

Dependendo dos recursos do sistema MBR independente, o protocolo de cultivo correspondente irá variar. Por exemplo, se nenhuma medição on-line de formação de biomassa está disponível, pode ser suficiente medir a concentração de biomassa após a conclusão do experimento crescimento. Em combinação com monitoramento on-line do pH e oxigênio dissolvido, que é implementado em vários sistemas MBR, a saturação de crescimento pode ser determinada com segurança. Em princípio, as experiências de crescimento podem ser conduzidas no MTPs sozinho colocados dentro de incubadoras, sem o uso de um sistema MBR a tremer. Neste caso, as condições de cultivo adequado tem que ser assegurada: cultivos de oxigênio-limitada (1) podem ser evitado pelo uso do MSDN com geometrias adequadas, em combinação com adequada frequências a tremer e tremer diâmetros, por exemplo, quadrado 96 ou 24 profunda placas bem operado a 1.000 rpm em jogar apenas 3 mm ou a 250 rpm em passos de 25 mm, respectivamente. Importante, quanto mais baixo as taxas de transferência de oxigênio máxima atingível, menor a fonte principal de carbono deve ser concentrada. Como mencionado acima, para este estudo, o uso de glicose 10 g/L foi adequado para evitar a limitação de oxigênio para as condições de cultivo empregados; (2) a amostragem das culturas MTP para quantificação de biomassa e o produto deve ser reduzida ao mínimo. Cada vez que o MTP é retirado da incubadora tremendo, transferência de oxigênio será imediatamente avaria que pode resultar em condições desfavoráveis de cultivo; (3) na opinião dos autores, o uso de leitores MTP como dispositivos de cultivo não é recomendado como esses dispositivos não foram desenvolvidos para esta finalidade. Por exemplo, agitação mecânica foram construídas para a mistura ocasionais de microplacas após a adição do reagente e, muitas vezes falta-lhes robustez para corridas longas de duração agitação contínua por dias. Além disso, entrada de alimentação suficiente necessária para cultivos microbianos não pode ser realizada nesses leitores. A integração das leituras de densidade óptica em breve intervalos de tempo requer parada do movimento de agitação, resultando em períodos repetidos de limitação de oxigênio. Além disso, a evaporação em tais sistemas, durante períodos de longo período de cultivo vai distorcer os resultados. Para obter mais detalhes sobre o tema surpreendentemente complexo sobre o uso do MSDN para cultivos microbianos, o leitor é referido a literatura citada²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶e referências ali.

Considerações adicionais
A passos de otimização iterativo de acelerar, é aconselhável selecionar cuidadosamente o método analítico para quantificação do produto. Rápido e simples métodos devem ser preferidos ao custo de precisão e exatidão, como a estratégia de projeto experimental iterativo tolera imprecisão experimental. No entanto, os resultados finais devem ser cotejados com métodos de quantificação do produto suficientemente precisa e exata que pode ser mais complicado. Em geral, cuidadosa avaliação e tomada de decisão sobre os procedimentos de estudo requerem esforço no início do estudo, mas pagam a longo prazo, depois que se estabeleceram métodos de rotina.

É altamente recomendável para definir um experimento de referência é comparado a todas as experiências durante a otimização. Ou seja, as concentrações de componente média aplicada, bem como saída medida é normalizada através de dividindo por valores de referência. Desta forma, cada um aplicado e o valor medido pode ser interpretado como a x-dobra o valor de referência. Para tomar em conta as variações entre as placas, cinco experimentos de referência são executados em cada prato. O valor médio dos resultados medidos é usado para a normalização.

Ele pode geralmente não ser garantido que o médio desenvolvido também é ideal para outras tensões. No entanto, o melhor médio provavelmente também será apropriado para cultivar variedades de expressão com pequenas diferenças genéticas, por exemplo, quando produzir variantes da enzima com substituições de aminoácidos única obtida (estudos de mutagênese Embora ainda única ponto foram descritas mutações para o metabolismo celular de efeito e expressão heteróloga desempenho⁵⁵^,⁵⁶). Neste caso, o protocolo apresentado pode ser um primeiro passo, seguido por protocolos de expressão do elevado-throughput seleções⁵⁷. Se o protocolo é usado para o desenvolvimento médio com escala-up subsequente para cultivos alimentados em lotes, o médio otimizado deve ser verificado para as respectivas condições de Bioprocessos, clone rastreio campanhas na microescala identificados diferente top artistas de diferentes estratégias de alimentação e de⁵²^,de meios de cultivo⁵⁸. Além disso, o Danilo introduzido³⁶ geralmente pode contribuir para otimização de Bioprocessos holística melhorada.Apenas recentemente, as capacidades da ferramenta foram estendidas para também oferecer suporte a multi-objetivo de otimização⁴⁰, que pode ser importante para otimizar os dois processos de upstream e downstream⁵⁹^,⁶⁰.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

