Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Johannes Hemmerich; Lars Freier; Wolfgang Wiechert; Eric von Lieres; Marco Oldiges

doi:10.3791/56234

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Bioengineering

Protocolo genérico para la optimización de la producción de proteína heteróloga utilizando tecnología Microbioreactor automatizada

Published: December 15, 2017

doi:

10.3791/56234

Johannes Hemmerich*^1,2, Lars Freier*^1,2, Wolfgang Wiechert^1,2,3, Eric von Lieres^1,2, Marco Oldiges^1,2,4

¹IBG-1: Biotechnology,Forschungszentrum Jülich, ²Research Center Jülich,Bioeconomy Science Center (BioSC), ³Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB),RWTH Aachen University, ⁴Institute for Biotechnology,RWTH Aachen University

Summary

Este manuscrito describe un enfoque genérico para el diseño a medida de los medios de cultivo microbianos. Esta opción está activada por un flujo de trabajo iterativo combinando Kriging experimental diseño y microbioreactor tecnología suficiente rendimiento de cultivo, que se apoya en la robótica de laboratorio para aumentar la fiabilidad y rapidez en los medios de comunicación para manejo de líquidos preparación.

Abstract

Un negocio en biotecnología industrial con fábricas de la célula microbiana es el proceso iterativo de la cepa ingeniería y optimización de condiciones de bioprocesos. Un aspecto importante es la mejora del medio de cultivo para proporcionar un ambiente óptimo para la formación microbiana del producto de interés. Es bien aceptado que la composición de los medios de comunicación puede influir dramáticamente en desempeño de bioprocesos. Optimización del medio de nutrición se sabe para mejorar la proteína recombinante producción con sistemas microbianos y por lo tanto, este es un paso gratificante en el desarrollo de bioprocesos. Sin embargo, recetas de medios muy a menudo estándar se toman de la literatura, desde el diseño a medida del medio de cultivo es una tarea tediosa, que requiere tecnología de microbioreactor para el suficiente rendimiento de cultivo, análisis de producto rápida, así como apoyo por robotics lab para fiabilidad en pasos para manejo de líquidos. Además, avanzados métodos matemáticos son necesarios para analizar racionalmente los datos de medición y diseñar eficientemente experimentos paralelos como para alcanzar el contenido óptimo de la información.

La naturaleza genérica del protocolo presentado permite la adaptación fácil a equipo de laboratorio diferentes, otros hosts de expresión y proteínas blanco de interés, así como otros parámetros de bioprocesos. Además, otros objetivos de optimización como la tasa de producción de la proteína, rendimiento específico o la calidad del producto pueden ser elegidos para caber el alcance de otros estudios de optimización. La caja de herramientas aplicadas de Kriging (KriKit) es una herramienta general para el diseño de experimentos (DOE) que contribuye a la optimización de bioprocesos holística mejorada. También soporta la optimización multi-objetivo que puede ser importante en la optimización de procesos upstream y downstream.

Introduction

La tecnología genética recombinante moderna permite el amplio uso de enzimas técnicas para diversas aplicaciones en la industria farmacéutica, animal alimentación, química orgánica y¹^,²^,³de procesamiento de alimentos. La producción de enzimas técnicas en grandes cantidades es un tema importante para la biotecnología industrial y para la producción de proteína recombinante optimizado y tanto la tensión y es necesario ingeniería de bioprocesos. Para la generación de cepas de producción eficiente ingeniería bibliotecas genéticas diferentes están disponibles, por ejemplo, para equilibrado gene expresión⁴ o secreción creciente eficiencia⁵.

Glutamicum del Corynebacterium es un productor importante de aminoácidos en la escala industrial⁶^,⁷ y representa un huésped atractiva expresión no convencional de la producción secretora de proteínas recombinantes⁸ ^,⁹. El general secretores (s) y la vía de desplazamiento del gemelo-arginine (Tat) están presentes en C. glutamicum y se aplicaron con éxito para la secreción de la proteína recombinante¹⁰. Amplia experiencia en ingeniería de bioprocesos en producción de aminoácidos a escala industrial, así como la capacidad de secretar proteínas g/L cantidades¹¹ y gran robustez sobre inhomogeneidades de bioprocesos encontradas gran escala cultivos¹²^,¹³, hacen de C. glutamicum un organismo plataforma prometedora para la producción de secreción de proteínas heterólogas a escala industrial.

