Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Johannes Hemmerich; Lars Freier; Wolfgang Wiechert; Eric von Lieres; Marco Oldiges

doi:10.3791/56234

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Bioengineering

Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

Published: December 15, 2017

doi:

10.3791/56234

Johannes Hemmerich*^1,2, Lars Freier*^1,2, Wolfgang Wiechert^1,2,3, Eric von Lieres^1,2, Marco Oldiges^1,2,4

¹IBG-1: Biotechnology,Forschungszentrum Jülich, ²Research Center Jülich,Bioeconomy Science Center (BioSC), ³Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB),RWTH Aachen University, ⁴Institute for Biotechnology,RWTH Aachen University

Summary

Dieses Manuskript beschreibt einen generischen Ansatz für maßgeschneiderte Gestaltung der mikrobiellen Anbau-Medien. Ermöglicht wird das durch einen iterativen Workflow kombinieren Kriging-basierte experimentelle Design und Microbioreactor Technologie für ausreichend Anbau Durchsatz, gestützt durch Labor-Robotik, Zuverlässigkeit und Schnelligkeit in Flüssigkeit Umgang mit Medien zu erhöhen Vorbereitung.

Abstract

Ein Kerngeschäft in der industriellen Biotechnologie mit mikrobiellen Produktion Zellfabriken ist der iterative Prozess des Stamm-Engineering und Optimierung der Bioprozess-Bedingungen. Ein wichtiger Aspekt ist die Verbesserung der Anbau Mittel um ein optimales Umfeld für mikrobielle Entstehung des Produkts von Interesse. Es wird gut angenommen, dass die Medienkomposition Bioprozess Gesamtleistung erheblich beeinflussen kann. Mittlere Optimierung Ernährung tritt bekanntermaßen rekombinanten Proteins zu verbessern Herstellung mikrobieller Systeme und damit, dies ist ein lohnende Schritt in Bioprozess-Entwicklung. Jedoch sehr oft Standardmedien Rezepte aus Literatur, genommen werden, da maßgeschneiderte Design des Mediums Anbau ist eine mühsame Aufgabe, die Microbioreactor-Technologie für ausreichend Anbau Durchsatz sowie schnelle Produkt-Analysen und Unterstützung verlangt von Labor-Robotik Zuverlässigkeit im Umgang mit Schritte Flüssigkeit zu ermöglichen. Darüber hinaus sind fortschrittliche mathematische Methoden für rational analysieren Messdaten und effiziente Versuchsplanung parallel wie optimale Informationsgehalt zu erreichen.

Die allgemeine Natur des vorliegenden Protokolls ermöglicht einfache Anpassung an verschiedene Laborgeräte, andere Ausdruck Hosts und Zielproteine von Interesse, sowie weitere Bioprozess Parameter. Darüber hinaus können andere Optimierungsziele wie Protein Produktionsrate, spezifische Ertrag und Qualität des Produkts gewählt werden, in den Rahmen der anderen Optimierungsstudien zu passen. Die angewandte Kriging-Toolbox (KriKit) ist ein allgemeines Werkzeug für Design of Experiments (DOE), die zu verbesserten ganzheitliche Bioprozess Optimierung beiträgt. Es unterstützt auch Multi-objektiven Optimierung, die bei der Optimierung von vor- und nachgelagerten Prozesse wichtig sein kann.

Introduction

Moderne rekombinante Gentechnologie ermöglicht die breite Verwendung von technischen Enzymen für verschiedene Anwendungen in der pharmazeutischen Industrie, Tierfütterung, organische Chemie und Lebensmittel-¹^,²^,³. Die Produktion von technischen Enzymen in Großmengen ist ein wichtiges Thema für die industrielle Biotechnologie und für optimierte rekombinante Protein-Produktion, und beide belasten und Bioverfahrenstechnik ist erforderlich. Für die Erzeugung von effizient veränderter Produktionsstämme, verschiedene genetische Bibliotheken stehen zur Verfügung, z.B.für ausgewogene gen Expression⁴ oder vermehrte Ausschüttung Effizienz⁵.

Corynebacterium Glutamicum ist ein bedeutender Hersteller von Aminosäuren im industriellen Maßstab⁶^,⁷ und stellt einen attraktive nichtkonventionellen Ausdruck Host für die sekretorischen Produktion rekombinanter Proteine⁸ ^,⁹. Die allgemeine sekretorischen (Sec) und Twin-Arginin Translokation (Tat) Weg sind in C. Glutamicum und wurden erfolgreich für rekombinantes Protein Sekretion¹⁰angebracht. Umfangreiche Erfahrung in der Bioverfahrenstechnik über Aminosäure-Produktion im industriellen Maßstab sowie die Fähigkeit, Proteine zu g/L beträgt¹¹ und große Robustheit bezüglich Bioprozess Inhomogenitäten in großem Maßstab gefunden absondern Bebauungen¹²^,¹³, stellen C. Glutamicum einen vielversprechende Plattform Organismus für die sekretorischen Produktion von heterologen Proteinen im industriellen Maßstab.

Mittlere Optimierung Ernährung ist bekannt, rekombinanter Proteinproduktion mit mikrobieller Systeme¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ und somit die Anpassung des Mediums zu verbessern Zusammensetzung ist ein lohnender Schritt in Bioprozess Entwicklung in Bezug auf optimale Produktivität¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. Intensive Forschung auf der Anwendung von Mikrotiterplatten (MTP) für mikrobielle Kultivierung²²^,²³^,²⁴ ebnete den Weg für die Entwicklung und Gestaltung von MTP für mikrobielle Kultivierung²⁵ ^,²⁶ und die Entwicklung von MTP-basierte Microbioreactor (MBR) mit online-monitoring und ökologische Steuern²⁷^,²⁸. MBRs ermöglichen eine deutliche Zunahme der experimentelle Anbau Durchsatz. Außerdem stehen MBR Systeme aufgrund von anderen Arten von Bioreaktoren, z.B., Blase Spalten oder Rührbehälters Reaktoren für mikrobielle Bioprozess Optimierung²⁹^,³⁰^,³¹^, ³².

Optimierungsstudien profitieren in der Regel erhöhte experimentelle Durchsatz, der wird noch stärker in Kombination mit DOE-Methoden, beispielsweise zum bewerten Interaktionen zwischen Konstruktionsvariablen oder hochdimensionale Suche Räume reduzieren. Infolgedessen hat die kombinierte Verwendung von MBR-Systemen, Laborautomation und DOE erwies sich als eine leistungsfähige Methode in Biotechnologie⁸^,¹⁶^,³³^,³⁴^,³⁵.

Ein Protokoll für Media-Optimierung ist Kombination von State-of-the-Art Laborautomation, MBR-Technologie mit Online-Prozessüberwachung und Kriging-basierte Daten-Analyse/experimentelles Design präsentiert. Die Kriging-Methode erfolgt in einer MATLAB Toolbox (“KriKit”), die heruntergeladen und verwendet werden können kostenlos kostenlos³⁶. Maximierung der sekretorischen grüne ﬂuorescent Protein (GFP) Produktion mit C. Glutamicum zeigt als Anwendungsbeispiel Optimierung der Zusammensetzung des CgXII minimaler Medium. GFP-Titer war als Optimierung Ziel gewählt, da es leicht quantifiziert werden kann und es weithin als Modell Protein für Studien auf MBR Systeme³⁷^,³⁸^,^{39 gilt}.

