Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Johannes Hemmerich; Lars Freier; Wolfgang Wiechert; Eric von Lieres; Marco Oldiges

doi:10.3791/56234

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengineering

Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı

Published: December 15, 2017

doi:

10.3791/56234

Johannes Hemmerich*^1,2, Lars Freier*^1,2, Wolfgang Wiechert^1,2,3, Eric von Lieres^1,2, Marco Oldiges^1,2,4

¹IBG-1: Biotechnology,Forschungszentrum Jülich, ²Research Center Jülich,Bioeconomy Science Center (BioSC), ³Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB),RWTH Aachen University, ⁴Institute for Biotechnology,RWTH Aachen University

Summary

Bu el yazması mikrobiyal yetiştirme ortamının terzi tasarımı için genel bir yaklaşımı açıklar. Bu güvenilirlik ve sıvı ortam işleme hızı artırmak için laboratuvar robot tarafından desteklenen yeterli ekimi verimi için deneysel tasarım ve microbioreactor teknoloji Kriging tabanlı birleştiren yinelemeli bir iş akışı tarafından etkin hazırlık.

Abstract

Bir çekirdek endüstriyel biyoteknoloji mikrobiyal üretim hücre fabrikaları kullanarak yinelemeli işlem zorlanma mühendislik ve optimizasyon Biyoproses koşullardan ilgilendirir. Bir önemli yönü ilgi mikrobiyal ürün oluşumu için en uygun bir ortam sağlamak için yetiştirme ortamının gelişmedir. İyi medya kompozisyon genel Biyoproses performansını önemli ölçüde etkileyebilir kabul edilir. Beslenme orta optimizasyonu rekombinant protein geliştirmek için bilinen üretim mikrobiyal sistemler ve böylece, bu Biyoproses geliştirme ödüllendirici bir adımdır. Özel tasarım yetiştirme ortamının yeterli ekimi üretilen iş, hızlı ürün analytics gibi destek için microbioreactor teknoloji talepleri sıkıcı bir görev olduğundan Ancak, edebiyat, çok sık standart medya tarifleri alınır sıvı güvenilirlik sağlamak için laboratuvar robot tarafından adımlar işleme. Ayrıca, gelişmiş matematiksel yöntemler rasyonel ölçüm verileri analiz ve verimli bir şekilde en iyi bilgi içerik elde etmek gibi paralel deney tasarlama için gereklidir.

Sunulan genel doğası farklı laboratuar ekipmanları, diğer ifade ana bilgisayarları ve hedef proteinler ilgi, hem de daha fazla Biyoproses parametreleri kolay uyum sağlar. Ayrıca, diğer en iyi duruma getirme hedefleri protein üretim hızı, belirli verim veya ürün kalitesi gibi diğer optimizasyon çalışmaları kapsamında sığdırmak için seçilebilir. Uygulamalı Kriging araç kutusu (KriKit) için tasarım, deneyler (geliştirilmiş bütünsel Biyoproses optimizasyonu için katkıda bulunan DOE) genel bir araçtır. Aynı zamanda akış yukarı ve aşağı akım işlemleri en iyi duruma getirme içinde önemli olabilen çok objektif optimizasyon destekler.

Introduction

Modern rekombinant gen teknolojisi ilaç endüstrisi, hayvan besleme, organik kimya ve gıda işleme¹^,²^,³çeşitli uygulamalarda teknik enzimler geniş kullanımını etkinleştirir. Endüstriyel Biyoteknoloji ve en iyi duruma getirilmiş rekombinant protein üretimi, önemli bir konunun teknik enzimler toplu miktarlarda yapımıdır ve her ikisi de strain ve Biyoproses Mühendisliği gereklidir. Verimli bir şekilde tasarlanmış üretim suşları üretimi için farklı genetik kitaplık mevcuttur örneğin, dengeli gen ifade⁴ veya artmış salgı verimliliği⁵.

Corynebacterium glutamicum amino asitler endüstriyel ölçekte⁶^,⁷ büyük bir üretici ve rekombinant proteinler^{8 salgı üretimi için bir çekici konvansiyonel olmayan ifade ana temsil eden} ^,⁹. Genel salgı (sn) ve standart-arginin translocation (Tat) yolu C. glutamicum içinde varsa ve rekombinant protein salgılanması¹⁰için başarıyla uygulandı. Biyoproses mühendislik endüstriyel ölçekte, hem de protein g/L tutarları¹¹ ve büyük ölçekli yılında bulundu Biyoproses inhomogeneities ilgili büyük sağlamlık salgılar yeteneği amino asit üretimle ilgili kapsamlı deneyim arazisi¹²^,¹³, endüstriyel ölçekte Contegra proteinler salgı üretimi için umut verici bir platform organizma C. glutamicum olun.

Beslenme orta optimizasyonu rekombinant protein üretimi ile mikrobiyal sistemleri¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ ve sonuç olarak, Orta ayarını artırmak için bilinen kompozisyon ise Biyoproses ödüllendirici bir adımda geliştirme ile ilgili en iyi verimlilik¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. Uygulama mikrobiyal ekimi²²^,²³^,²⁴ (MTPs) microtiter plakaların üzerinde yoğun araştırma geliştirme ve MTPs tasarımını mikrobiyal ekimi²⁵ ^{açtı ,}²⁶ ve MTP tabanlı microbioreactor (MBR) sistemleri ile online izleme ve çevresel gelişimi kontrol²⁷^,²⁸. MBRs deneysel ekimi üretilen iş önemli bir artış sağlar. Ayrıca, reaktörler, biyoreaktörler, örneğin, kabarcık sütunlar veya karıştırılmış tank diğer türlerinden kaynaklanan MBR sistemleri mevcuttur mikrobiyal Biyoproses optimizasyonu²⁹^,³⁰^,³¹için^, ³².

Genel olarak, en iyi duruma getirme çalışmaları DOE metodolojileri, tasarım değişkenleri arasındaki etkileşimler değerlendirmek veya yüksek boyutlu arama alanlarda azaltmak gibi ile birlikte daha da güçlü hale gelir artan deneysel işlem hacmi faydalanın. Sonuç olarak, MBR sistemleri, laboratuvar otomasyon ve DOE kombine kullanımı biyoteknoloji⁸^,¹⁶^,³³^,³⁴^,³⁵içinde güçlü bir yöntem olduğunu kanıtlamıştır.

Bir iletişim kuralı medya optimizasyonu için state-of–art laboratuvar otomasyon, MBR teknolojisi online işlem izleme ve Kriging tabanlı veri analizi/deneysel tasarım ile birleştirerek sunulur. Kriging metodoloji bir MATLAB indirilen ve kullanılan araç kutusunda (“KriKit”) uygulanan ücret³⁶ücretsiz. Uygulama örnek olarak, CgXII en az orta bileşimi optimize ederek maksimizasyonu salgı yeşil ﬂuorescent protein (GFP) üretim C. glutamicum ile gösterilir. GFP titresi kolayca sayılabilir ve MBR sistemleri³⁷^,³⁸^,³⁹üzerinde çalışmalar için modeli protein olarak yaygın olarak uygulanan en iyi duruma getirme amacı seçildi.

Sunulan çerçeve şekil 1‘ de gösterildiği dört adım bölünür. Adımları kutusu kareler tarafından belirtilir ve protokol bölümlerine karşılık gelir. Proje hedefleri tanımlamak ve gereken yöntemleri belirlemek için ilk adım (şekil 1A) olduğunu. DOE metodolojisi, MBR teknolojisi ve laboratuvar otomasyon kombinasyonu güçlü veri işleme talepleri artan bir deneysel üretilen iş sağlar. İkinci adım (şekil 1B) hassas tasarım değişkenleri (Yani, orta bileşenleri) en iyi duruma getirme amacı yüksek etkisi ile tespit amaçlamaktadır. Bu tasarım değişkenleri ilgi azaltılmış bir dizi yol açar. Üçüncü adım (şekil 1 c) kalan tasarım değişkenleri ve faiz amacı fonksiyonel ilişkisi daha ayrıntılı incelenmesi için yinelemeli bir optimizasyon oluşmaktadır. Gittikçe genişletilmiş veri kümesi kullanarak, Kriging yaklaşım ölçüsüz yerlerinde deneysel sonucunu tahmin etmek için uygulanır. Kriging modeli bir optimum veya Yaylası yeterli doğrulukta tahmin en kısa zamanda yinelemeli döngüsü durdurur. Sonuçları tespit optimum etrafında daha fazla duyarlılık analizi ile başlayan Dördüncü adımda (şekil 1 d) doğrulanır. Başlangıçta, büyük küçük harf duyarlı bileşenleri de en uygun bölgede büyük küçük harf duyarlı olmak tespit edilirse, bu üçüncü adımda yinelemeli en iyi duruma getirme işlemi sırasında geçerlidir olduğunu varsaymak makul. Daha sonra bu optimizasyon sonuçları doğrulamak için bir faaliyet tahlil veya SDS-sayfa gibi dik yöntemlerden uygulama tarafından tavsiye edilir.