Optimización del medio de nutrición se sabe para mejorar la producción de proteínas recombinantes con sistemas microbianos¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ y por lo tanto, el ajuste del medio de la composición es un paso gratificante en bioprocesos y desarrollo con respecto a la productividad óptima¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. Intenso trabajo de investigación sobre la aplicación de placas de microtitulación (MTPs) para cultivo microbiano²²^,²³^,²⁴ allanó el camino para el desarrollo y diseño del MTPs para cultivo microbiano²⁵ ^,²⁶ y el desarrollo de sistemas de microbioreactor basados en MTP (MBR) con monitoreo en línea y ambiental control de²⁷^,²⁸. MBRs permiten un aumento significativo en el rendimiento de cultivo experimental. Además, existen sistemas MBR derivados de otros tipos de biorreactores, por ejemplo, columnas de burbujas o de tanque agitado reactores, bioprocesos microbianos optimización²⁹^,³⁰^,³¹^, ³².

En general, estudios de optimización se benefician de mayor rendimiento experimental, que se convierte en aún más potente en combinación con metodologías de DOE, ejemplo, a evaluar las interacciones entre las variables de diseño o reducir espacios de búsqueda multidimensional. En consecuencia, el uso combinado de los sistemas MBR, automatización de laboratorio y DOE ha demostrado para ser un método eficaz en biotecnología⁸^,¹⁶^,³³^,³⁴^,³⁵.

Un protocolo para la optimización de los medios de comunicación se presenta la combinación de automatización de laboratorio de vanguardia, tecnología MBR con monitoreo de procesos en línea y diseño experimental/análisis de Kriging basado en los datos. La metodología de Kriging se implementa en un Toolbox de MATLAB (“KriKit”) que puede ser descargado y utilizado sin cargo³⁶. Como ejemplo de aplicación, maximización de la producción de proteína (GFP) secretores de ﬂuorescent verde con C. glutamicum se muestra mediante la optimización de la composición del medio mínimo CgXII. Título GFP fue elegido como el objetivo de optimización puede cuantificarse fácilmente y se aplica extensamente como proteína modelo para estudios en MBR sistemas³⁷^,³⁸^,³⁹.

El marco presentado se divide en cuatro pasos, que se ilustran en la figura 1. Los pasos son indicados por rectangulares y corresponden a las secciones del protocolo. El primer paso (figura 1A) es definir los objetivos del proyecto y determinar los métodos necesarios. La combinación de metodologías DOE, tecnología MBR y automatización de laboratorio permite un mayor rendimiento experimental que exige el procesamiento de datos de gran alcance. El segundo paso (figura 1B) tiene como objetivo detectar las variables de diseño (es decir, medio componentes) con alta influencia en el objetivo de la optimización. Esto conduce a un número reducido de variables de diseño de interés. El tercer paso (figura 1) comprende una optimización iterativa para una investigación más detallada de la relación funcional entre las variables de diseño restante y el objetivo de interés. Utilizando el conjunto de datos sucesivamente ampliado, se aplica el método de Kriging para predecir los resultados experimentales en lugares. El ciclo iterativo se detiene tan pronto como el modelo Kriging predice un óptimo o meseta con suficiente exactitud. Los resultados se verifican en el cuarto paso (figura 1), a partir de un análisis de sensibilidad adicional alrededor de la óptima identificada. Si inicialmente, se encuentran componentes insensibles a ser insensible también en la región óptima, es razonable asumir que esto es cierto durante el procedimiento de optimización iterativo en el tercer paso. Luego, se recomienda verificar los resultados de optimización mediante la aplicación de métodos, ortogonales, como un ensayo de actividad o SDS-Page.

La naturaleza genérica del protocolo presentado permite la adaptación fácil a equipo de laboratorio diferentes, otros hosts de expresión y proteínas objetivo de elección, así como bioprocesos más variables como valor de pH, temperatura cultivo.Además, otros objetivos de optimización como la tasa de producción de la proteína, rendimiento específico o la calidad del producto pueden ser elegidos para caber el alcance de otros estudios de optimización.