Die vorgestellte Rahmen gliedert sich in vier Schritte, die in Abbildung 1dargestellt sind. Die Schritte sind gekennzeichnet durch Box-Rahmen und Teile des Protokolls entsprechen. Der erste Schritt (Abbildung 1A) ist um die Projektziele zu definieren und die erforderlichen Methoden zu bestimmen. Die Kombination von DOE Methoden, MBR-Technologie und Laborautomation ermöglicht einen experimentelle Durchsatz, der leistungsstarke Datenverarbeitung erfordert. Der zweite Schritt (Abbildung 1 b) zielt darauf ab, sensibles Design Variablen (d.h.Mittelkomponenten) mit hohen Einfluss auf das Ziel der Optimierung zu erkennen. Dies führt zu einer Reduzierung der Konstruktionsvariablen von Interesse. Der dritte Schritt (Abbildung 1) umfasst eine iterative Optimierung für eine genauere Untersuchung der die funktionale Beziehung zwischen den verbleibenden Entwurfsvariablen und dem Ziel von Interesse. Verwendung des sukzessive erweiterten Datensatzes, ist der Kriging-Ansatz zum Vorhersage der experimentellen Ergebnisse an ungemessenen Standorten eingesetzt. Die iterative Zyklus stoppt, sobald das Kriging-Modell eine optimale oder Plateau mit ausreichender Genauigkeit vorhersagt. Die Ergebnisse werden im vierten Schritt (Abbildung 1), beginnend mit einer weiteren Sensitivitätsanalyse rund um den ermittelten optimalen überprüft. Wenn anfangs unempfindliche Komponenten gefunden werden, auch in den optimalen Bereich unempfindlich sein, ist es vernünftig anzunehmen, dass dies bei der iterativen Optimierung im dritten Schritt gilt. Danach ist es ratsam, Optimierungsergebnisse zu überprüfen durch Anwendung von orthogonalen Methoden, wie eine Aktivität-Assay oder SDS-Page.

Die allgemeine Natur des vorliegenden Protokolls ermöglicht einfache Anpassung an verschiedene Laborgeräte, andere Ausdruck Hosts und Zielproteine Wahl sowie weitere Bioprozess Variablen wie pH-Wert oder Anbau-Temperatur.Darüber hinaus können andere Optimierungsziele wie Protein Produktionsrate, spezifische Ertrag und Qualität des Produkts gewählt werden, in den Rahmen der anderen Optimierungsstudien zu passen.

Abbildung 1 : Workflow der Optimierungsstudie. Die vier Frame-Boxen entsprechen Teile des Protokolls “Konzeption der Studie und Definition of Methods” (Abschnitt 1), “Sensitivitätsanalyse” (Abschnitt 2), “Iterative Optimierung” (Abschnitt 3) und “Validierung” (Abschnitt 4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