Sunulan genel doğası pH değeri veya yetiştirme sıcaklığı gibi değişkenler farklı laboratuar ekipmanları, diğer ifade ana bilgisayarları ve hedef proteinler seçim yanı sıra daha fazla Biyoproses kolay adaptasyon için izin verir.Ayrıca, diğer en iyi duruma getirme hedefleri protein üretim hızı, belirli verim veya ürün kalitesi gibi diğer optimizasyon çalışmaları kapsamında sığdırmak için seçilebilir.

Resim 1 : İş akışı en iyi duruma getirme çalışmanın. Dört çerçeve kutuları iletişim kuralı, “Hamile kalma çalışma ve tanımı yöntemleri” (Bölüm 1), “Duyarlılık analizi” (Bölüm 2), “Yinelemeli optimizasyonu” (Bölüm 3) ve “Doğrulama” (Bölüm 4) bölümlerine karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protocol

1. çalışma ve yöntemleri tanımını hamile kalma (şekil 1: Bölüm A) Not: En iyi duruma getirme amacı tanımı: bir saat ders gerekli ürün oluşumu veya yalnızca sınırlı bir süre aralığı veya hatta bir sabit zaman noktası uygun olan? Ayrıca, istikrar, çaba analitik miktar veya yetiştirme süresi gibi olası sorunları dikkate alın. Son protein titresi alternatif, diğer hedefler biyokütle veya yetiştirme zaman gibi düşünülebilir. Yetiştirme zamanı uzay-zaman-verim tarafından yansıtılır iken biyokütle biyokütle belirli ürün verim tarafından yansıtılır. (En az) ürün kalitesi de bir amaç olabilir. Çok objektif optimizasyonu belirli durumlarda, başka bir yerde40anlatıldığı gibi gerekli olabilir. Bu çalışmada, GFP titresi ekiminin 17 h sonra en iyi duruma getirme amacı seçildi. GFP Floresans büyük modeli protein konsantrasyonu belirlemek kolaylaştırır bu çalışmada, mevcut ekipman kullanma online izlenebilir.Not: Parametreler optimize için tanımı: CgXII orta 16 bireysel bileşenleri41 ‘ oluşur ve tüm-in bunlar tam faktöryel tasarım içinde soruşturma 216 ≈ 65.000 deneylerde neden. Bu nedenle, arama alanı bir rasyonel ve deneyim uygulamalı olarak azaltılmış olabilir gerekir. Ortam bileşenleri optimizasyonu için kabul seçimi mevcut uzman bilgisine ve edebiyat veriler tarafından desteklenebilir. Hangi orta bileşen konsantrasyonları değil çeşitli karar. CgXII orta optimizasyonu için aşağıdaki bileşenleri düzeltilmesi için seçilmiştir: Glikoz 10 g/l sabit Daha fazla glikoz daha fazla GFP biyokütle salgılayan verir çünkü bu iyileştirme saçmadır. Sezgisel orta etkileri ortaya çıkarmak için amacı oldu. 3-(N-morpholino) propanesulfonic asit (paspas) 42 g/L. sabit Bu toplu işleme sırasında yeterli tamponlama kapasitesi sağlar ve değil metabolize edilir.Not: BEZLERİ ilavesi bu son konsantrasyonu, pH 7, bir başlangıç değeri diğer hisse senedi çözümlerinin eklendi, farklı birimlerle bile pH 7 olmayan sağlar. Ancak, pH değerleri başlayarak herhangi bir sapma dışlamak için pH orta besteleri nerede tüm hisse senedi çözümleri onların maksimum ve minimum miktarlar eklenir için kontrol edilmelidir. KH2PO4 ve K2HPO4 1 g/L her sabittir. Bunlar da tamponlama kapasitesi sunar ve fosfat kaynağı olarak hizmet. Üre 5 g/l sabit Bu bir Bazal azot kaynağı ve Ajan, N-sınırlama önlemek için yeterli pH sabitleme olarak hizmet vermektedir. Biotin 0.2 mg sabit/L. C. glutamicum ATCC13032 için biotin auxotrophic. Protocatechuic asit (PCA) 30 mg/l sabit Bu Ajan şelat bir demir hizmet vermektedir. İzopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 100 µM sabittir. Gfp gen ifadesi indükler. Yüksek ve düşük konsantrasyonları ilk duyarlılığı izlemek için ortam bileşenleri seçin. Burada, media bileşenlerinden üç tipik grupları bileşenlerinden seçilmiştir. Her bileşen için incelenen düşük ve yüksek konsantrasyonları şunlardır: Standart azot kaynağı: (NH4)2SO4 (8-32 g/L); azot kaynağı varyasyonu biyokütle özgü GFP sinyal8optimizasyonu için umut verici olduğu bildirildi. Eser elementler: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7 H2O (0,4-1.6 mg/L), CuSO4 ∙ 5 H2O (125-501 µg/L), NiCl2 ∙ 6 H2O () 8-32 µg/L) ve CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 µg/L). Eser elementler bileşimi CgXII orta boy41ilk yayından devralınır. Buna ek olarak, Na2MoO4 ∙ H2O (26-104 µg/L) ve H3BO CgXII orta42yayımlanmış bir VARIANT olarak kullanıldıkları haliyle3 (20-80 µg/L) eser elementler dahil. Makro öğeleri: MgSO4 ∙ 7 H2O (0,2-0,4 g/L), CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3-21,2 mg/L). Bunlar, başka bir çalışma14, salgı GFP üretimini artırmak için divalent diğer özellikler arasında C. glutamicum zorlanma R farklı bir orta arka plan ve CgR0949 Tat sinyal peptid kullanıldığı bulundu. Malzemeler ve tanımı yordamlar hazırlanmasıNot: Bu tanımlamak ve deneysel yöntemleri ayrıntılı bir düzeyde düzeltmek için tavsiye edilir. Bu standardizasyon farklı sonuçlar geri içsel biyolojik değişkenlik veya farklı orta besteleri için izlenebilir sağlar.Not: Medya çözümleri stok: tüm bireysel hazır çözümler hazırlamak ortam bileşenleri araştırıldı. Tüm bileşenler için farklı birimler seyreltme için izin vermek için son derece yoğun stokları hazırlayın. Bu tüm hisse senedi çözümleri tasarım planına göre onların en yüksek ses seviyesinde birleştirerek sonra bu geçemez ki son ekimi hacim, bkz. paragraf “Orta hisse senedi çözüm pipetting liste nesil” Adım 1.3.3 anlamına gelir. Yüksek konsantrasyonlu bir çözüm ek bir çok düşük ek birim içinde örneğin sonuçlanırsa < 1/100th son ekimi biriminin seyreltik hisse senedi çözüm buna göre. Örneğin, bu çalışmada pipetting hacmi az 10 µL olanaksız olarak tanımlanmıştır. Genellikle, trace öğe çözüm yüksek konsantre olup 1,000fold orta son standart toplama ile ilgili. Ortam bileşenleri ile ilgili başvuru tarifi konsantrasyonlarda katları (X-katlama) konsantre daha avantajlıdır. Böylece, kesirli ondalık olanaksız pipetting birimleri kaçınılmalıdır. Tüm hisse senedi çözümleri CgXII orta detaylı tarifleri ek belge verilir. Çalışma hücre Bankası (WCB)Not: bir WCB aliquot her büyüme deneme için kullanılır. Daha fazla aliquots gerekiyorsa, kullanım 100 mL beyin kalp infüzyon (BHI) orta 1000 ml şaşkın şişeler sallamak veya gliserol çözüm toplamadan önce havuza birden çok sallamak şişeler aşılamak. Rekombinant ifade zorlanma C. glutamicum pCGPhoDBs- GFP43 Ağar kaplamalar (37 g/L BHI toz, 20 g/M agar, 25 mg/L sefaloridin) üzerinde tek kolonileri hazırlayın. Malzeme Kaplama ya da taze dönüştürme veya bir cryopreserved aliquot gelebilir.30 ° C’de tek kolonileri görünümünü kadar kuluçkaya; Bu genellikle bir iki gün sürer. Bir shaker şişesi kültür (25 mg/L sefaloridin, 500 mL şaşkın flask, 250 d/d, 25 mm çapında sallayarak, 30 ° C ile 50 mL BHI orta) koloni malzeme ile aşılamak ve kuluçkaya geceleme (yaklaşık 16 h). 