Figura 1 : Flujo de trabajo de estudio optimización. Las cajas cuatro marco corresponden a las secciones del Protocolo, “Concebir el estudio y definición de métodos” (sección 1), “Análisis de sensibilidad” (sección 2), “Iterativo optimización” (sección 3) y “Validación” (sección 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. concebir el estudio y definición de métodos (figura 1: parte A) ¿Nota: Definición del objetivo de optimización: es un curso de tiempo de formación de producto necesario o es sólo un intervalo de tiempo limitado o incluso un punto de tiempo fijo relevante? También, considerar problemas potenciales tales como estabilidad, esfuerzo de cuantificación analítica, o el tiempo de cultivo. Como alternativa al título final de la proteína, se podrían considerar otros objetivos tales como biomasa o cultivo. Biomasa se refleja en el rendimiento de biomasa producto específico, mientras que el tiempo de cultivo se refleja en el rendimiento de space time. Calidad del producto (mínimo) también podría ser un objetivo. Optimización multi-objetivo se requiera en determinadas situaciones, como se explica en otra parte40. En este estudio, título GFP después de 17 horas de cultivo fue elegido como el objetivo de la optimización. Fluorescencia de GFP puede seguirse en línea, utilizando los equipos disponibles en este estudio, que simplifica considerablemente la determinación de la concentración de la proteína modelo.Nota: Definición de los parámetros a optimizar: CgXII medio consiste en componentes individuales 1641 e investigar todo esto en un diseño factorial completo resultaría en 2 65.000 experimentos ≈ de16 . En consecuencia, el espacio de búsqueda debe reducirse de forma racional y basada en la experiencia. La selección de los componentes de los medios de comunicación considerados para la optimización se puede apoyar por el conocimiento experto disponible o los datos de la literatura. Decidir que las concentraciones del componente medio no deben ser variadas. Para la optimización del medio de CgXII, fueron elegidos los siguientes componentes para fijarse: La glucosa se fija en 10 g/L. Esta optimización es trivial porque más glucosa rinde más GFP secretoras de biomasa. Se trataba de revelar efectos medio no intuitiva. 3-(N-morfolino) ácido propanesulfonic (MOPS) se fija en 42 g/L. Esto proporciona suficiente capacidad de almacenamiento en búfer durante el cultivo por lote y no se metaboliza.Nota: La adición de MOPS en esta concentración final asegura un valor inicial de pH 7, incluso con los volúmenes diferentes de las otras soluciones stock agregados, que no están a pH 7. Sin embargo, para excluir cualquier desviación a partir de los valores de pH, el pH debe medirse por medio composiciones donde se agregan todas las soluciones stock a su volumen máximo y mínimo. KH2PO4 y K2HPO4 se fijan en 1 g/L cada una. Proporcionan capacidad de almacenamiento en búfer también y servir como una fuente de fosfato. Urea se fija en 5 g/L. Esto sirve como una fuente de nitrógeno básico y agente estabilizador de pH, suficiente para evitar la limitación de N. La biotina está fijada en 0,2 mg/L. C. glutamicum ATCC13032 auxotrófica para la biotina. Ácido protocatechuico (PCA) se fija en 30 mg/L. Sirve como un agente quelante de hierro. Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) se fija en 100 μm. Induce la expresión del gen gfp . Seleccione alta y baja las concentraciones de los componentes de los medios de comunicación para exámenes de sensibilidad inicial. Aquí, se eligieron los componentes de tres grupos típicos de los componentes de los medios de comunicación. Las concentraciones bajas y altas investigadas para cada componente son: Fuente de nitrógeno estándar: (NH4)2SO4 (8-32 g/L); la variación de la fuente de nitrógeno fue divulgada para ser prometedor para la optimización de biomasa específica GFP señal8. Oligoelementos: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7 H2O (0.4-1.6 mg/L), CuSO4 ∙ 5 H2O (125-501 μg/L), NiCl2 ∙ 6 H2O () 8-32 μg/L) y CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 μg/L). La