(1) Konzeption der Studie und die Definition von Methoden (Abbildung 1: Teil A) Hinweis: Definition des Ziels Optimierung: ein zeitlichen Verlauf der Produktbildung erforderlich ist oder nur eine begrenzte Zeit-Intervall oder sogar einen festen Zeitpunkt relevant? Überlegen Sie auch, mögliche Probleme wie Stabilität, Aufwand für analytische Quantifizierung oder Anbau Zeit. Als Alternative zur endgültigen Protein Titer könnte andere Ziele wie Biomasse oder Anbau Zeit betrachtet werden. Biomasse ist durch Biomasse bestimmte Produktausbeute, reflektiert, während Anbau Zeit von Raum-Zeit-Ausbeute reflektiert wird. Produktqualität (Minimum) könnte auch ein Ziel sein. Multi-objektiven Optimierung eventuell in bestimmten Situationen, wie an anderer Stelle40diskutiert. In dieser Studie wurde das Ziel der Optimierung GFP-Titer nach 17 h des Anbaus gewählt. GFP-Fluoreszenz kann online über die Ausstattung in dieser Studie, das vereinfacht die Konzentrationsbestimmung des Proteins Modell verfolgt werden.Hinweis: Definition der Parameter optimiert werden: CgXII Medium besteht aus 16 einzelnen Komponenten41 und untersucht alle davon in einem vollfaktoriellen Design 216 ≈ 65.000 Experimente führen würde. Infolgedessen muss der Suchraum auf eine rationale und erlebnisorientiert Basis reduziert werden. Die Auswahl der Media-Komponenten für die Optimierung berücksichtigt kann durch verfügbare Expertenwissen oder Literaturdaten unterstützt werden. Entscheiden Sie, welche mittlere Komponente Konzentrationen nicht variiert werden soll. Für die Optimierung des CgXII Mediums wurden folgenden Komponenten ausgewählt, um festzusetzen: Glukose wird auf 10 g/l festgesetzt. Diese Optimierung ist trivial, da mehr Glukose mehr GFP sezernierenden Biomasse ergibt. Das Ziel war es, nicht intuitiv mittlere Effekte anzuzeigen. 3-(N-Morpholino) Propanesulfonic Säure (MOPS) ist fest auf 42 g/L. Dies bietet ausreichende Pufferkapazität beim Batch-Anbau und wird nicht metabolisiert.Hinweis: Die Zugabe von MOPS bei diesem Endkonzentration sorgt für einen Anfangswert von pH 7, sogar mit den verschiedenen anderen Stammlösungen hinzugefügt, die nicht bei pH 7. Jedoch sollte jede Abweichung bei der Gründung pH-Werte auszuschließen, der pH-Wert für mittlere Kompositionen überprüft werden wo alle Stammlösungen an ihre maximalen und minimalen Mengen hinzugefügt werden. KH2PO4 und K2HPO4 sind auf 1 g/L festgesetzt. Diese bieten auch Pufferkapazität und dienen als Phosphat Quelle. Harnstoff wird auf 5 g/l festgesetzt. Dies dient als basale Stickstoffquelle und pH-Stabilisierung Agent, N-Begrenzung zu verhindern. Biotin ist fest auf 0,2 mg/L. C. Glutamicum ATCC13032 auxotrophe für Biotin. Protocatechuic Säure (PKA) wird auf 30 mg/l festgesetzt. Es dient als ein Bügeleisen chelatisierenden Agent. Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) wird auf 100 µM festgesetzt. Es induziert die Expression des Gens Gfp . Wählen Sie hohe und niedrige Konzentrationen von Medienkomponenten für anfängliche Empfindlichkeit Vorführungen. Hier wurden Komponenten aus drei typische Gruppen von Medienkomponenten gewählt. Die untersuchten niedrigen und hohen Konzentrationen für die einzelnen Komponenten sind: Standard-Stickstoff-Quelle: (NH4)2SO4 (8-32 g/L); Die Variation der Stickstoff-Quelle wurde berichtet, dass für die Optimierung der Biomasse-spezifische GFP Signal8erfolgversprechend. Spurenelemente: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7 H2O (0,4-1,6 mg/L), CuSO4 ∙ 5 H2O (125-501 µg/L), NiCl2 ∙ 6 H2O () 8-32 µg/L) und CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 µg/L). Die Zusammensetzung der Spurenelemente ist die erste Veröffentlichung des CgXII mittlere41geerbt. Darüber hinaus Na2MoO4 ∙ H2O (26-104 µg/L) und H3BO3 (20-80 µg/L) wurden als Spurenelemente enthalten, wie sie in einer veröffentlichten Variante des CgXII mittlere42verwendet werden. Makro-Elemente: MgSO4 ∙ 7 H2O (0,2-0,4 g/L), CaCl2 ∙ 2 H2O (5,3-21,2 mg/L). Diese fanden sich unter anderen zweiwertigen kationen zur Verbesserung der sekretorischen GFP Produktion in einer anderen Studie14, wo C. Glutamicum Stamm R mit einem anderen mittleren Hintergrund und die CgR0949 Tat Signalpeptid verwendet wurde. Vorbereitung von Materialien und Verfahren definitionHinweis: Es wird empfohlen, zu definieren und die experimentellen Methoden detailliert zu beheben. Diese Standardisierung stellt sicher, dass unterschiedliche Ergebnisse zu inneren biologischen Variabilität oder verschiedene mittlere Kompositionen zurückverfolgt werden können.Hinweis: Media Lager Lösungen: bereiten Sie individuelle Lagerlösungen für alle Medienkomponenten untersucht. Bereiten Sie hochkonzentrierte Aktien, um die Verdünnung der unterschiedlichen Volumen für alle Komponenten zu ermöglichen. Dies bedeutet, dass nach Kombination alle Stammlösungen in ihre höchste Lautstärke entsprechend den Gestaltungsplan, dies nicht, der letzte Anbau Volumen, vgl. Ziffer “Generation der mittleren Stammlösung Pipettieren Liste” Schritt 1.3.3 überschreiten darf. Wenn die Zugabe einer hochkonzentrierten Lösung ergibt sich eine sehr geringe Zugabe Volumen, z. B. < 1/100th des endgültigen Anbau Volumens, der Stammlösung entsprechend verdünnen. Zum Beispiel wurde in dieser Studie ein Pipettieren Volumen von weniger als 10 µL definiert nicht durchführbar. Spurenelement-Lösungen sind in der Regel so hoch konzentriert, als 1,000fold in Bezug auf standard Endkonzentration im Medium. Es ist vorteilhaft, Medienkomponenten als Vielfaches (X-fach) in Bezug auf Konzentrationen in der Referenz-Rezeptur zu konzentrieren. Auf diese Weise undurchführbar Pipettieren Bände der gebrochene Dezimalzahlen vermieden werden. Detaillierte Rezepte für alle Stammlösungen des CgXII Mediums sind in das ergänzende Dokument angegeben. Arbeiten Zellbank (WCB)Hinweis: Für jedes Experiment Wachstum ist ein WCB aliquoten verwendet. Ggf. weitere Aliquote Einsatz 100 mL Gehirn Herz Infusion (BHI) Medium in 1.000 mL ratlos Fläschchen schütteln oder impfen mehrere schütteln Fläschchen, die vor der Zugabe von Glycerin-Lösung zusammengefasst sind. Einzelne Kolonien die rekombinante Expression Sorte C. Glutamicum pCGPhoDBs- GFP43 auf Agarplatten (37 g/L BHI Puder, 20 g/L Agar, 25 mg/L Kanamycin) vorzubereiten. Beschichtung Material kann entweder aus frischem Transformation oder von kryokonservierten aliquoten kommen.Inkubation bei 30 ° C bis zum Erscheinen der einzelnen Kolonien; Dies dauert in der Regel ein bis zwei Tage. Eine Shaker-Kolben-Kultur (50 mL BHI Medium mit 25 mg/L Kanamycin, verblüfft 500 mL Flasche, 250 u/min, 25 mm Durchmesser schütteln, 30 ° C) mit Kolonie Material zu impfen und inkubieren Sie über Nacht (ca. 16 h). 1 Volumenteil resultierende Zellsuspension mit einem Volumen von 500 g/L sterile Glycerin Lösung zu kombinieren und in 2 mL Aliquots in sterilen Kryokonservierung Fläschchen verteilen. Shop bei-80 ° C. MBR-Anbau-ProtokollHinweis: Für die Beschäftigten BioLector MBR-System in diesem sind Studie, Streulicht (Biomasse) und GLP Fluoreszenz Intensität Messungen, die einen bestimmte Gain-Wert zugewiesen. Je höher die Verstärkung, desto höher das optische Signal wird verstärkt; Dies ist auch, warum Streulicht und Fluoreszenz in beliebigen Einheiten (AE) gemessen werden. Bestimmen Sie geeigneter Verstärkung Werte für Biomasse und GFP-Erkennung in Vorversuchen, zusammen mit geeigneten Schüttelfrequenz und Füllmenge um Sauerstoff Einschränkung bei höheren Konzentrationen von Biomasse in späteren Prozessphasen zu vermeiden. Die eingesetzten Anbaubedingungen (“Flowerplates”, d.h., blumenförmigen 48-Well MTP, Schüttelfrequenz von 1.200 u/min, Füllmenge von 1.000 µL, 10 g/L Glukose als wichtigsten Kohlenstoffquelle) gewährleistet Sauerstoff unbegrenzte Bebauungen. Für maximale Sauerstoff-Übertragungsraten aus anderen Kombinationen von Bände füllen und schütteln Frequenzen im blumenförmigen 48-Well MTP stehen Datenblätter vom Lieferanten zur Verfügung. Wachstumsstörungen der einzelnen Kulturen können auch durch geringe Mengen an sekundären Substrate (z. B.Stickstoff, Spurenelemente) auftreten. Überprüfen Sie daher, die Biomasse-Konzentrationen am Ende des Bebauungen. In dieser Studie wurden keine solchen Wachstumseffekte beobachtet. Definieren Sie die Anbau-Protokoll für die MBR-System (“BioLector”) wie folgt: Filterset 1: Biomasse, 14 gewinnen. Filterset 2: pH-Wert, der Gewinn ist voreingestellt. Filterset 3: pO2, Gewinn ist voreingestellt. 