500 g/L steril gliserol çözüm bir hacmi ile elde edilen hücre süspansiyon, bir birimi birleştirmek ve 2 mL aliquots steril dondurma şişeleri içinde dağıtabilirsiniz. Mağaza-80 ° C’de MBR ekimi ProtokolüNot: Bu istihdam BioLector MBR sistem GFP floresan ve ışık dağınık çalışma, (biyokütle) atanmış belirli bir kazanç değer gerek yoğunluk ölçümleri içindir. Daha yüksek kazanç yüksek optik sinyal güçlendirilmiş; Bu da neden dağınık ışık ve floresan rasgele birimleri (yapıyordum) cinsinden ölçülür. Biyokütle ve uygun frekans sallayarak ve daha sonra işlem aşamalarında yüksek biyokütle konsantrasyonlarda oksijen sınırlama önlemek için birim doldurma ile birlikte ön deneylerde, GFP algılama için uygun kazanç değerlerini belirler. İstihdam yetiştirme koşulları (“Flowerplates”, çiçek şeklindeki 48-şey MTPs frekans, 1200 rpm, sallayarak 1000 µL, 10 g/M glikoz ana karbon kaynağı olarak hacmi doldurma, Yani,) sağlamıştır oksijen sınırsız arazisi. Birimleri doldurma ve frekansları 48-şey MTPs çiçek şeklindeki sallayarak diğer kombinasyonları kaynaklanan maksimum oksijen aktarım hızları için veri sayfaları tedarikçiden mevcuttur. Ayrıca, büyüme kusurları bireysel kültürlerin ikincil yüzeylerde (örneğin, azot, eser elementler) düşük miktarda nedeniyle oluşabilir. Bu nedenle, biyokütle konsantrasyonu arazisi sonunda kontrol edin. Bu çalışmada, böyle bir büyüme etkileri tespit edildi. MBR sistemi (“BioLector”) için yetiştirme iletişim kuralı aşağıdaki gibi tanımlayın: Filterset 1: Biyokütle, 14 kazanç. Filterset 2: pH, kazanç önceden ayarlanmış. Filterset 3: pO2, kazanç önceden ayarlanmış. 4: GFP, 80 kazanmak. Frekans sallayarak: 1200 devir/dakika. Sıcaklık: 30 ° c Döngü süresi: 15 dak. Deneme süresi: Manuel (ekimi değil durdurulacak otomatik olarak). Nesil orta hisse senedi çözüm pipetting listesiNot: robot sistem işleme neredeyse herhangi bir sıvı pipetting eylemleri harici dosyalardan okumak yeteneğine sahiptir. Basitçe söylemek gerekirse, gerekli olan bilgiler transfer hacmi ve reaktif kaynak konumunu yanı sıra, her robot güverte ve belirli bir boşluk içinde aygıtlar aygıtlar konumuna gösterdiği hedef var. Ancak, farklı sözdizimleri için farklı sıvı işleme sistemlerini dikkate alınmalıdır. Şekil 2 bu çalışmada istihdam pipetting sistem bir örnek dosya yapısını gösterir. Dört tür stok çözümler her ekimi de pipetted: Stok medya bileşenleri Çözümleri (“Varyasyon hisse senetleri”) farklı. Telafi etmek için hisse senetleri üzerinde farklı toplu miktarlarda su. Giderilen tüm bileşenleri içeren bir hisse senedi çözüm (“Dinlenme hisse senedi”). Bu hisse senedi çözüm farklı içeren stokları oluşan bileşenler, farklı sıcaklıklarda saklanır ya da farklı yöntemlerle sterilize örneğin,. İnoculum, son bileşeni olarak eklendi ve sadece ek hücreleri yerleşme önlemek için önce worktable üzerine koymak. Ekimi, tüm ortam bileşenleri göre transfer birimleri hesaplamak: Bazı Varyasyon stokları belki eklenecek birimin sıfır, Yani, bu bileşeni özellikle boş bırakılırsa. Tüm hesaplanan birimleri Vben uygun numaraları için değiştirin. Pipetting birim artışlarla birim adımları çok küçük olmamalıdır. Gerekirse, Varyasyon stoklarıkonsantrasyonları ayarlayın. Örneğin, en az pipetting ses burada 10 µL tanımlanmıştır ve en az artış 5 µL tanımlanmıştır. Genel olarak, bu birimlere bağlı olarak deneysel olarak kararlı hassasiyet ve doğruluk istasyonu15,44işleme kullanılan sıvı için tanımlanmalıdır. Aşağıdaki gibi bütün kuyuları için sabit bileşen içeren Diğer stok hacmi hesaplamak: nerede Varyasyon stokunun maksimum toplu ses kullanılır. Sonuç olarak, Geri kalan stok sabit bileşenler gerekli konsantrasyonları aşağıdaki gibi hesaplar: Geri kalan stok buna göre hazırlayın. Ekimi için de, aşağıdaki gibi eklenecek su hacmi hesaplamak: Yetiştirme iyi, ek olarak aşağıdaki sırada eklenecek tüm birimleri listesi: VH2O, VRestStock, Vben, VInok. Pipetting listenin istasyonu, işleme sıvı belirtimlerine göre Şekil 2bir örnekte gösterildiği gibi biçimlendirin. Tohum kültür, otomatik ortam hazırlama ve başlangıç ana kültür Sıvı işleme robot için bir iletişim kuralı oluşturun. Karşılık gelen “WinPREP” Yazılımda uygulanan bir “Janus” sistem için bir örnek iletişim kuralı için bkz: şekil 3 ve şekil 4 . İletişim kuralı aşağıdaki yönleri dikkate almanız gerekir: Yeterli bir çalışma zamanı ortamı hazırlama önce steril konut bulunmaktadır. Bir ilk aşırı temizlik ve çamaşır tüm pipetting ipuçları ve tüp içerir. Uygun aygıtlar kapsayıcılar hisse senedi çözümleri için seçin. Burada, derin kuyu pilakalar ve 12 sütunu tüm sekiz pipetting ipuçları iyi sütunlara paralel bir düzenleme sokabilirsin Varyasyon hisse senetleri, depolanması için uygun şunlardır. Bu büyük ölçüde medyası hazırlama kadar hızlandırır. 15 mL veya 50 mL reaktif tüpler rezervuar kullanılırsa, tek bir pipetting uç içine hemen sokabilirsin.Daha yüksek birimleri toplam hisse senedi bu çözümler gerektirir gibi su ve Diğer hisse senedigibi diğer hisse senetleri için 100 mL tekneler, kullanılır. Atık birimleri, yükseklik pipetting uzaklıklar, vb için telafi etmek hisse senedi her çözüm için yeterli bir Toplam hacim sağlar Kullanıcı istemi aşı adım bu adımı tohum kültür yordam hemen önce yürütülen sağlanması önce ekleyin. Tüm hisse senedi çözümler bir steril şekilde ve mağaza kadar kullanımda uygun kaplar, örneğin, steril 15 mL ve 50 mL test tüpleri hazır olun. Derin kuyu plakalar için bir worktable, örneğin, hisse senedi çözüm depolama % 70 etanol ve sonraki laminar akış mahallede kurutma ile silerek sterilize. Tohum kültür 50 mL BHI orta WCB gelen bir aliquot ile 25 mg/L sefaloridin içeren aşı başlatın. MBR ekimi önce katlanarak büyüyen tohum kültürlerde yeterli miktarda taze, hayati inoculum hazırlayın. Tüm gerekli aygıtlar üzerinde robot worktable yerleştirin ve hisse senedi çözümleri ilgili aygıtlar dökün. Böylece son adım (aşı), ulaşıldığında tohum kültür başlangıcı ile zamanında medyası hazırlama için robot iş akışı başlatın. Robot iş akışının toplam çalışma zamanı daha önce değerlendirilecek gerekir. Toplam çalışma süresi yaklaşık 1,5 saat buradaydı. Yaklaşık 2 saat sonra büyüme optik yoğunluk (OD600) izlemek için her saat sonra tohum kültür örnek. Yaklaşık 5 h sonra kültür 3-4 OD600 ulaşır ve ana kültürü aşılamak için kullanılır. Tohum kültür sıvı işleyicisi worktable yerleştirin ve medya hazırlık Protokolü devam. Ekimi MTP aşı sonra kapatın. BioLector aygıtı kapalı ekimi MTP yerleştirin ve önceden tanımlanmış ekimi protokol başlayın. Kalan stok çözümleri, Biyogüvenlik düzenlemelere göre gerekirse atmayın ve robotik worktable kültüründen temel olarak belirler. Yeniden kullanılabilir aygıtlar temiz ve sıvı işleyicisi dekontaminasyon protokol başlayın. Ürün miktar ve ham veri analizi için ön işleme Ana kültür sonra 17 h çalışma zamanı durdurmak. Ölçüm veri BioLector MBR cihazdan üreticinin kullanım kılavuzuna göre BioLection yazılım paketini kullanarak bağlı bilgisayara aktarma. Kullanım “veri yönetimi → dönüştürmek veri” fonksiyonu “BioLection” yazılım paketinin MBR ham veri dosyasını bir kolay erişim elektronik tablo biçimine dönüştürme sisteme eşlik eder. GFP sinyal veri tüm yetiştirme kuyuları için 17 h. başvuru ekimi wells ve ortalama GFP sinyalleri tespit için en yakın