composición de elementos traza es heredada de la primera publicación de CgXII media41. Además, Na2MoO4 ∙ H2O (26-104 μg/L) y H3BO3 (20-80 μg/L) fueron incluidos como elementos traza, como se utilizan en una variante publicada de CgXII medio42. Elementos macro: MgSO4 ∙ 7 H2O (0.2-0.4 g/L), CaCl2 ∙ 2 H2O (21.2 5.3 mg/L). Éstos fueron encontrados entre otros cationes divalentes para mejorar producción de GFP secretor en otro estudio14, donde C. glutamicum cepa R fue utilizado con un fondo medio diferente y el péptido de señal CgR0949 Tat. Preparación de materiales y procedimientos de definiciónNota: Se recomienda definir y fijar los métodos experimentales a un nivel detallado. Esta normalización asegura que diferentes resultados pueden rastrearse a variabilidad biológica intrínseca o diferentes composiciones medianas.Nota: Los medios de comunicación común soluciones: preparar soluciones individuales para todos los investigados componentes de los medios de comunicación. Preparar a las poblaciones altamente concentradas para permitir la dilución de diferentes volúmenes para todos los componentes. Esto significa que después de combinar todas las soluciones stock a su volumen más alto según el plan de diseño, esto no puede exceder el volumen de cultivo final, CF. párrafo “Generación de lista de pipetas solución stock medio” paso 1.3.3. Si resulta de la adición de una solución altamente concentrada en un volumen muy bajo adición, por ejemplo, < 1/100th del volumen de cultivo final, diluir la solución madre en consecuencia. Por ejemplo, en este estudio se definió un volumen de pipeteo de menos de 10 μL para ser factible. Por lo general, se concentra tan alto como oligoelemento soluciones 1,000fold con respecto a la concentración final de estándar en el medio. Es ventajoso para concentrar los componentes de los medios de comunicación como múltiplos (doble X) con respecto a las concentraciones en la receta de referencia. Al hacerlo, se evitan inviable volúmenes de fracciones decimales. Recetas detalladas para todas las soluciones stock de CgXII medio figuran en el documento complementario. Banco de trabajo (WCB)Nota: Para cada experimento de crecimiento, se utiliza un WCB alícuota. Si necesitan más alícuotas, medio uso 100 mL cerebro corazón infusión (BHI) 1.000 mL desconcertado agitar matraces o inocular varios frascos de shake, que son antes de la adición de solución de glicerol. Preparar solo colonias de la cepa de expresión recombinante C. glutamicum pCGPhoDBs- GFP43 en placas de agar (BHI polvo de 37 g/L, agar 20 g/L, kanamicina 25 mg/L). Material de la galjanoplastia puede provenir de transformación fresco o de una alícuota criopreservada.Incubar a 30 ° C hasta la aparición de colonias individuales; Esto tiene generalmente uno o dos días. Inocular una cultura shaker de frasco (medio 50 mL BHI con kanamicina 25 mg/L, desconcertado matraz de 500 mL, 250 rpm, 25 mm diámetro de agitación, 30 ° C) con el material de la Colonia e incubar durante la noche (aproximadamente 16 h). Un volumen de suspensión celular resultante se combinan con un volumen de solución de glicerol estéril de 500 g/L y distribuir en alícuotas de 2 mL en viales estériles de criopreservación. Tienda a-80 ° C. Protocolo de cultivo de MBRNota: Para el sistema de MBR BioLector empleado en este estudio, dispersada luz (biomasa) y la fluorescencia de GFP son las mediciones de intensidad, que necesitan un cierto valor de ganancia asignado. La mayor ganancia, mayor será la señal óptica se amplifica; Esto es, también, por qué la luz dispersada y fluorescencia se miden en unidades arbitrarias (a.u.). Determine los valores de ganancia adecuado para la detección de la GFP en experimentos preliminares, junto con temblor de frecuencia y volumen para evitar la limitación de oxígeno en altas concentraciones de biomasa en etapas posteriores del proceso de llenado y biomasa. Las condiciones de cultivo empleadas (“Flowerplates”, es decir, 48-bien MTPs, temblor de frecuencia de 1.200 rpm, volumen de 1000 μl, glucosa 10 g/L como fuente de carbono principal de relleno en forma