4: GFP, 80 gewinnen. Schüttelfrequenz: 1.200 u/min. Temperatur: 30 ° C. Taktzeit: 15 min. Versuch mal: Handbuch (Anbau wird nicht gestoppt werden automatisch). Generierung der mittleren Stammlösung Pipettieren ListeHinweis: Fast jede Liquid handling Robotersystem ist in der Lage, Pipettieren Aktionen aus externen Dateien zu lesen. Grundsätzlich ist die minimalste erforderlichen Informationen das Transfervolumen und Position des Reagenz Quelle sowie das Ziel eines jeden durch eine Labware-Position auf dem Roboter-Deck und einem spezifischen Hohlraum innerhalb der Labware dargestellt. Allerdings müssen verschiedene Syntaxen für verschiedene Liquid handling Systeme berücksichtigt werden. Abbildung 2 zeigt eine Beispiel-Datei-Struktur für die Beschäftigten Pipettier System in dieser Studie. Vier Arten von Stammlösungen sind gut in jeder Kultur pipettiert: Lager-Lösungen von Media-Komponenten sind vielfältig (“Variation-Aktien”). Wasser zum Ausgleich von unterschiedlicher kumulative Volumes von über Aktien. Eine Stammlösung (“Rest-Lager”), enthält alle Komponenten, die fixiert sind. Diese Stammlösung kann zusammengesetzt werden, aus Beständen, die mit den verschiedenen Komponenten, z.B.bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert oder mit verschiedenen Methoden sterilisiert. Inokulum, die als letzte Komponente hinzugefügt werden sollte und auf dem Arbeitstisch kurz vor Zugabe zur Beilegung der Zellen zu vermeiden. Pro Anbau, berechnen Sie die Volumen für alle Media-Komponenten nach übertragen werden: Das Volumen für bestimmte Variation Aktien vielleicht hinzugefügt werden null, d. h., wenn diese bestimmte Komponente weggelassen wird. Alle berechneten Volumen Vich für geeignete Zahlen zu überarbeiten. Pipettieren Volumen-Schritten in Volumen Schritten sollte nicht zu klein sein. Passen Sie ggf. die Konzentrationen der Variation Bestände. Zum Beispiel die minimale Pipettieren Lautstärke hier wurde definiert als 10 µL, und die minimale Schrittweite wurde definiert als 5 µL. Im Allgemeinen sollten diese Volumes anhand von experimentell ermittelten Präzision und Genauigkeit für die verwendete Liquid handling Station15,44definiert werden. Berechnen Sie das Volumen der Rest Lager mit den festen Bauteilen für alle Brunnen wie folgt: wo die maximale kumulative Lagervolumen Variation dient. Infolgedessen berechnen Sie die erforderlichen Konzentrationen der festen Komponenten vorrätig Rest wie folgt: Rest-Lager entsprechend vorzubereiten. Pro Anbau berechnen Sie, das Volumen des Wassers wie folgt hinzugefügt werden: Pro Anbau gut, Listen Sie alle Volumes hinzugefügt werden in der folgenden Reihenfolge der Zugabe: VH2O, VRestStock, Vich, VInok. Formatieren Sie die Pipettieren Liste nach den Vorgaben der Umgang mit Bahnhof, Flüssigkeit, wie zum Beispiel in Abbildung 2gezeigt. Impfkultur, automatisierten Vorbereitung und Start der wichtigsten Kultur Erstellen Sie ein Protokoll für liquid Handling-Roboter. Abbildung 3 und Abbildung 4 zu sehen, für ein Beispiel-Protokoll für ein “Janus”-System, in entsprechenden “WinPREP” Software implementiert. Das Protokoll sollte folgende Aspekte berücksichtigen: Gehören Sie eine ausreichende Laufzeit von sterilen Wohnungen vor Medien Vorbereitung. Enthalten Sie eine anfängliche übermäßige Reinigung und waschen alle Pipettieren Tipps und Schläuche. Wählen Sie geeignete Labware Behälter für Lagerlösungen. Hier werden Tiefbrunnen Platten mit 12 Spalten geeignet für die Lagerung von Variation Bestände, da alle acht Pipettieren Tipps in einer parallelen Anordnung in die gut Spalten eintauchen können. Dies beschleunigt stark Medien Vorbereitung. 15 mL oder 50 mL Reagenz Röhren als Behälter verwendet werden, kann nur ein Pipettieren Tipp auf einmal hinein Tauchen.Für andere Bestände wie Wasser und Rest-Lagersind 100 mL Tröge verwendet, da diese Stammlösungen höhere Volumen insgesamt erfordern. Bieten Sie eine ausreichende Gesamtvolumen für jedes Vorratslösung zu kompensieren Abfallmengen, Höhe Pipettieren Versätze usw. Legen Sie eine Benutzereingabeaufforderung vor der Beimpfung Schritt, um sicherzustellen, dass dieser Schritt sofort vor dem Samen Kultur Eingriff durchgeführt wird. Bereiten Sie alle Stammlösungen in eine sterile Weise und speichern bis zum Gebrauch in entsprechenden Behältern, z.B., sterile 15 mL und 50 mL Reagenzgläsern. Sterilisieren Sie die Tiefbrunnen Platten für Stammlösung Lagerung auf einem Arbeitstisch, z. B.durch Abwischen mit 70 % Ethanol und anschließendes Trocknen in einem Laminar-Flow-Haube. Zunächst die Impfkultur impfen 50 mL BHI Kanamycin 25 mg/L mit einem aliquoten aus der WCB-haltigem Medium. Bereiten Sie vor den MBR Anbau frische, vitale Inokulum aus Samen Kulturen in ausreichender Menge wächst exponentiell. Legen Sie alle erforderlichen Labware auf dem Roboter Arbeitstisch und gießen Sie Stammlösungen in den entsprechenden Labware. Starten Sie der Roboter Workflow für Medien Vorbereitung, so dass der letzte Schritt (Inokulation), rechtzeitig zum Start der Impfkultur erreicht ist. Die Gesamtlaufzeit des Roboter-Workflows muss zuvor bewertet werden. Hier war die Gesamtlaufzeit ca. 1,5 Stunden. Probieren Sie die Impfkultur nach ca. 2 h, dann jede Stunde, um das Wachstum durch optische Dichte (OD600) zu überwachen. Nach ca. 5 h die Kultur 3-4 OD600 erreicht und wird verwendet, um die wichtigsten Kulturen zu impfen. Stellen die Impfkultur auf dem Arbeitstisch liquid Handler und weiter das Medien-Vorbereitung-Protokoll. Versiegeln Sie Anbau MTP nach der Inokulation. Legen Sie den versiegelten Anbau MTP in das BioLector-Gerät und starten Sie die vordefinierten Anbau-Protokoll. Die restlichen Stammlösungen Biosafety vorschriftsmäßig ggf. zu entsorgen, und Samen der Kultur aus dem Roboter Arbeitstisch. Reinigen Sie den wieder verwendbaren Labware und starten Sie liquid Handler Dekontamination Protokoll zu. Produkt-Quantifizierung und Vorverarbeitung von raw-Daten für die Analyse Stoppen Sie die wichtigste Kultur nach einer Laufzeit von 17 h. Übertragen Sie die Messdaten an den angeschlossenen Computer mit dem BioLection-Softwarepaket gemäß Bedienungsanleitung des Herstellers von BioLector MBR-Gerät. Verwendung der “Data Management → Daten umwandeln” Funktion der “BioLection”-Software-Paket, das der MBR-System zur Umwandlung der raw-Datei in ein Spreadsheet-Format bequem begleitet. Kopieren Sie die GFP Signaldaten für alle Anbau-Brunnen aus der Timestamp-Spalte 17 h. identifizieren, die die GFP von der Referenz-Anbau-Brunnen und dem Durchschnitt Signale am nächsten. Alle übrigen GFP-Signal durch das durchschnittliche Referenzsignal zu normalisieren. Quantifizieren der GFP-Titer mit zusätzlichen Methoden (falls erforderlich) Übertragen Sie die Zellsuspensionen von alle Anbau-Brunnen in prelabeled Reaktionsgefäßen und erhalten Sie die zellfreie überstand nach Zentrifugation für 10 min bei maximaler Geschwindigkeit mit einer Benchtop-Zentrifuge. 