zaman damgası sütun kopyalayın. Tüm kalan GFP sinyal ortalama başvuru sinyal ile normalleştirmek. (Eğer gerekli) ek yöntemlerle GFP titresi ölçmek Hücre süspansiyonlar tüm yetiştirme kuyulardan prelabeled reaksiyon tüpler içine aktarmak ve boş hücre süpernatant Santrifüjü benchtop santrifüj kullanarak maksimum hızda 10 dk sonra elde edilir. Şeffaf alt ile siyah bir 96-şey MTP içine, her boş hücre süpernatant 200 µL transfer ve GFP belirli Floresans 488/520, okumak bir uygun Mikroplaka okuyucu kullanarak nm. Adım 1.5.3 olduğu gibi başvuru arazisi üzerinden ortalama sinyali ile bütün kuyulardan GFP sinyal normalleştirmek.Not: Mutlak GFP Floresans sinyalleri farklı ölçüm cihazları için karşılaştırılamaz. Bu nedenle, tüm ana arazisi üzerinden 5 başvuru suşları bir iç standart olarak hizmet vermektedir. GFP titresi geliştirilmesi ile ilgili olarak dahili standart ifade edilebilir. Bu karşılaştırma sonuçları farklı deneyler ve farklı GFP miktar yöntemleri (sonraki iki adımı görmek) sağlar. Boş hücre supernatants standart protokolleri, örneğin, Bradford veya BCA tahlil ile protein içeriği belirleyin. Adım 2 sonuçları ile birlikte, bir protein belirli GFP titresi belirlenmesi mümkündür.Not: örnek doğrudan doğruya–dan bu Mikroplaka Floresans ölçüm sonra kullanın. Çok kanallı Pipetler kullanımı büyük adımlar işleme gerekli sıvı kolaylaştırır. SDS-sayfa görselleştirme gerçekleştirmek boş hücre supernatants artış protein içeriği çoğu doğrulamak için standart protokolleri takip artan GFP salgılanması nedeniyle olduğunu.Not: SDS-sayfa özellikle yüksek örnek yük ile yukarıda belirtilen yöntemlere göre daha zahmetli. Doğrulama amacıyla, SDS-sayfaları boş hücre supernatants orta ve son başvurusundan orta arazisi15optimize çalıştırmak yeterlidir. 2. hassasiyet analizi (şekil 1: Bölüm B). Not: Bu bölümü amacı amacı üzerinde önemli bir etkisi önemli faktörlerin belirlemektir. Ortam bileşenleri bir ilk konsantrasyon aralığı seçin. Başvuru orta kompozisyon içinde seçilen konsantrasyon aralıkları yalan söylemeliyim. Uygun bir DOE seçin. Böyle tasarımlar edebiyat, örneğin, NIST/SEMATECH e Handbook istatistiksel yöntemleri (www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm) üzerinden bulunabilir. Seçilen tasarım ortam bileşenleri ilgi sayısına bağlıdır (burada, 11) ve gerçekleştirilen deneyler sayısı (burada, 32). Verilen örnekte, bu 32 deneylerde neden olur ve tahmini bir onbir bileşenleri konsantrasyonu faiz amacı üzerinde artan etkisi sağlar tasarım “2IV11-6” seçildi. Daha açık olmak gerekirse, ana etkileri pair-wise faktörü etkileşim ile şaşırmış değil. Onlar-ebilmek var olmak daha yüksek sipariş etkileşimleri ile şaşırmış olan, ancak, en olası değil önemli. Kalan wells kullanın (burada, 16) işleminin tekrarlanabilirlik değerlendirmek için başvuru orta ile birden fazla çoğaltır gerçekleştirmek için. Çoğaltır eşit konuma göre etkileri keşfetmek için plaka üzerinde yaymak. Ortalama değer referans deneyler ölçülen çıkışının normalleştirme için kullanılır. Diğer bir deyişle, duyarlılık analizi ölçülen her çıktı başvuru çıkış ortalama değeri tarafından ayrılmıştır. Ana hesaplamak ve mümkünse Kombinatorik efektleri kullanarak uygun istatistik yazılım. Deney klasik tasarım polinom yaklaşık45üzerinde temel alır. Örneğin, MATLAB işlevi mvregress polinom katsayıları tahmin için kullanılabilir.Mvregress işlevi istatistik ve makine araç öğrenme parçasıdır. Ttesti kullanılarak amaç ilgili çeşitli ortam bileşenleri etkilerini belirlemek. Örneğin, NH4+ önemli olumsuz etkisi vardır ve Ca2 + ve Mg2 + en güçlü olumlu etkileri (şekil 5) gösterir. GFP sinyal normalleştirilmiş çünkü katsayıları Merkezi değerinden belirli bir bileşenini konsantrasyonu artan zaman ortalama göreceli değişiklik GFP sinyalinde temsil , en yüksek değeri. Sabit ilgili bir etkisi olmadan onların referans değeri en iyileştirme sırasında bileşenleridir. 3. yinelemeli optimizasyonu (şekil 1: bölüm C) Not: MATLAB aracın KriKit yorumu ve istatistiksel veri analizi36için kullanıldı. KriKit verilere Kriging modeli oluşturmak kullanıcı sağlar. Ortam bileşenleri ve amaç fonksiyonel ilişkisi bu Kriging modeli öngörür. Tahmin belirsizlik bilgi de sağlar. Yüksek belirsizlik gürültülü veri ve/veya yetersiz veri yoğunluğu gösterir. DOENot: Yeni deneyler yinelemeli olarak, önceki çalışma sonuçlarına göre tasarlanmıştır. İlk yineleme içinde tanımlanan medya bileşenleri ilgi ayrıntılı incelenmesi için yeni deney tasarlayın. İlgili etkisi olmayan bileşenler konsantrasyonları şimdi ilgili referans değeri sabit olarak bölüm 2 deneysel sonuçlar yinelemeli optimizasyonu (Bölüm 3), transfer edilemez. Sonuç olarak, duyarlılık analizi ve yinelemeli optimizasyonu deneylerden karşılaştırılabilir değildir. Aksi takdirde, şekil 1’ de, kare “Yinelemeli optimizasyonu” Resimli düzeni uygulayın. Eğer potansiyel en iyi tanımlanmış konsantrasyon aralığı içinde yatıyor, yeni deneyler beklenen geliştirme40,46kullanarak tasarlanmıştır. Beklenen geliştirme üzerinde dayalı deneysel tasarım KriKit araç kutusunda entegre edilmiştir. Optimum sınırında yatıyor, konsantrasyon aralığı genişletin. Bölüm 2’de tanımlanan deneysel yöntemleri göre tasarlanmış örnek noktalarda deneyler yapmak. İstatistiksel analiz Geçerli de dahil olmak üzere tüm yinelemeler üzerinden birleştirilmiş verileri kullanarak Kriging modeli oluşturun. Modeli çıktı KriKit (2/3D ilişkilendirme, film analizi, eleme arsa, vb) kapsamlı araçlarını kullanarak görselleştirme tarafından araştırmak. En uygun bir alanda yeterli doğrulukta tahmin edilmiştir, en iyi duruma getirme durdurmak. Eğer değilse, 3.1 adımıyla devam edin.Not: Şekil 6 test çalışması için yinelemeli optimizasyon göstermektedir. Bir plato (Yineleme 1-6) bulana konsantrasyon aralığı başarıyla genişletildi. Yedinci yineleme daha ayrıntılı sınırlarını keşfetmek için kullanıldı. 4. sonuçları doğrulanması (şekil 1: Bölüm D) Not: yinelemeli optimizasyonu bitirdikten sonra ilk varsayımlar geçerliliği kontrol gerekir. Duyarlılık analizi (Bölüm 2) için en iyi orta kompozisyon tekrar yapın. Diğer bir deyişle, şekil 1 ‘ de (bölüm C) incelenmiştir bileşenleri konsantrasyonları en uygun değerlerine sabitlenir. Diğer bileşenler konsantrasyonları göre uygun bir DOE çeşitlidir.Not: Her iki gösterimleri benzer sonuçlar incelenen bileşenlerin konsantrasyon düzeyleri etkisi diğer bileşenlerinin değiştirmeyin belirtir. Tarama sonuçları önemli farklılıklar bölümünden B gösteriyorsa, bileşenlerle değiştirilen bir etkisi incelenen bileşenleri havuzuna eklenmelidir ve C parçasını yinelenmelidir. Dolaylı ölçümü söz konusu olduğunda (örneğin, Floresans ürün konsantrasyon için göstergesi olarak), ortogonal ölçüm yaklaşımları (örneğin, faaliyet tahlil, Bradford veya BCA protein miktar, SDS sayfa) değişikliği onaylamak için geçerlidir faiz karşılaştırma referans orta ve en iyi duruma getirilmiş orta15-den sonuçlanmak tarafından amacı.