As atividades científicas do centro de ciência de bioeconomia foram apoiadas financeiramente pelo Ministério da inovação, ciência e pesquisa no âmbito da BioSC NRW-Strategieprojekt (n º 313/323-400-002-13). Os autores agradecer o Ministério da inovação, ciência e pesquisa do Norte-Vestfália e a Heinrich Heine University Düsseldorf para uma bolsa de estudos para Lars Freier dentro Cluster CLIB-pós-graduação Biotecnologia Industrial. Mais financiamento foi recebido do programa espaços habilitando “Laboratórios de inovação de Helmholtz” da associação alemã de Helmholtz para apoiar o “microbiana Bioprocessos laboratório – A Helmholtz laboratório de inovação”.

Materials

BioLector	m2p-labs	G-BL-100
Flowerplate	m2p-labs	MTP-48-BOH	For cultivation in the BioLector device
Sealing foil	m2p-labs	F-GP-10	Sterile sealing for Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	n/a	Freely available, MATLAB installation required
Janus pipetting robot	Perkin Elmer	n/a	Includes "WinPrep" software installation
12-column deep well microplate	E&K Scientific	EK-2034	Container for medium stock solutions
96 well microplates, transparent, F-bottom	Greiner	655101	For Bradford protein assay
µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom	Greiner	655087	For flourescence measurement in cell-free supernatants
Pipette Research plus multi-channel pipettes	Eppendorf	n/a	Facilitates manual liquid handling with microplates
TruPAG Precast Gels	Sigma	PCG2002	For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
Bradford Reagent	Sigma	B6916
C. glutamicum pCGPhoD^Bs-GFP	n/a	n/a	Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