200 µL jeder zellfreie Überstand in ein schwarz 96-Well-MTP mit transparentem Boden übertragen, und lesen Sie die GFP spezifische Fluoreszenz bei 488/520 nm mit einer entsprechenden Mikrotestplatte Reader. Das GFP-Signal aus allen Brunnen mit durchschnittlichen Signal von Referenz-Kultivierungen, wie in Schritt 1.5.3 zu normalisieren.Hinweis: Die absolute GFP-Fluoreszenz-Signale können nicht für verschiedene Messgeräte verglichen werden. Die 5 Referenzstämme aus allen wesentlichen Anbaugebiete dienen daher als interner Standard. Die Verbesserung der GFP-Titer kann im Zusammenhang mit dem internen Standard ausgedrückt werden. Dies ermöglicht für den Vergleich von Ergebnissen aus verschiedenen Experimenten und verschiedene GFP Quantifizierungsmethoden (siehe die nächsten beiden Schritte). Den Eiweißgehalt der zellfreien Überstände mit standard-Protokolle, z.B., Bradford und BCA-Test zu bestimmen. In Kombination mit den Ergebnissen von Schritt 2 ist die Bestimmung von einem Protein spezifischen GFP Titer möglich.Hinweis: Nach der Fluoreszenzmessung, verwenden Sie die Probe direkt aus diesem Mikrotestplatte. Verwendung von Mehrkanal Pipetten erleichtert die notwendige Flüssigkeit Umgang mit Schritte. Führen Sie eine SDS-Page-Visualisierung der zellfreien Überstände nach Standardprotokollen um zu überprüfen, dass der Großteil der Erhöhung der Proteingehalt ist durch vermehrte Ausschüttung der GFP.Hinweis: SDS-Page ist aufwändiger als die zuvor genannten Methoden, vor allem mit hoher Abtastrate Last. Für Zwecke der Überprüfung ist es oft ausreichend, SDS-Seiten der zellfreien Überstände aus mittleren und letzten mittlere Kultivierungen15optimiert laufen zu lassen. 2. die Sensitivitätsanalyse (Abbildung 1: Teil B). Hinweis: Das Ziel dieses Teils ist es, wichtigen Faktoren zu identifizieren, die einen signifikanten Effekt auf das Ziel zu haben. Wählen Sie eine Ausgangskonzentration an Media-Komponenten. Die Referenz mittlerer Zusammensetzung sollte innerhalb der gewählten Konzentrationsbereichen liegen. Wählen Sie eine geeignete DOE. Solche Designs finden Sie in der Literatur, z.B.aus dem NIST/SEMATECH e-Handbuch von statistischen Methoden (abrufbar unter www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). Das gewählte Design richtet sich nach Anzahl der Medienkomponenten von Interesse (hier 11) und die Anzahl der durchgeführten Experimente (hier, 32). Im gegebenen Beispiel war Design “2IV11-6” gewählt, das führt zu 32 Experimente und ermöglicht die Abschätzung der Auswirkungen der Erhöhung der Konzentration von eines der elf Komponenten auf das Ziel von Interesse. Um genauer zu sein, ist die Haupteffekte mit paarweisen Faktor Interaktionen nicht korreliert. Sie können mit höherer Ordnung Interaktionen verwechselt werden, die sind aber wahrscheinlich nicht signifikante. Verwenden Sie die verbleibenden Brunnen (hier 16) für die Durchführung von mehreren Wiederholungen mit dem Referenzmedium auf die Reproduzierbarkeit des Prozesses zu beurteilen. Wiederholungen sollten gleichmäßig auf der Platte, positionelle Effekte zu entdecken verteilt. Der Mittelwert der gemessenen Leistung von den Referenz-Experimenten dient zur Normalisierung. Das heißt, gliedert sich jeder gemessene Ausgang der Sensitivitätsanalyse durch den Mittelwert der Referenz-Ausgabe. Berechnen Sie die wichtigsten und wenn möglich die kombinatorische Effekte mit entsprechenden Statistik-Software. Das klassische Design der Experiment basiert auf einer polynomialen Annäherung45. Zum Beispiel kann die MATLAB-Funktion Mvregress zur Abschätzung der polynomischen Koeffizienten verwendet werden.Die Mvregress-Funktion ist Teil der Statistics and Machine learning-Toolbox. Identifizieren Sie die relevanten Auswirkungen der verschiedenen Media-Komponenten auf das Ziel mit einem t-Test. Im Beispiel NH4+ hat erhebliche negative Auswirkungen, und Ca2 + und Mg2 + zeigen die stärksten positiven Effekte (Abbildung 5). Da GFP Signal normalisiert wurde, die Koeffizienten stellen die durchschnittliche relative Änderung in der GFP-Signal bei einer Erhöhung der Konzentration der jeweiligen Komponente aus seinen Wert “Center” , um den maximalen Wert. Fixierte Komponenten ohne eine relevante Wirkung sind bei ihrem Referenzwert bei der Optimierung. (3) iterative Optimierung (Abbildung 1: Teil C) Hinweis: das MATLAB Tool KriKit für die Interpretation und statistische Daten-Analyse-36 diente. KriKit ermöglicht dem Benutzer, eine datengesteuerte Kriging-Modell zu konstruieren. Dieses Kriging-Modell prognostiziert die funktionale Beziehung zwischen den Medienkomponenten und das Ziel. Es informiert auch über die Unsicherheit der Prognose. Hoher Unsicherheit zeigt laut Daten und/oder unzureichende Datendichte. DOEHinweis: Neue Experimente sind iterativ gestaltet, basierend auf den Ergebnissen der vorherigen Ausführung. Entwerfen Sie in der ersten Iteration neue Experimente für Detailuntersuchung der identifizierten Medienkomponenten von Interesse. Versuchsergebnisse aus Abschnitt 2 nicht auf die iterative Optimierung (Abschnitt 3), übertragbar, da die Konzentrationen der Komponenten ohne relevante Wirkung auf den jeweiligen Referenzwert behoben werden. Infolgedessen sind Experimente aus der Sensitivitätsanalyse und die iterative Optimierung nicht vergleichbar. Ansonsten folgen Sie dem Schema in Abbildung 1, Frame “Iterative Optimierung” dargestellt. Wenn das optimale Potential innerhalb der definierten Konzentrationsbereich liegt, sollen neue Experimente mit der erwarteten Verbesserung40,46. Das experimentelle Design auf der Grundlage der erwarteten Verbesserung ist in der Toolbox KriKit integriert. Wenn das Optimum an der Grenze liegt, erweitern Sie den Konzentrationsbereich. Führen Sie Experimente an den gestalteten Probe stellen, nach experimentellen Methoden, die in Abschnitt 2 definiert. Statistische Analyse Konstruieren Sie eine Kriging-Modell anhand der kombinierten Daten aus alle Iterationen, einschließlich den aktuellen. Untersuchen Sie die Modell-Ausgabe durch Visualisierung mithilfe der umfassenden Tools KriKit (2/3D Interpolation, Film-Analyse, screening, Grundstück, etc.). Wenn eine optimale Fläche mit ausreichender Genauigkeit geschätzt wurde, nicht mehr Optimierung. Wenn dies nicht der Fall ist, fahren Sie mit Schritt 3.1.Hinweis: Abbildung 6 veranschaulicht die iterative Optimierung für die Test-Studie. Der Konzentrationsbereich wurde sukzessive erweitert, bis ein Plateau (Iteration 1-6) gefunden wurde. Die siebte Iteration diente die Grenzen genauer zu erforschen. 4. Überprüfung der Ergebnisse (Abbildung 1: Teil D) Hinweis: Nach Abschluss der iterativen Optimierung, die ursprünglichen Annahmen müssen auf ihre Gültigkeit überprüft werden. Sensitivitätsanalyse (Abschnitt 2) für optimale mittlere Zusammensetzung zu wiederholen. Das heißt, sind die Konzentrationen der Komponenten, die in Abbildung 1 (Teil C) untersucht werden auf ihre optimale Werte fixiert. Konzentrationen von anderen Komponenten sind nach einer entsprechenden DOE vielfältig.Hinweis: Ähnliche Ergebnisse in beiden Vorführungen zeigen, dass die Konzentrationen der untersuchten Bauteile nicht die Wirkung der anderen Komponenten verändern. Wenn das Screening erhebliche Unterschiede zu den Ergebnissen von Teil B zeigt, Komponenten mit einer veränderten Wirkung sollte in den Pool des untersuchten Komponenten hinzugefügt werden und Teil C sollte wiederholt werden. Gelten Sie bei der indirekten Messung (z.B. Fluoreszenz als Indikator für Produkt-Konzentration) orthogonal Messung Ansätze (z.B.Aktivität Assay, Bradford oder BCA Protein Quantifizierung, SDS-Page) zur Bestätigung der Änderung Das Ziel von Interesse durch den Vergleich ergibt sich aus der Referenzmedium und die optimierte mittlere15.