Representative Results

Salgılanan GFP titresi en üst düzeye çıkarma tanıtılan Protokolü uygulandı. 17 h ekiminin en iyi duruma getirme amacı seçildi sonra özellikle, GFP titresi. GFP tespiti Online Floresans basit ürün miktar izin. Ancak, GFP sinyal bir başvuru işleme alınan verilerle normalleştirme tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilir sonuçlar sağlamak için vazgeçilmezdir. Ortam bileşenleri bir ön seçim Bölüm 1’de açıklanan bir rasyonel olarak gerçekleştirildi. Deneyler gerçekleştirilen Bölüm 1 talimatları: ıslak laboratuvar yordamlar parametrelerini tutarlılık ve tekrarlanabilirlik sonuçlarının tüm çalışma için tanımlı değil. Bölüm 2’de anlatıldığı gibi bir başlangıç tarama daha fazla, daha ayrıntılı çalışma için en iyi duruma getirme amacı üzerinde önemli bir etkiye gösterilen ilgili bileşenleri tanımlamak için gerçekleştirildi. MBR MTP tabanlı sistem paralel olarak gerçekleştirilecek 48 deneyler sağlar. Bir MTP (48) üzerinde paralel deneyler mümkün olan maksimum sayıda ve ortam bileşenleri (11) yapar 2IVtoplam sayısı dikkate alınarak11-6 kesirli tasarım uygun bir seçim. Bu deneysel tasarım 32 deneyler oluşur ve incelenen medya bileşenlerinin her biri için temel etkisi tahmin sağlar. Kalan ekimi wells (16) başvuru orta ile deneyler birden çok çoğaltır tekrarlanabilirlik ve konumsal etkileri değerlendirmek için kullanılan. Diğer bir deyişle, her deney bir kez yapılır (hiçbir çoğaltır), hariç başvuru deneme (beş çoğaltır). Tablo 1 tarama analizi sonuçlarını özetler. Kabul konsantrasyon aralığında, ortam bileşenleri çoğunluğu değişen amaç üzerinde belirgin bir etkisi yoktu. CA2 + ve Mg2 + en güçlü pozitif eğilimi gösterirken bileşen NH4+ güçlü bir negatif etki gösterir. Etkisi Mg2 + geçerli konsantrasyon aralığı için önemli olmayan ancak daha geniş bir konsantrasyon aralığı için olabilir. Sonuç olarak, NH4+ orta üzerinden atlamak için ve Ca2 + ve Mg2 + daha fazla deneylerde etkisini araştırmak için karar verildi. Bölüm 3 GFP Floresans sinyal Ca2 + ve Mg2 +konsantrasyonları değişen sırasında en üst düzeye çıkarma için kullanılan yinelemeli en iyi duruma getirme yordamı açıklar. Yineleme 1, NH4+ atlanabilir hipotez test edildi. Ca2 + ve Mg2 + için konsantrasyon aralığı tarama analizinden kabul edilmiştir. NH4+ en düşük konsantrasyon sıfır olarak ayarlayın ve maksimum konsantrasyon tarama deneyden kabul edildi. Aşağıdaki denemelerinde bileşen konsantrasyonları üzerinde 3 x 3 x 3 ızgara 27 deneyler sonucunda tanımlanmış konsantrasyon aralığı içinde dağıtıldı. Tüm arazisi sırasında başvuru orta beş çoğaltır, içerdiği iç standart olarak ve MTP üzerinde konumsal hiçbir etkisi oluştuğunu emin olmak için hangi servis edilir. Kalan 16 kuyular için NH4+, Ca2 +ve Mg2 + konsantrasyonları belirli aralıkları içinde rastgele dağıtıldı. Şekil 5 A ilk yineleme sonuçlarını görüntüler. Eksen etiketlerini bakın orijinal başvuru ortamda kullanılan bileşen konsantrasyonları Ref x tarafından belirtilen. Mavi yüzeyler KriKit yazılımı kullanılarak hesaplanan Kriging ilişkilendirmeye temsil eder. Her yüzey NH4+ için bir göreli yoğunlaşmasını düzeyi ile ilişkilidir (koyu mavi: 0 damalı hakem, x: 1 x hakem, açık mavi: 2 Ref x). Bu görsel temsili NH4+atlamak için olumlu olduğunu ortaya koymaktadır. İlişkilendirme yüzeyler Mg2 + ve hem Ca2 +, olumlu etkileri artan konsantrasyonları ile tüm uçaklar artış olarak da göster. Yineleme 1 sonuçlarına göre bu konsantrasyon aralığı Ca2 + ve Mg2 + en yüksek konsantrasyonları ikiye katlayarak genişletmek ve deneysel tasarım penceresinin sağ üst köşesinde, değişen şekil 5 görmek için karar verildi B. içindeki bu aralıkta, 6 x 6 kılavuz üzerinde konsantrasyonları dağıtıldı. Bu tam konsantrasyon aralığında en iyi Kriging ilişkilendirme sonuçlar için önde gelen bir hatta dağıtım sağlar. Şekil 5 B gösterir Kriging ilişkilendirme Arsa olarak birleştirilmiş verileri üzerinde her iki yineleme (kırmızı noktalar ve sarı kareler) ölçülür. Her ikisi için Ca2 + ve Mg2 +, onların konsantrasyonlarının artması olumlu etkisi devam eder. Sonuç olarak, yordamı maksimum konsantrasyon ikiye katlayarak tekrar edilmiş ve böylece, deneysel tasarım penceresinin sağ üst köşesinde sınırlarını keşfetmek için taşındı. Şekil 6 A kalan en iyi duruma getirme yordamı genel bir bakış verir. Yineleme 3 kadar toplanan veri küme analizi bir sınırlama Mg2 +, Yani, bir en iyi konsantrasyon aralığı Mg2 + pozitif etkisi tespit edilmiştir ortaya koydu. Bu nedenle sadece için Ca2 + (yineleme 4) konsantrasyon aralığı daha da genişletmeye karar verildi. Bu yordamı iki kez tekrarlandı (yineleme 5 ve 6) bir doygunluk GFP sinyal bulana. Bu doygunluk Ca-tuzu yağış, Ca2 +, hücrelere bulunmayan uygulanan konsantrasyonlarının için tarafından açıklanmıştır. Deneysel sonuçlar her zaman gürültü ile tedirgin, elde edilen Kriging ilişkilendirme düzensiz görünür ve görsel denetleme yanlış sonuçlara neden olabilir. Ancak, ortam bileşenleri doymuş GFP sinyal için en iyi konsantrasyon aralığı da KriKit içinde uygulanan istatistiksel z -testi ile güvenilir bir şekilde tanımlanabilir. Z -test doğrudan Kriging yöntemi, Yani, tahmin değerleri ve tahmin belirsizlikler tarafından sağlanan iç istatistik bilgilerini kullanır. Şekil 6 B kararlı ve görüntülenmeyecektir KriKit araç olarak tanımlanan Plato gösterir.KriKit araç serbestçe kullanılabilir36 ve özellikleri kullanımını açıklar detaylı bir öğretici ile birlikte gelir. İkiden fazla ilgili bileşenleri bulunursa, 3D görselleştirme sınırına ulaşır. KriKit film ya da “arsa eleme” gibi çeşitli diğer olası görsel temsili yöntemler sağlar. Eğer potansiyel en iyi tanımlanmış konsantrasyon aralığı içinde yatıyor, yeni deneyler beklenen geliştirme40,46kullanarak otomatik olarak tasarlanmıştır. Beklenen geliştirme üzerinde dayalı deneysel tasarım KriKit araç kutusunda entegre edilmiştir. Daha ayrıntılı bilgi yazılım belgelerinde bulunabilir. Yinelemeli işlem sonrası, bir doğrulama sonuçları, bölüm D’de açıklandığı gibi yapılmıştır İlk varsayımlar geçerliliğini en iyi orta kompozisyon kullanarak ek duyarlılık analizi gerçekleştirerek kontrol edildi. Yani, tüm ilk ortam bileşenleri ilgi çeşitli ama Ca2 + ve Mg2 + onların en iyi konsantrasyon seviyeleri için kuruldu. Bu çalışmada en yüksek konsantrasyonları = 32 x Ref ve = 6.8 x Ref seçildi. Tablo 2 doğrulama tarama sonuçlarını gösterir. (Bkz. Tablo 1), NH eleme ilk duyarlılık benzer4+ hala önemli bir olumsuz etkiye sahiptir ve kalan etkileri hala yok denecek kadar azdır. Kolay erişim nedeniyle ekimi süspansiyon GFP Floresans sinyalini ekstraselüler GFP titresi tüm deneyler sırasında ölçmek için kullanıldı. Doğrulama nedeniyle, GFP Floresans diğer ölçümler karşı doğrulandı. GFP Tat-yolu salgılanan, Floresans sinyal içi ve hücre dışı GFP arasında ayırımcılık değil. Böylece, arazisi başvuru orta ve en iyi duruma getirilmiş orta kullanarak çoğaltılamaz. Boş hücre ekimi supernatants floresan ölçüm yanı sıra, Bradford tahlil ve (yarı) tarafından protein içeriği sayısal-nitel GFP iyileştirme SDS-sayfa15tarafından görüntülenmiştir. Tüm elde edilen ölçüm sinyalleri yaklaşık iki katına arazisi için başvuru Orta olarak karşılaştırıldığında ve doğrulanmış en iyi duruma getirilmiş orta ile yaklaşık % 100 iyileşme salgı performansı en iyi duruma getirilmiş orta. Sonuç olarak, GFP belirli Floresans ekimi süspansiyon, en iyi duruma getirme amacı, Yani, hücre dışı GFP titresi için uygun bir ölçü kabul edilebilir. Resim 2 : Screenshot duyarlılık analizi için birim pipetting listeden. İlk sütundaki girdiler bir satır tüm birimleri için benzersiz bir tanımlayıcı ata; MTP de sıvı işleyicisi bkz. şekil 4Cworktable üzerinde hedef ekimi MTP sayısı tanımlayıcısıdır. Kalan sütunları birimleri için farklı çözümler (“Sln-01” için “Sln-15”) pipetted için kodlayın. Bir satır toplu hacmi de buna karşılık gelen son ekimi birime karşılık gelen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Kontrol yazılımı “WinPREP” işleme sıvı ekran. Sol: bir aktarım komutu pipetted stok her çözüm için de dahil olmak üzere satır sipariş komutları. Daha önce son komutu inoculum ek için bir kullanıcı istemi tohum kültür masada tam zamanında yerleştirilir sağlamak için eklenir. Sağ: Kaynak aygıtlar varyasyon stokları (12 sütun benzeri wells ile iki derin kuyu tabak), reaktif yalak için dinlenme hisse senedi, su ve inoculum ve medya hazırlık hedef ekimi MTP dahil worktable, şeması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : Hisse senedi bir çözüm pipetting, kurulum için detaylı ekran görüntüleri derlenmesi. (A)Fe stokunun pipetting için komut açalım. İçinde kaynak aygıtlar ve kaynak iyi worktable üzerinde okuma çerçeve ve kırmızı sütun karşılık gelen derin kuyu plaka tarafından işaretlenir. Hedef aygıtlar ve hedef kuyu içinde etrafında mavi çerçeve ve hedef ekiminin MTP mavi wells tarafından işaretlenir. (B) detaylı örnek görünüm için bu adımı (Fe stok çözelti) pipetting birimlerin atamasında. 48 satır olan pipetting listeden okunan yerler sayısı. Besleme birimleri Fe hisse senedi çözüm için tüm hedef kuyuları için sütun 4 pipetting listesinde bulunur. Pipetting listedeki ilk sütun tanımlayıcıları ve transfer edilebilir, bkz: Şekil 2için birimlere içerdiğini unutmayın. (C) Ayrıntılar hedef Eh numaralandırma. #1 vb. işaretlenmiş kuyuya satır #1 karşılık gelen pipetting listesi yazılı birimleri pipetted. Wells #01, #08, #41 ve #48 karşılık gelir wells A01, A08, F01 ve F08 alfa-sayısal kodlama için hangi Ayrıca ekimi MTP kendisi yazdırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5 : Ayrıntılı ilk yineleme sonuçlarından. (A)Kriging ilişkilendirme Yineleme 1 deneysel verilere dayalı. Kırmızı noktalar onların veri kümesi gösteriyor. Karşılaştırma için tüm üç ilişkilendirme yüzeyleri bir mezarlığına yerleştirilmiştir (koyu mavi: 0 damalı hakem, x: 1 x hakem, açık mavi: 2 Ref x). Sonuçları bir alternatif temsil başka bir yerde15bulunabilir. (B) üzerinde deneyler dayalı Kriging ilişkilendirme gerçekleştirilen Yineleme 1 (kırmızı nokta) ve Yineleme 2 (sarı kareler).Bu şekilde sunulan veri bölümlerini önceden yayınlanmış15olmuştur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6 : Yinelemeli olarak toplanan optimizasyon sonuçları tasviri. (A)son Kriging tahmin modeli. (B) en uygun alan (kırmızı) istatistiksel tanımlaması tabanlı üzerinde istatistiksel z-testi, hangi KriKit tarafından sağlanır. Kutuları birbirini izleyen adımları yinelemeli tasarım ve yürütme deneyler gösterir. Bu şekilde sunulan veri bölümlerini önceden yayınlanmış15olmuştur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Bileşen Normalleştirilmiş katsayısı ortalama değeri Fe2 + -0.08 MN2 + -0.05 Zn2 + -0.21 Cu2 + -0.21 NH4+ -2.04 Ni2 + -0.11 Co2 + -0.10 MoO42- 0.03 BO33- 0,06 CA2 + 1,00 MG2 + 0,45 Tablo 1: duyarlılık analizi sonuçlarını. Katsayısı değerleri ortalama etkisi maksimum değerine ilgili medya bileşeni konsantrasyon Merkezi değerinden artan zaman temsil eden. En iyi deneysel tasarımlar için gibi standart literatürde buldu ve burada, standart sapmayı temsil kullanılan doğrudan referans deney çoğaltılması nedeniyle deneysel varyasyon. Katsayısı değerleri maxium değeri (için bileşeni Ca2 +0.0422) tarafından normalleştirilmiş. Normalleştirilmiş ve mutlak katsayısı standart sapma 0.54 ve 0.0226, anılan sıraya göre. Bileşen Normalleştirilmiş katsayısı ortalama değeri Fe2 + -1.00 MN2 + 1,00 Zn2 + -3.48 Cu2 + -0.52 NH4+ -15.95 Ni2 + 0,69 Co2 + -0.51 MoO42- -0.45 BO33- -1.11 Tablo 2: son duyarlılık analizi sonuçlarını. Katsayısı değerleri ortalama etkisi maksimum değerine ilgili medya bileşeni konsantrasyon Merkezi değerinden artan zaman temsil eden. İsteğe bağlı bir deneysel tasarım kullanılan gibi standart sapma sadece en iyi duruma getirilmiş orta kompozisyon kullanarak deneysel varyasyonu bağlıdır. Deneysel varyasyon başvuru orta kullanarak varyasyon ile karşılaştırıldığında biraz arttı. Katsayısı değerleri maxium değeri (için bileşen Mn2 +0.0106) tarafından normalleştirilmiş. Normalleştirilmiş ve mutlak katsayısı standart sapma 3.63 ve 0.0385, anılan sıraya göre.