References

Choi, J. -. M., Han, S. -. S., Kim, H. -. S. Industrial applications of enzyme biocatalysis: Current status and future aspects. Biotechnol Adv. 33 (7), 1443-1454 (2015).
Li, S., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., Wang, X. Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), (2012).
Adrio, J. L., Demain, A. L. Microbial enzymes: tools for biotechnological processes. Biomolecules. 4 (1), 117-139 (2014).
Yim, S. S., An, S. J., Kang, M., Lee, J., Jeong, K. J. Isolation of fully synthetic promoters for high-level gene expression in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 2959-2969 (2013).
Hemmerich, J., et al. Use of a Sec signal peptide library from Bacillus subtilis.for the optimization of cutinase secretion in Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 15 (1), 208 (2016).
Wendisch, V. F. Microbial production of amino acids and derived chemicals: synthetic biology approaches to strain development. Curr Opin Biotechnol. 30, 51-58 (2014).
Lee, J. -. Y., Na, Y. -. A., Kim, E., Lee, H. -. S., Kim, P. The Actinobacterium Corynebacterium glutamicum, an Industrial Workhorse. J Microbiol Biotechnol. 26 (5), 807-822 (2016).
Rohe, P., Venkanna, D., Kleine, B., Freudl, R., Oldiges, M. An automated workflow for enhancing microbial bioprocess optimization on a novel microbioreactor platform. Microb Cell Fact. 11 (1), 144 (2012).
Liu, X., et al. Expression of recombinant protein using Corynebacterium glutamicum.: progress, challenges and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 652-664 (2016).
Freudl, R., Burkovski, A. Corynebacterium glutamicum as a Platform Organism for the Secretory Production of Heterologous Proteins. Corynebacterium glutamicum: From systems biology to biotechnological applications. , 161-177 (2015).
Yim, S. S., et al. Development of a new platform for secretory production of recombinant proteins in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 113 (1), 163-172 (2015).
Limberg, M. H., et al. Metabolic profile of 1,5-diaminopentane producing Corynebacterium glutamicum under scale-down conditions: Blueprint for robustness to bioreactor inhomogeneities. Biotechnol Bioeng. 114 (3), 560-575 (2016).
Käβ, F. Assessment of robustness against dissolved oxygen/substrate oscillations for C. glutamicum DM1933 in two-compartment bioreactor. Bioprocess Biosyst Eng. 37 (6), 1151-1162 (2014).
Teramoto, H., Watanabe, K., Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. High yield secretion of heterologous proteins in Corynebacterium glutamicum.using its own Tat-type signal sequence. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 677-687 (2011).
Freier, L., Hemmerich, J., Schöler, K., Wiechert, W., Oldiges, M., von Lieres, E. Framework for Kriging-based iterative experimental analysis and design: Optimization of secretory protein production in Corynebacterium glutamicum. Eng Life Sci. 16 (6), 538-549 (2016).
Huber, R., Roth, S., Rahmen, N., Büchs, J. Utilizing high-throughput experimentation to enhance specific productivity of an E. coli. T7 expression system by phosphate limitation. BMC Biotechnol. 11 (1), 22 (2011).
Kottmeier, K., Müller, C., Huber, R., Büchs, J. Increased product formation induced by a directed secondary substrate limitation in a batch Hansenula polymorpha culture. Appl Microbiol Biotechnol. 86 (1), 93-101 (2010).
Kennedy, M. J., Krouse, D. Strategies for improving fermentation medium performance: A review. J Ind Microbiol Biotechnol. 23 (6), 456-475 (1999).
Kleman, G. L., Strohl, W. R. Developments in high cell density and high productivity microbial fermentation. Curr Opin Biotechnol. 5 (2), 180-186 (1994).
Jones, R., Gadd, G. Ionic nutrition of yeast: Physiological mechanisms involved and implications for biotechnology. Enzy Microb Technol. 12 (6), 402-418 (1990).
Zhang, J., Greasham, R. Chemically defined media for commercial fermentations. Appl Microbiol Biotechnol. 51 (4), 407-421 (1999).
Kensy, F., et al. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates: Determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time measurement during microbial growth. Biotechnol Bioeng. 89 (6), 698-708 (2005).
Hermann, R., Lehmann, M., Büchs, J. Characterization of gas-liquid mass transfer phenomena in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 81 (2), 178-186 (2002).
Duetz, W. A. Microtiter plates as mini-bioreactors: Miniaturization of fermentation methods. Trends Microbiol. 15 (10), 469-475 (2007).
Funke, M., Diederichs, S., Kensy, F., Müller, C., Büchs, J. The baffled microtiter plate: Increased oxygen transfer and improved online monitoring in small scale fermentations. Biotechnol Bioeng. 103 (6), 1118-1128 (2009).
Lattermann, C., Funke, M., Hansen, S., Diederichs, S., Büchs, J. Cross-section perimeter is a suitable parameter to describe the effects of different baffle geometries in shaken microtiter plates. J Biol Eng. 8, 18 (2014).
Samorski, M., Müller-Newen, G., Büchs, J. Quasi-continuous combined scattered light and fluorescence measurements: A novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 92 (1), 61-68 (2005).
Kensy, F., Zang, E., Faulhammer, C., Tan, R. -. K., Büchs, J. Validation of a high-throughput fermentation system based on online monitoring of biomass and fluorescence in continuously shaken microtiter plates. Microb Cell Fact. 8 (1), 31 (2009).
Puskeiler, R., Kaufmann, K., Weuster-Botz, D. Development, parallelization, and automation of a gas-inducing milliliter-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng. 89 (5), 512-523 (2005).
Bareither, R., Pollard, D. A review of advanced small-scale parallel bioreactor technology for accelerated process development: Current state and future need. Biotechnol Prog. 27 (1), 2-14 (2011).