Representative Results

Das eingeführte Protokoll wurde für die Maximierung der Titer von sekretierten GFP angewendet. Insbesondere die GFP Titer nach 17 h der Anbau als Optimierung Ziel gewählt wurde. Online-Fluoreszenz-Detektion von GFP erlaubt einfaches Produkt Quantifizierung. Die Normalisierung der GFP Signal mit Daten aus einem Referenz-Anbau ist jedoch unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Eine Vorauswahl von Medienkomponenten wurde auf eine rationale Grundlage durchgeführt, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Experimente wurden durchgeführt nach den Anweisungen von Abschnitt 1: die Parameter der nassen Lab Verfahren wurden für die gesamte Studie Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse definiert. Wie in Abschnitt 2 beschrieben, wurde ein erstes Screening zur Identifizierung von relevanter Komponenten zeigen einen signifikanten Einfluss auf das Ziel der Optimierung für die weitere, detailliertere Studie durchgeführt. Das MTP-basierte MBR-System ermöglicht 48 Experimente parallel ausgeführt werden. Unter Berücksichtigung die maximal mögliche Anzahl von parallelen Experimente an einer MTP (48) und die Gesamtzahl der Medien-Komponenten (11) macht die 2IVentwerfen11-6 gebrochene eine geeignete Wahl. Dieses experimentelle Design umfasst 32 Experimente und erlaubt die Schätzung der Haupteffekt für jede der untersuchten Medienkomponenten. Die restlichen Anbau-Brunnen (16) dienten mehrere Wiederholungen der Experimente mit dem Referenzmedium, um Reproduzierbarkeit und positionelle Auswirkungen zu beurteilen. Das heißt, jedes Experiment wird einmal durchgeführt (keine Wiederholungen), mit Ausnahme des Referenz-Experiments (fünf Wiederholungen). Tabelle 1 fasst die Ergebnisse des Screening-Analyse. Im betrachteten Konzentrationsbereich zeigen variieren die Mehrheit der Medienkomponenten nicht spürbar auf das Ziel. Komponente NH4+ zeigt eine starke negative Wirkung, während Ca2 + und Mg2 + die stärkste positive Tendenz zeigen. Die Wirkung von Mg2 + kann ist nicht für die aktuelle Konzentrationsbereich jedoch für einen breiteren Konzentrationsbereich. Infolgedessen entschied man, NH4+ vom Medium weglassen und die Wirkung von Ca2 + und Mg2 + in weiteren Experimenten zu untersuchen. Abschnitt 3 beschreibt die iterative Optimierung Prozedur, die für die Maximierung der GFP-Fluoreszenz-Signal während der unterschiedlichen Konzentrationen von Ca2 + und Mg2 +verwendet wird. In Iteration 1 wurde die Hypothese, dass NH4+ kann weggelassen werden getestet. Der Konzentrationsbereich für Ca2 + und Mg2 + wurde von der Screening-Analyse angenommen. Die Mindestkonzentration von NH4+ wurde auf Null gesetzt und die maximale Konzentration des Screening-Tests angenommen wurde. In den folgenden Experimenten wurden die Komponente-Konzentrationen auf ein 3 x 3 x 3 Raster innerhalb der definierten Konzentrationsbereich, wodurch 27 Experimente verteilt. In allen Kulturen waren fünf Wiederholungen von Referenzmedium enthalten, dienten als interner Standard und sicherzustellen, dass keine positionale Effekte über die MTP aufgetreten. Für die verbleibenden 16 Brunnen wurden die Konzentrationen von NH4+, Ca2 +und Mg2 + nach dem Zufallsprinzip in den angegebenen Bereichen verteilt. Abbildung 5 A visualisiert die Ergebnisse der ersten Iterationen. Achsenbezeichnungen beziehen sich auf die Komponente-Konzentrationen in der ursprünglichen Referenzmedium verwendet wird durch x Ref. Die blauen Flächen repräsentieren die Kriging-Interpolationen, die mithilfe der KriKit-Software berechnet wurden. Jede Oberfläche ist verbunden mit einer relativen Konzentration für NH4+ (dunkelblau: 0 x Ref, kariert: 1 x Ref, hellblau: 2 x Ref). Diese visuelle Darstellung zeigt, dass es günstig für NH4+weglassen. Interpolation Oberflächen zeigen auch die positiven Effekte der Mg2 + und Ca2 +, da alle Flugzeuge steigen mit zunehmender Konzentration. Basierend auf den Ergebnissen der Iteration 1, wurde beschlossen, erweitern die Konzentration Palette von Ca2 + und Mg2 + durch eine Verdoppelung der maximalen Konzentrationen und verlagert das experimentelle Design-Fenster in der oberen rechten Ecke, siehe Abbildung 5 B. innerhalb dieses Bereichs wurden die Konzentrationen auf ein 6 x 6-Raster verteilt. Dies sorgt für eine gleichmäßige Verteilung über die volle Konzentrationsbereich, führt zu optimalen Ergebnissen der Kriging-Interpolation. Abbildung 5 B zeigt die Kriging Interpolation Handlung der kombinierten Daten anhand gemessen in beiden Iterationen (rote Punkte und gelbe Quadrate). Für Ca2 + und Mg2 +, setzt die positive Wirkung ihrer Konzentration zu erhöhen. Infolgedessen das Verfahren wurde durch die Verdoppelung der maximalen Konzentration wiederholt und so zog das experimentelle Design-Fenster, die Grenzen von der oberen rechten Ecke zu erkunden. Abbildung 6 A enthält eine Übersicht über den restlichen Optimierungsverfahren. Die Analyse der gesammelten Daten bis zu Iteration 3 ergab, dass eine Einschränkung der positiven Wirkung von Mg2 +, d.h., eine optimale Konzentration Palette von Mg2 + identifiziert wurde. Es wurde daher beschlossen, den Konzentrationsbereich nur für Ca2 + (Iteration 4) weiter ausbauen. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt (Iteration 5 und 6) bis eine Sättigung der GFP-Signal gefunden wurde. Diese Sättigung wird durch Ausfällung von Ca-Salze für die angewandte Konzentrationen von Ca2 +, erklärt, die nicht zu den Zellen zur Verfügung stehen. Versuchsergebnisse immer durch Lärm gestört sind, die sich daraus ergebenden Kriging-Interpolation erscheint unregelmäßig und Sichtprüfung kann zu falschen Schlussfolgerungen führen. Jedoch kann die optimale Konzentrationsbereich von Media-Komponenten für die gesättigten GFP Signal zuverlässig mit dem statistischen Z -Test, identifiziert werden, die auch in KriKit umgesetzt wird. Der Z -Test verwendet direkt die intrinsische statistische Angaben der Kriging-Methode, d. h., Vorhersagewerte und Prognose Unsicherheiten. Abbildung 6 B zeigt die identifizierten Plateau als entschlossene und visualisiert die KriKit Toolbox verwenden.Die KriKit Toolbox ist frei verfügbar36 und verfügt über eine ausführliche Anleitung, die erklärt, wie Sie ihre Funktionen nutzen. Wenn mehr als zwei relevante Komponenten gefunden werden, erreicht 3D-Visualisierung seine Grenze. KriKit bietet mehrere andere mögliche visuelle Darstellung Methoden wie Filme oder “screening-Plot”. Wenn das optimale Potential innerhalb der definierten Konzentrationsbereich liegt, sollen neue Experimente automatisch mit der erwarteten Verbesserung40,46. Das experimentelle Design auf der Grundlage der erwarteten Verbesserung ist in der Toolbox KriKit integriert. Detailliertere Informationen finden Sie in der Softwaredokumentation. Nach dem iterativen Verfahren wurde eine Überprüfung der Ergebnisse durchgeführt, wie beschrieben in Teil D., Die Gültigkeit der ursprünglichen Annahmen wurde durch Ausführen einer zusätzlichen Sensitivitätsanalyse optimale mittlere Zusammensetzung überprüft. Das heißt, alle ursprünglichen Medienkomponenten von Interesse waren vielfältig, aber Ca2 + und Mg2 + wurden eingerichtet, um ihre optimale Konzentrationen. In dieser Studie, die optimalen Konzentrationen = 32 x Ref und = 6,8 X Ref wurden ausgewählt. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Validierung Überprüfung. Ähnlich wie die anfängliche Empfindlichkeit screening (vgl. Tabelle 1), NH4+ hat immer noch einen erheblichen negativen Einfluss und übrigen Effekte sind immer noch vernachlässigbar. Durch einfachen Zugang wurde die GFP Fluoreszenzsignal aus der Anbau-Suspension zur extrazellulären GFP-Titer bei allen Experimenten zu quantifizieren. Aus Gründen der Überprüfung wurde GFP Fluoreszenz gegen andere Messungen validiert. Da GFP über die Tat-Signalweg abgesondert wird, kann nicht das Fluoreszenzsignal zwischen Intra- und extrazellulären GFP unterscheiden. So wurden Kultivierungen wiedergegeben mit der Referenz und der optimierten Medium. Neben der Fluoreszenzmessung von zellfreien Anbau Überstände, Proteingehalt wurde quantifiziert durch die Bradford-Test und (Semi)-qualitative Verbesserung der GFP visualisiert durch SDS-Page15. Alle daraus resultierenden Messung signalisiert wurden etwa verdoppelt für Bebauungen mit optimierten Medium im Vergleich zu Referenzmedium und validiert die ca. 100 % Verbesserung der Leistung der Sekretion von optimierten Medium. Infolgedessen kann GFP spezifische Fluoreszenz der Anbau Aussetzung eine geeignete Metrik für Optimierung Ziel, d. h., die extrazelluläre GFP-Titer betrachtet werden. Abbildung 2 : Screenshot aus der Lautstärke Pipettieren Liste für Sensitivitätsanalyse. Einträge in der ersten Spalte weisen einen eindeutigen Bezeichner für alle Volumes einer Zeile; Dieser Bezeichner ist das MTP auch Nummer der Ziel-Anbau MTP auf dem liquid Handler Arbeitstisch, vgl. Abbildung 4C. Verbleibende Spalten kodieren Bände für verschiedene Lösungen (“Sln-01” bis “Sln-15”) um pipettiert werden. Das Gesamtvolumen einer Zeile entspricht dem endgültigen Anbau Volumen des jeweiligen gut. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Screenshot aus der Flüssigkeit Umgang mit Steuer-Software “WinPREP”. Links: Reihe angeordnete Befehle, einschließlich einen Transfer-Befehl für jede Vorratslösung zu pipettiert werden. Vor dem letzten Befehl für Inokulum Zusatz wird eine Benutzereingabeaufforderung eingefügt, um sicherzustellen, dass die Impfkultur just-in-Time am Tisch platziert wird. Rechts: Schematische Darstellung des Arbeitstisches, einschließlich der Quelle Labware für Variation Aktien (zwei Tiefbrunnen Platten mit 12 Spalte wie Brunnen), Reagenz Trog für Rest-Lager, Wasser und Inokulum und den Medien Vorbereitung Ziel Anbau MTP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : Zusammenstellung von ausführlichen Screenshots zum Einrichten von einer Stammlösung pipettieren. (A) Befehl zum Pipettieren von Fe Lager ausgepackt. Quelle Labware und Quelle gut sind innen auf dem Arbeitstisch lesen Sie Rahmen und rote Säule der entsprechenden Tiefbrunnen Platte geprägt. Reiseziel Labware und Zielort Brunnen innerhalb sind geprägt von den blauen Rahmen um und blauen Brunnen des Ziel-Anbaus MTP. (B) detaillierte Beispielansicht im Auftrag des Pipettierens Bände für diesen Schritt (Fe-Stammlösung). Anzahl der Destinationen wird aus der Pipettier Liste gelesen hat 48 Zeilen. Die Dispensierung Bände für alle Ziel-Brunnen für Fe-Stammlösung in Spalte 4 der Pipettier Liste gefunden wird. Beachten Sie, dass die erste Spalte in der Pipettier Liste enthält Bezeichner und Volumina nicht übertragen werden, siehe Abbildung 2. (C) Informationen über Reiseziel gut Nummerierung. Bände in der Reihe #1 der entsprechenden Pipettieren Liste geschrieben werden in Brunnen als #1 und So weiter gekennzeichnet pipettiert werden. Wells #01, #08, #41 und #48 entsprechen Brunnen A01, A08, F01 und F08 für die Alpha-numerische Codierung, die auch in den Anbau MTP selbst aufgedruckt ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5 : Detaillierte Ergebnisse aus der ersten Iteration. (A) Kriging Interpolation anhand experimenteller Daten Iteration 1. Rote Punkte zeigen den Datensatz. Zum Vergleich: alle drei Interpolation Oberflächen sind in einem Diagramm überlagert (dunkelblau: 0 x Ref, kariert: 1 x Ref, hellblau: 2 x Ref). Eine alternative Darstellung der Ergebnisse finden Sie ebenfalls15. (B) Kriging Interpolation anhand der Experimente in Iteration 1 (rote Punkte) und Iteration 2 (gelbe Quadrate) durchgeführt.Teile der Daten in dieser Abbildung wurden zuvor veröffentlichten15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6 : Darstellung der iterativ gesammelten Optimierungsergebnisse. (A) endgültige Kriging Modell Vorhersage. (B) statistische Identifikation des optimalen Bereichs (rot) basierend auf den statistischen Z-test, die KriKit bietet. Kästchen zeigen an aufeinander folgenden Schritten des iterativen Design und Durchführung von Experimenten. Teile der Daten in dieser Abbildung wurden zuvor veröffentlichten15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Komponente Normalisierter Koeffizient Mittelwert Fe2 + -0,08 MN2 + -0,05 Zn2 + -0.21 Cu2 + -0.21 NH4+ -2.04 NI2 + -0.11 Co2 + -0,10 MoO42- 0,03 BO-33- 0,06 Ca2 + 1.00 Mg2 + 0,45 Tabelle 1: Ergebnisse der Sensitivitätsanalyse. Die Werte der Koeffizienten, die durchschnittliche Wirkung darstellt, bei der Erhöhung der jeweiligen Komponente Medienkonzentration aus seiner Mitte Wert auf den maximalen Wert. Für optimalen experimentellen Designs, wie in der Standardliteratur gefunden und verwendet hier die Standardabweichung stellt direkt die experimentelle Variation durch die Replikation des Referenz-Experiments. Koeffizient Werte wurden durch den maximal-Wert (0.0422 für die Komponente Ca2 +) normalisiert. Normalisierte und absolute Koeffizient Standardabweichung beträgt 0,54 bzw. 0.0226. Komponente Normalisierter Koeffizient Mittelwert Fe2 + -1,00 MN2 + 1.00 Zn2 + -3.48 Cu2 + -0.52 NH4+ -15.95 NI2 + 0.69 Co2 + -0.51 MoO42- -0.45 BO-33- -1.11 Tabelle 2: Ergebnisse der letzten Sensitivitätsanalyse. Die Werte der Koeffizienten, die durchschnittliche Wirkung darstellt, bei der Erhöhung der jeweiligen Komponente Medienkonzentration aus seiner Mitte Wert auf den maximalen Wert. Da eine optimale Versuchsplanung verwendet wurde, hängt die Standardabweichung nur die experimentelle Variante mit der optimierten mittlerer Zusammensetzung. Experimentelle Variante leicht erhöht im Vergleich zu der Variante mit dem Referenzmedium. Koeffizient Werte wurden durch den maximal-Wert (0.0106 für Komponente Mn2 +) normalisiert. Normalisierte und absolute Koeffizient Standardabweichung ist 3,63 und 0.0385, beziehungsweise.