Discussion

Çeşitli adaptasyonlar, diğer mikrobiyal ifade ana bilgisayarları⁹^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^, çalışmak için örneğin, sunulan genel doğası sağlar ⁵¹, veya diğer özellikleri hedef proteinin glikozilasyon desen veya disülfür bağları gibi optimize etmek için. Protokolü de kullanılabilir laboratuar ekipmanları için adapte gerekebilir. Zamanında büyük tasarruf sağlayan deneysel işlem hacmi, artan bir MBR sistem entegrasyonu sağlar. Ancak, tam olarak belgelenmiş ve kontrol edilebilir Biyoreaktörler MBR sistemleri tarafından değiştirirken,⁸^,³⁷^,⁵²^,⁵³ölçeklenebilirlik sonuçlarının düşünülmelidir. DOE Metodolojisi ve matematiksel modelleme kullanımını verimli deneysel planlama ve veri modeli tabanlı yorumu¹⁵tarafından ölçüm veri okudu objektif⁵⁴ ile ilgili bilgi içeriği en üst düzeye çıkarmak için yardımcı olur.

Yöntemine yapılan değişiklikler
İşleme sistemlerini gibi bu çalışmada kullanılan bir çok amaçlı ve Genişletilebilir robot sıvı yanında, birkaç küçük sıvı işleme sistemlerini piyasada bulunan bu görevi gerçekleştirmek yeteneğine sahiptir ve içine yerleştirilen vardır belirtilmelidir laminar akım çalışma tezgahları. Hiçbir otomatik pipetting sistemi varsa, farklı medya besteleri DOE planına göre tek ve/veya çok kanallı Pipetler kullanarak el ile pipetting tarafından da gerçekleştirilebilir. El ile hazırlık hataya daha ve çok odaklı iş oldukça uzun bir süre için gerektirecektir olduğundan daha düşük bir sayı farklı medya kompozisyon hazırlamak için önerilir.