Hortsch, R., Stratmann, A., Weuster-Botz, D. New milliliter-scale stirred tank bioreactors for the cultivation of mycelium forming microorganisms. Biotechnol Bioeng. 106 (3), 443-451 (2010).
Isett, K., George, H., Herber, W., Amanullah, A. Twenty-four-well plate miniature bioreactor high-throughput system: Assessment for microbial cultivations. Biotechnol Bioeng. 98 (5), 1017-1028 (2007).
Motta Dos Santos, L. F., Coutte, F., Ravallec, R., Dhulster, P., Tournier-Couturier, L., Jacques, P. An improvement of surfactin production by B. subtilis BBG131 using design of experiments in microbioreactors and continuous process in bubbleless membrane bioreactor. Bioresour Technol. 218, 944-952 (2016).
Islam, R. S., Tisi, D., Levy, M. S., Lye, G. J. Framework for the Rapid Optimization of Soluble Protein Expression in Escherichia coli Combining Microscale Experiments and Statistical Experimental Design. Biotechnol Prog. 23 (4), 785-793 (2007).
Huber, R., et al. Robo-Lector: A novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb Cell Fact. 8 (1), 42 (2009).
. Kriging toolKit (KriKit) Available from: https://github.com/modsim/KriKit (2017)
Kensy, F., Engelbrecht, C., Büchs, J. Scale-up from microtiter plate to laboratory fermenter: evaluation by online monitoring techniques of growth and protein expression in Escherichia coli.and Hansenula polymorpha fermentations. Microb Cell Fact. 8 (1), 68 (2009).
Lu, C., Bentley, W. E., Rao, G. A high-throughput approach to promoter study using green fluorescent protein. Biotechnol Prog. 20 (6), 1634-1640 (2004).
Zanzotto, A., Boccazzi, P., Gorret, N., van Dyk, T. K., Sinskey, A. J., Jensen, K. F. In situ measurement of bioluminescence and fluorescence in an integrated microbioreactor. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 40-47 (2006).
Freier, L., von Lieres, E. Multi-Objective Global Optimization (MOGO): Algorithm and Case Study in Gradient Elution Chromatography. Biotechnol J. , (2016).
Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum.: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J Bacteriol. 175 (17), 5595-5603 (1993).
Weuster-Botz, D., Kelle, R., Frantzen, M., Wandrey, C. Substrate Controlled Fed-Batch Production of L-Lysine with Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Prog. 13 (4), 387-393 (1997).
Meissner, D., Vollstedt, A., van Dijl, J. M., Freudl, R. Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 76 (3), 633-642 (2007).
Morschett, H., Wiechert, W., Oldiges, M. Automation of a Nile red staining assay enables high throughput quantification of microalgal lipid production. Microb Cell Fact. 15, 34 (2016).
Fisher, R. A. . The design of experiments. , (1935).
Morschett, H., Freier, L., Rohde, J., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. A framework for accelerated phototrophic bioprocess development: Integration of parallelized microscale cultivation, laboratory automation and Kriging-assisted experimental design. Biotechnol Biofuels. 10, 26 (2017).
Le Loir, Y., et al. Protein secretion in Lactococcus lactis: An efficient way to increase the overall heterologous protein production. Microb Cell Fact. 4 (1), 2 (2005).
Anné, J., Vrancken, K., van Mellaert, L., van Impe, J., Bernaerts, K. Protein secretion biotechnology in Gram-positive bacteria with special emphasis on Streptomyces lividans. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1750-1761 (2014).
Gupta, S. K., Shukla, P. Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (6), 1089-1098 (2016).
Fu, L. L., Xu, Z. R., Li, W. F., Shuai, J. B., Lu, P., Hu, C. X. Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: implication for optimization of heterologous protein secretion. Biotechnol Adv. 25 (1), 1-12 (2007).
Yoon, S., Kim, S., Kim, J. Secretory Production of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Rec Pat Biotechnol. 4 (1), 23-29 (2010).
Hemmerich, J., et al. Comprehensive clone screening and evaluation of fed-batch strategies in a microbioreactor and lab scale stirred tank bioreactor system: application on Pichia pastoris producing Rhizopus oryzae lipase. Microb Cell Fact. 13 (1), 36 (2014).
Glazyrina, J., Krause, M., Junne, S., Glauche, F., Strom, D., Neubauer, P. Glucose-limited high cell density cultivations from small to pilot plant scale using an enzyme-controlled glucose delivery system. New Biotechnol. 29 (2), 235-242 (2012).
Gernaey, K. V., et al. Monitoring and control of microbioreactors: An expert opinion on development needs. Biotechnol J. 7 (10), 1308-1314 (2012).
Rahmen, N., Fulton, A., Ihling, N., Magni, M., Jaeger, K. -. E., Büchs, J. Exchange of single amino acids at different positions of a recombinant protein affects metabolic burden in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 14, 10 (2015).
Rahmen, N., et al. A particular silent codon exchange in a recombinant gene greatly influences host cell metabolic activity. Microb Cell Fact. 14, 156 (2015).
Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in E. coli. J Vis Exp. (89), e51464 (2014).
Scheidle, M., et al. High-throughput screening of Hansenula polymorpha clones in the batch compared with the controlled-release fed-batch mode on a small scale. FEMS Yeast Res. 10 (1), 83-92 (2010).
Baumann, P., Bluthardt, N., Renner, S., Burghardt, H., Osberghaus, A., Hubbuch, J. Integrated development of up- and downstream processes supported by the Cherry-Tag™ for real-time tracking of stability and solubility of proteins. J Biotechnol. 200, 27-37 (2015).
Baumann, P., Hahn, T., Hubbuch, J. High-throughput micro-scale cultivations and chromatography modeling: Powerful tools for integrated process development. Biotechnol Bioeng. 112 (10), 2123-2133 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

Automatically Generated