Discussion

Die allgemeine Natur des vorliegenden Protokolls ermöglicht verschiedene Anpassungen, z.B.für die Untersuchung andere mikrobielle Ausdruck Gastgeber⁹^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^, ⁵¹, oder andere Eigenschaften des Zielproteins, wie Glykosylierung Muster oder umgeformt Anleihen zu optimieren. Das Protokoll müssen auch an die verfügbaren Laborausrüstung angepasst werden. Die Integration eines MBR-Systems ermöglicht es, Erhöhung des experimentellen Durchsatzes, ermöglicht große Einsparungen in der Zeit. Allerdings muss beim Austausch der voll instrumentierter und kontrollierbaren Bioreaktoren von MBR Systems Skalierbarkeit der Ergebnisse⁸^,³⁷^,⁵²^,⁵³berücksichtigt werden. Die Verwendung von DOE Methoden und mathematische Modellierung hilft, um den Informationsgehalt von Messdaten in Bezug auf die untersuchten Objektive⁵⁴ durch effiziente experimentelle Planung und Modell-basierten Daten Auslegung¹⁵zu maximieren.

Änderungen an der Methode
Neben Mehrzweck- und erweiterbare Roboter Liquid handling Systeme wie die in dieser Studie verwendet sollte erwähnt werden, dass gibt es mehrere kleinere Liquid handling Systeme im Handel erhältlich, sind in der Lage, diese Aufgabe zu erfüllen und im Inneren platziert werden können der Laminar-Flow Werkbänke. Wenn kein automatisiertes Pipettierens System verfügbar ist, können unterschiedliche Medien Kompositionen nach dem DOE-Plan auch durch manuelle Pipettieren mit Einzel- und/oder Mehrkanal Pipetten realisiert werden. Da die manuelle Vorbereitung fehleranfälliger ist und hoch konzentriertes Arbeiten für eine lange Zeit benötigen, empfiehlt es sich, eine geringere Anzahl von verschiedenen Medien Kompositionen vorzubereiten.