İstihdam MBR sistem özelliklerine bağlı olarak, ilgili ekimi iletişim kuralı değişir. Örneğin, herhangi bir online ölçü biyokütle oluşumu varsa, biyokütle konsantrasyonu büyüme deney tamamlanmasından sonra ölçmek yeterli olabilir. Online izleme ile birlikte pH ve birkaç MBR sistemlerinde uygulanır, çözünmüş oksijen büyüme doygunluk güvenli bir şekilde tespit edilebilir. Prensip olarak, yalnız İnkübatörler, MBR sistemi kullanmaya gerek kalmadan sallayarak içine yerleştirilen MTPs içinde büyüme deneyler yapılabilir. Bu durumda, uygun yetiştirme koşulları sağlanmış olur zorunda: (1) oksijen sınırlı arazisi kaçınılması MTPs uygun frekansları sallayarak ve sallayarak çapları, örneğin, 96 veya derin 24 kare ile birlikte uygun geometrileri ile kullanarak iyi tabak 1000 devirde 3 mm atmak veya 250 devir / dakikada 25 mm atmak, sırasıyla işletilmektedir. Önemlisi, düşük ulaşılabilir maksimal oksijen transfer oranları, alt ana karbon kaynağı konsantre olmalıdır. Bu çalışmada, yukarıda belirtildiği gibi 10 g/M glikoz kullanımını oksijen sınırlama istihdam yetiştirme koşulları için önlemek uygun; (2) örnekleme biyokütle ve ürün miktar MTP kültürler minimumda azaltılmalıdır. MTP sallayarak kuluçka makinesi kaldırılır her zaman oksijen transfer hemen break-olumsuz yetiştirme koşullarında neden olabilir aşağı; (3) bu cihazlar bu amaçla geliştirilen değil gibi yazarlar görüşüne MTP okuyucular ekimi aygıtları olarak kullanımı tavsiye edilmez. Örneğin, titreyen mekaniği ara sıra Mikroplaka reaktif eklenmesinden sonra karıştırma için inşa edildi ve böylece, genellikle gün boyunca sürekli sallayarak kalıcı uzun ishal için sağlamlık eksikliği. Ayrıca, mikrobiyal arazisi için gereken yeterli güç girişini bu okuyucular fark edemez. Optik yoğunluk okuma entegrasyonu kısa zaman aralıkları gerektirir tekrarlanan oksijen sınırlama dönemlerinde ortaya çıkan sallayarak hareket durdurma. Ayrıca, uzun yetiştirme süreleri üzerinden bu tür sistemlerde buharlaşma sonuçları bozar. Şaşırtıcı karmaşık konu MTPs mikrobiyal arazisi için kullanma hakkında daha fazla ayrıntı için atıf edebiyat²²^,²³^,²⁴^,–²⁵^,^{26 okuyucu denir}ve orada başvuruyor.

Daha fazla dikkat edilmesi gereken noktalar
Hızlandırmak yinelemeli optimizasyonu adımları için bu dikkatli bir şekilde ürün miktar için analitik yöntem seçmek için tavsiye edilir. Yinelemeli deneysel tasarım stratejisi deneysel yanlışlık’in tolerans göstereceği gibi hızlı ve basit yöntemler hassasiyet ve doğruluk, pahasına tercih edilmelidir. Ancak, kesin sonuçları daha karmaşık olabilir yeterince hassas ve doğru ürün miktar yöntemleri karşı kontrol edilmelidir. Genel olarak, dikkatli değerlendirme ve karar verme çalışma prosedürleri hakkında çalışma başlangıcı çaba gerektirir, ama olağan yöntemleri kurduk sonra uzun vadede ödemek.

Karşılaştırıldığında bir başvuru deneyi tüm deneyler için en iyileştirme sırasında tanımlamak için önerilir. Diğer bir deyişle, ölçülen çıkış yanı sıra uygulamalı orta bileşen konsantrasyonları referans değerleri tarafından bölünmesi ile normalleştirilmiş. Bu şekilde, her uygulanmasını ve ölçülen değeri referans değeri x-kat yorumlanabilir. Tabakalar arasında farklılıklar hesap içine almak, beş başvuru deneyler her plaka üzerinde gerçekleştirilir. Ölçülen sonuç ortalama değerini normalleştirme için kullanılır.

Bu genellikle gelişmiş orta aynı zamanda diğer suşlar için en uygun olduğunu garanti edilemez. Ancak, gelişmiş orta büyük ihtimalle de tek amino asit kısaltmaları ile enzim çeşitleri üreten elde zaman mutagenesis çalışmalar () ifade suşları ile küçük genetik farklılıklar, örneğin, yetiştirilmesi için uygun olacaktır Her ne kadar) etkisi hücre metabolizması ve kapaklı ifade performans⁵⁵^,⁵⁶bile tek nokta mutasyonlar açıklanmıştır. Bu durumda, sunulan protokolü protokolleri için yüksek üretilen iş ifade gösterimleri⁵⁷ardından bir ilk adım olabilir. Protokol sonraki ölçek-up için beslenen-toplu arazisi ile orta geliştirme için kullanılırsa, farklı üst microscale kampanyaları eleme clone tanımlandığı şekilde en iyi duruma getirilmiş orta ilgili Biyoproses koşulları için doğrulanması gerekir sanatçılar için farklı beslenme stratejileri ve yetiştirme medya⁵²^,⁵⁸. Ayrıca, tanıtılan KriKit³⁶ genel olarak geliştirilmiş bütünsel Biyoproses optimizasyonu için katkıda bulunabilir.Ancak son zamanlarda, aracı yeteneklerini de çok objektif optimizasyonu⁴⁰, hangi-ebilmek var olmak hem de akış yukarı ve aşağı akım işlemleri⁵⁹^,⁶⁰en iyi duruma getirme için önemli destek uzatılmıştır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bioeconomy bilim merkezi bilimsel faaliyetleri mali NRW-Strategieprojekt BioSC (No. 313/323-400-002 13) çerçevesinde İnovasyon Bakanlığı, bilim ve araştırma tarafından desteklendi. Yazarlar İnovasyon Bakanlığı, bilim ve araştırma Kuzey Ren-Vestfalya ve Heinrich Heine Üniversitesi Düsseldorf Lars Freier CLIB-Graduate küme endüstriyel biyoteknoloji içinde burs için teşekkür ederiz. Daha fazla fon etkinleştirme alanlarda Program “mikrobiyal Biyoproses laboratuvar – A Helmholtz Yenilik Lab” desteklemek için Almanca Helmholtz Derneği “Helmholtz yenilik Labs” alındı.

Materials

BioLector	m2p-labs	G-BL-100
Flowerplate	m2p-labs	MTP-48-BOH	For cultivation in the BioLector device
Sealing foil	m2p-labs	F-GP-10	Sterile sealing for Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	n/a	Freely available, MATLAB installation required
Janus pipetting robot	Perkin Elmer	n/a	Includes "WinPrep" software installation
12-column deep well microplate	E&K Scientific	EK-2034	Container for medium stock solutions
96 well microplates, transparent, F-bottom	Greiner	655101	For Bradford protein assay
µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom	Greiner	655087	For flourescence measurement in cell-free supernatants
Pipette Research plus multi-channel pipettes	Eppendorf	n/a	Facilitates manual liquid handling with microplates
TruPAG Precast Gels	Sigma	PCG2002	For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
Bradford Reagent	Sigma	B6916
C. glutamicum pCGPhoD^Bs-GFP	n/a	n/a	Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