Abhängig von den Fähigkeiten des eingesetzten MBR Systems wird das entsprechende Protokoll Anbau variieren. Zum Beispiel wenn keine Online-Messung der Biomasse Formation verfügbar ist, kann es ausreichen, um Biomasse Konzentration nach Beendigung des Experiments Wachstum zu messen sein. In Kombination mit der Online-Überwachung der pH-Wert und gelöstem Sauerstoff, die in mehreren MBR-Systemen implementiert wird, die Wachstum Sättigung sicher bestimmt werden kann. Im Prinzip können die Wachstumsversuchen im MTP allein in Inkubatoren, ohne den Einsatz eines MBR Systems schütteln platziert durchgeführt werden. In diesem Fall haben die richtigen Anbaubedingungen sichergestellt werden: (1) Sauerstoff-limitierte Bebauungen mit MTP mit geeigneten Geometrien in Kombination mit richtigen Frequenzen schütteln und schütteln, Durchmesser, z.B., Quadrat 96 oder 24 Tiefe vermieden werden Well-Platten bei 1.000 u/min bei 3 mm werfen oder bei 250 u/min bei 25 mm zu werfen, bzw. betrieben. Wichtig ist, sollte je niedriger die erreichbare maximale Sauerstoff-Übertragungsraten, desto geringer die wichtigsten Kohlenstoffquelle konzentriert werden. Wie bereits erwähnt, für diese Studie war die Verwendung von 10 g/L Glukose geeignet, Sauerstoff-Einschränkung für die Beschäftigten Anbaubedingungen zu verhindern; (2) Sampling der MTP Kulturen für Biomasse und Produkt Quantifizierung sollte auf ein Minimum reduziert werden. Jedes Mal, wenn die MTP aus dem Schütteln Inkubator entfernt wird Sauerstoffzufuhr wird sofort Abbau die ungünstigen Anbaubedingungen führen können; (3) in der Stellungnahme der Autoren ist die Verwendung von MTP Leser als Anbau-Geräte nicht empfohlen, da diese Geräte nicht für diesen Zweck entwickelt wurden. Z. B. Schütteln Mechanik wurden für gelegentliche Vermischung von Mikrotiterplatten nach der Zugabe des Reagenz gebaut und so oft fehlt Robustheit für hohe Auflagen von kontinuierlichen schütteln anhaltende tagelang. Darüber hinaus kann nicht ausreichend Leistungsaufnahme für mikrobielle Kulturen benötigt diese Leser realisiert werden. Die Integration von optischen Dichte Lesungen kurz Zeitintervalle erfordert Beendigung zitternder Bewegung, was zu wiederholten Perioden Sauerstoff Verjährungsfrist. Darüber hinaus wird die Verdunstung in solchen Systemen über lange Anbau Zeiträume Ergebnisse verzerren. Für mehr Details über die überraschend komplexe Thema MTP für mikrobielle Kulturen verwendet wird der Leser auf die zitierte Literatur²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,^{26 bezeichnet.}und verweist darin auf.

Weitere Überlegungen
Zur iterativen Optimierungsschritte beschleunigen ist es ratsam, die analytische Methode zur Quantifizierung der Produkt sorgfältig auszuwählen. Schnelle und einfache Methoden ist auf Kosten der Präzision und Genauigkeit, vorzuziehen, da die iterative experimentelle Design-Strategie experimentelle Ungenauigkeit toleriert. Jedoch müssen die endgültigen Ergebnisse gegen hinreichend präzise und genaue Produkt Quantifizierungsmethoden überprüft werden, die möglicherweise etwas komplizierter. In der Regel die sorgfältige Auswertung und Entscheidungsfindung über die Abläufe erfordern Aufwand am Anfang der Studie, aber auf lange Sicht auszahlen, nachdem Routineverfahren etabliert haben.

Es wird dringend empfohlen, eine Referenz-Experiment, die ist im Vergleich zu allen Experimenten bei der Optimierung zu definieren. Das heißt, sind angewandte mittlere Komponente Konzentrationen und die gemessene Leistung durch Division durch Referenzwerte normalisiert. Auf diese Weise jede angewendet und Messwert kann als X-Fach des Referenzwerts interpretiert werden. Um Konto Variationen zwischen den Platten zu berücksichtigen, werden fünf Referenz Versuche auf jeder Platte durchgeführt. Der Mittelwert der gemessenen Ergebnisse dient der Normalisierung.

Es kann in der Regel nicht garantiert werden, dass die entwickelten Medium auch optimal für andere Stämme. Aber werden das bessere Medium höchstwahrscheinlich auch geeignet für den Anbau von Ausdruck Stämme mit kleinen genetischen Unterschiede, z.B.bei der Herstellung Enzymvarianten mit Aminosäure Substitutionen Mutagenese Studien (entnommen Obwohl sogar einzelne Punktmutationen Effekt Zellstoffwechsel und heterologen Expression Leistung⁵⁵^,⁵⁶beschrieben wurden). In diesem Fall kann die vorgestellte Protokoll ein erster Schritt, gefolgt von Protokollen für Hochdurchsatz Ausdruck Vorführungen⁵⁷. Wenn das Protokoll für mittlere Entwicklung mit nachfolgenden Scale-Up auf fed Batch Kultivierungen verwendet wird, sollte das optimale Medium für die entsprechenden Bioprozess-Bedingungen geprüft werden, das screening-Kampagnen auf die Microscale Klon identifiziert verschiedene top Darsteller für unterschiedliche Fütterung Strategien und Anbau Medien⁵²^,⁵⁸. Darüber hinaus können die eingeführten KriKit³⁶ in der Regel zu verbesserte ganzheitliche Bioprozess-Optimierung beitragen.Erst kürzlich wurden die Werkzeug-Fähigkeiten erweitert, um auch Multi-objektiven Optimierung⁴⁰, unterstützen was wichtig für die Optimierung der beiden vor- und nachgelagerten Prozesse⁵⁹^,⁶⁰sein kann.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die wissenschaftlichen Aktivitäten der Bioökonomie Science Center wurden durch das Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung im Rahmen des NRW-Strategieprojekt BioSC (Nr. 313/323-400-002 13) finanziell unterstützt. Die Autoren danken dem Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen und der Heinrich Heine Universität in Düsseldorf für ein Stipendium für Lars Freier innerhalb der CLIB-Graduate Cluster industrielle Biotechnologie. Weitere Fördermittel erhielt von der Enabling Spaces Programm “Helmholtz-Innovation Labs” der deutschen Helmholtz-Gemeinschaft, die “mikrobielle Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab” zu unterstützen.

Materials

BioLector	m2p-labs	G-BL-100
Flowerplate	m2p-labs	MTP-48-BOH	For cultivation in the BioLector device
Sealing foil	m2p-labs	F-GP-10	Sterile sealing for Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	n/a	Freely available, MATLAB installation required
Janus pipetting robot	Perkin Elmer	n/a	Includes "WinPrep" software installation
12-column deep well microplate	E&K Scientific	EK-2034	Container for medium stock solutions
96 well microplates, transparent, F-bottom	Greiner	655101	For Bradford protein assay
µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom	Greiner	655087	For flourescence measurement in cell-free supernatants
Pipette Research plus multi-channel pipettes	Eppendorf	n/a	Facilitates manual liquid handling with microplates
TruPAG Precast Gels	Sigma	PCG2002	For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
Bradford Reagent	Sigma	B6916
C. glutamicum pCGPhoD^Bs-GFP	n/a	n/a	Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

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Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

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