References

Choi, J. -. M., Han, S. -. S., Kim, H. -. S. Industrial applications of enzyme biocatalysis: Current status and future aspects. Biotechnol Adv. 33 (7), 1443-1454 (2015).
Li, S., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., Wang, X. Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), (2012).
Adrio, J. L., Demain, A. L. Microbial enzymes: tools for biotechnological processes. Biomolecules. 4 (1), 117-139 (2014).
Yim, S. S., An, S. J., Kang, M., Lee, J., Jeong, K. J. Isolation of fully synthetic promoters for high-level gene expression in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 2959-2969 (2013).
Hemmerich, J., et al. Use of a Sec signal peptide library from Bacillus subtilis.for the optimization of cutinase secretion in Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 15 (1), 208 (2016).
Wendisch, V. F. Microbial production of amino acids and derived chemicals: synthetic biology approaches to strain development. Curr Opin Biotechnol. 30, 51-58 (2014).
Lee, J. -. Y., Na, Y. -. A., Kim, E., Lee, H. -. S., Kim, P. The Actinobacterium Corynebacterium glutamicum, an Industrial Workhorse. J Microbiol Biotechnol. 26 (5), 807-822 (2016).
Rohe, P., Venkanna, D., Kleine, B., Freudl, R., Oldiges, M. An automated workflow for enhancing microbial bioprocess optimization on a novel microbioreactor platform. Microb Cell Fact. 11 (1), 144 (2012).
Liu, X., et al. Expression of recombinant protein using Corynebacterium glutamicum.: progress, challenges and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 652-664 (2016).
Freudl, R., Burkovski, A. Corynebacterium glutamicum as a Platform Organism for the Secretory Production of Heterologous Proteins. Corynebacterium glutamicum: From systems biology to biotechnological applications. , 161-177 (2015).
Yim, S. S., et al. Development of a new platform for secretory production of recombinant proteins in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 113 (1), 163-172 (2015).
Limberg, M. H., et al. Metabolic profile of 1,5-diaminopentane producing Corynebacterium glutamicum under scale-down conditions: Blueprint for robustness to bioreactor inhomogeneities. Biotechnol Bioeng. 114 (3), 560-575 (2016).
Käβ, F. Assessment of robustness against dissolved oxygen/substrate oscillations for C. glutamicum DM1933 in two-compartment bioreactor. Bioprocess Biosyst Eng. 37 (6), 1151-1162 (2014).
Teramoto, H., Watanabe, K., Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. High yield secretion of heterologous proteins in Corynebacterium glutamicum.using its own Tat-type signal sequence. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 677-687 (2011).
Freier, L., Hemmerich, J., Schöler, K., Wiechert, W., Oldiges, M., von Lieres, E. Framework for Kriging-based iterative experimental analysis and design: Optimization of secretory protein production in Corynebacterium glutamicum. Eng Life Sci. 16 (6), 538-549 (2016).
Huber, R., Roth, S., Rahmen, N., Büchs, J. Utilizing high-throughput experimentation to enhance specific productivity of an E. coli. T7 expression system by phosphate limitation. BMC Biotechnol. 11 (1), 22 (2011).
Kottmeier, K., Müller, C., Huber, R., Büchs, J. Increased product formation induced by a directed secondary substrate limitation in a batch Hansenula polymorpha culture. Appl Microbiol Biotechnol. 86 (1), 93-101 (2010).
Kennedy, M. J., Krouse, D. Strategies for improving fermentation medium performance: A review. J Ind Microbiol Biotechnol. 23 (6), 456-475 (1999).
Kleman, G. L., Strohl, W. R. Developments in high cell density and high productivity microbial fermentation. Curr Opin Biotechnol. 5 (2), 180-186 (1994).
Jones, R., Gadd, G. Ionic nutrition of yeast: Physiological mechanisms involved and implications for biotechnology. Enzy Microb Technol. 12 (6), 402-418 (1990).
Zhang, J., Greasham, R. Chemically defined media for commercial fermentations. Appl Microbiol Biotechnol. 51 (4), 407-421 (1999).
Kensy, F., et al. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates: Determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time measurement during microbial growth. Biotechnol Bioeng. 89 (6), 698-708 (2005).
Hermann, R., Lehmann, M., Büchs, J. Characterization of gas-liquid mass transfer phenomena in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 81 (2), 178-186 (2002).
Duetz, W. A. Microtiter plates as mini-bioreactors: Miniaturization of fermentation methods. Trends Microbiol. 15 (10), 469-475 (2007).
Funke, M., Diederichs, S., Kensy, F., Müller, C., Büchs, J. The baffled microtiter plate: Increased oxygen transfer and improved online monitoring in small scale fermentations. Biotechnol Bioeng. 103 (6), 1118-1128 (2009).
Lattermann, C., Funke, M., Hansen, S., Diederichs, S., Büchs, J. Cross-section perimeter is a suitable parameter to describe the effects of different baffle geometries in shaken microtiter plates. J Biol Eng. 8, 18 (2014).
Samorski, M., Müller-Newen, G., Büchs, J. Quasi-continuous combined scattered light and fluorescence measurements: A novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 92 (1), 61-68 (2005).
Kensy, F., Zang, E., Faulhammer, C., Tan, R. -. K., Büchs, J. Validation of a high-throughput fermentation system based on online monitoring of biomass and fluorescence in continuously shaken microtiter plates. Microb Cell Fact. 8 (1), 31 (2009).
Puskeiler, R., Kaufmann, K., Weuster-Botz, D. Development, parallelization, and automation of a gas-inducing milliliter-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng. 89 (5), 512-523 (2005).
Bareither, R., Pollard, D. A review of advanced small-scale parallel bioreactor technology for accelerated process development: Current state and future need. Biotechnol Prog. 27 (1), 2-14 (2011).
Hortsch, R., Stratmann, A., Weuster-Botz, D. New milliliter-scale stirred tank bioreactors for the cultivation of mycelium forming microorganisms. Biotechnol Bioeng. 106 (3), 443-451 (2010).
Isett, K., George, H., Herber, W., Amanullah, A. Twenty-four-well plate miniature bioreactor high-throughput system: Assessment for microbial cultivations. Biotechnol Bioeng. 98 (5), 1017-1028 (2007).
Motta Dos Santos, L. F., Coutte, F., Ravallec, R., Dhulster, P., Tournier-Couturier, L., Jacques, P. An improvement of surfactin production by B. subtilis BBG131 using design of experiments in microbioreactors and continuous process in bubbleless membrane bioreactor. Bioresour Technol. 218, 944-952 (2016).
Islam, R. S., Tisi, D., Levy, M. S., Lye, G. J. Framework for the Rapid Optimization of Soluble Protein Expression in Escherichia coli Combining Microscale Experiments and Statistical Experimental Design. Biotechnol Prog. 23 (4), 785-793 (2007).
Huber, R., et al. Robo-Lector: A novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb Cell Fact. 8 (1), 42 (2009).
. Kriging toolKit (KriKit) Available from: https://github.com/modsim/KriKit (2017)
Kensy, F., Engelbrecht, C., Büchs, J. Scale-up from microtiter plate to laboratory fermenter: evaluation by online monitoring techniques of growth and protein expression in Escherichia coli.and Hansenula polymorpha fermentations. Microb Cell Fact. 8 (1), 68 (2009).
Lu, C., Bentley, W. E., Rao, G. A high-throughput approach to promoter study using green fluorescent protein. Biotechnol Prog. 20 (6), 1634-1640 (2004).
Zanzotto, A., Boccazzi, P., Gorret, N., van Dyk, T. K., Sinskey, A. J., Jensen, K. F. In situ measurement of bioluminescence and fluorescence in an integrated microbioreactor. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 40-47 (2006).
Freier, L., von Lieres, E. Multi-Objective Global Optimization (MOGO): Algorithm and Case Study in Gradient Elution Chromatography. Biotechnol J. , (2016).
Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum.: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J Bacteriol. 175 (17), 5595-5603 (1993).
Weuster-Botz, D., Kelle, R., Frantzen, M., Wandrey, C. Substrate Controlled Fed-Batch Production of L-Lysine with Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Prog. 13 (4), 387-393 (1997).
Meissner, D., Vollstedt, A., van Dijl, J. M., Freudl, R. Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 76 (3), 633-642 (2007).
Morschett, H., Wiechert, W., Oldiges, M. Automation of a Nile red staining assay enables high throughput quantification of microalgal lipid production. Microb Cell Fact. 15, 34 (2016).
Fisher, R. A. . The design of experiments. , (1935).
Morschett, H., Freier, L., Rohde, J., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. A framework for accelerated phototrophic bioprocess development: Integration of parallelized microscale cultivation, laboratory automation and Kriging-assisted experimental design. Biotechnol Biofuels. 10, 26 (2017).
Le Loir, Y., et al. Protein secretion in Lactococcus lactis: An efficient way to increase the overall heterologous protein production. Microb Cell Fact. 4 (1), 2 (2005).
Anné, J., Vrancken, K., van Mellaert, L., van Impe, J., Bernaerts, K. Protein secretion biotechnology in Gram-positive bacteria with special emphasis on Streptomyces lividans. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1750-1761 (2014).
Gupta, S. K., Shukla, P. Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (6), 1089-1098 (2016).
Fu, L. L., Xu, Z. R., Li, W. F., Shuai, J. B., Lu, P., Hu, C. X. Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: implication for optimization of heterologous protein secretion. Biotechnol Adv. 25 (1), 1-12 (2007).
Yoon, S., Kim, S., Kim, J. Secretory Production of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Rec Pat Biotechnol. 4 (1), 23-29 (2010).
Hemmerich, J., et al. Comprehensive clone screening and evaluation of fed-batch strategies in a microbioreactor and lab scale stirred tank bioreactor system: application on Pichia pastoris producing Rhizopus oryzae lipase. Microb Cell Fact. 13 (1), 36 (2014).
Glazyrina, J., Krause, M., Junne, S., Glauche, F., Strom, D., Neubauer, P. Glucose-limited high cell density cultivations from small to pilot plant scale using an enzyme-controlled glucose delivery system. New Biotechnol. 29 (2), 235-242 (2012).
Gernaey, K. V., et al. Monitoring and control of microbioreactors: An expert opinion on development needs. Biotechnol J. 7 (10), 1308-1314 (2012).
Rahmen, N., Fulton, A., Ihling, N., Magni, M., Jaeger, K. -. E., Büchs, J. Exchange of single amino acids at different positions of a recombinant protein affects metabolic burden in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 14, 10 (2015).
Rahmen, N., et al. A particular silent codon exchange in a recombinant gene greatly influences host cell metabolic activity. Microb Cell Fact. 14, 156 (2015).
Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in E. coli. J Vis Exp. (89), e51464 (2014).
Scheidle, M., et al. High-throughput screening of Hansenula polymorpha clones in the batch compared with the controlled-release fed-batch mode on a small scale. FEMS Yeast Res. 10 (1), 83-92 (2010).
Baumann, P., Bluthardt, N., Renner, S., Burghardt, H., Osberghaus, A., Hubbuch, J. Integrated development of up- and downstream processes supported by the Cherry-Tag™ for real-time tracking of stability and solubility of proteins. J Biotechnol. 200, 27-37 (2015).
Baumann, P., Hahn, T., Hubbuch, J. High-throughput micro-scale cultivations and chromatography modeling: Powerful tools for integrated process development. Biotechnol Bioeng. 112 (10), 2123-2133 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

Automatically Generated