de flor) garantiza oxígeno cultivos ilimitados. Para velocidades de transferencia de oxígeno máxima resultante de otras combinaciones de volúmenes de relleno y sacudiendo las frecuencias en MTPs 48-bien en forma de flor, hojas de datos del proveedor están disponibles. También, defectos de crecimiento de culturas individuales pueden ocurrir debido a cantidades bajas de sustratos secundarios (p. ej., nitrógeno, elementos traza). Por lo tanto, verificar las concentraciones de biomasa al final de los cultivos. En este estudio, se observaron sin efectos de tal crecimiento. Definir el protocolo de cultivo para el sistema MBR (“BioLector”) como sigue: Filterset 1: Biomasa, aumento de 14. Filterset 2: pH, ganancia está prefijada. Filterset 3: pO2, ganancia está prefijada. 4: GFP, obtener 80. Frecuencia de agitación: 1.200 rpm. Temperatura: 30 ° C. Tiempo de ciclo: 15 min. Tiempo del experimento: manual (cultivo no se detendrá automáticamente). Generación de lista de pipetas solución stock medioNota: Casi cualquier sistema de robot para manejo de líquidos son capaz de leer acciones pipeteo desde archivos externos. Básicamente, la información mínima necesaria es el volumen de transferencia y la posición de origen reactivo, así como el destino de cada uno representado por una posición de material de laboratorio en la cubierta robótica y una cavidad específica dentro del laboratorio. Sin embargo, deben considerarse la sintaxis diferentes para diferentes sistemas para manejo de líquidos. La figura 2 muestra una estructura de archivo de ejemplo para el sistema de pipeteo empleada en este estudio. Cuatro tipos de soluciones se pipetea en cada cultivo así: Stock de soluciones de componentes de los medios de comunicación que son variados (“Variación de existencias”). Agua para compensar diferentes volúmenes acumulativos de por encima de las poblaciones. Una solución madre (“Stock resto”) que contiene todos los componentes que son fijos. Esta solución puede estar compuesto de acciones con los diferentes componentes que son, por ejemplo, almacenados a diferentes temperaturas o esterilizado por métodos diferentes. Inóculo, que debe ser añadido como el último componente y poner sobre la mesa de trabajo justo antes de la adición para evitar la sedimentación de las células. Por cultivo, calcular los volúmenes para todos los componentes de los medios de comunicación según: El volumen a agregar para algunos Variación existencias tal vez cero, es decir, cuando se omite este componente específico. Revisar los volúmenes calculados V para los números adecuados. Incrementos de volumen pipeteado en medidas de volumen no deben ser demasiado pequeños. Si es necesario, ajustar las concentraciones de Variación de existencias. Por ejemplo, el mínimo volumen de pipeteo aquí fue definido como 10 μl, y el incremento mínimo fue definido como 5 μl. En general, estos volúmenes deben definirse en base a determinado experimentalmente y precisión el líquido usado manejo estación15,44. Calcular el volumen del Resto Stock que contiene los componentes fijos para todos los pozos como sigue: donde el volumen acumulado máximo de Variación de existencias se utiliza. Por lo tanto, calcular las concentraciones requeridas de los componentes fijos en la Acción del resto como sigue: Preparar el Resto Stock en consecuencia. Por cultivo, calcular el volumen de agua a ser agregado como sigue: Por cultivo del bien, una lista de todos los volúmenes que se agregará en el siguiente orden de adición: VH2O, VRestStock, V, VInok. Formato de la lista de pipeteo según las especificaciones de la estación, el manejo de líquidos como se muestra un ejemplo en la figura 2. Cultura de semilla, preparación de medios automatizados y comienzo de la cultura principal Crear un protocolo para el manejo de líquidos en robot. Ver figura 3 y figura 4 para un protocolo de ejemplo para un sistema de ‘Janus’, implementado en el software “WinPREP” correspondiente. El protocolo debe considerar los siguientes aspectos: Incluyen un suficiente tiempo de ejecución de la cubierta estéril antes de la preparación de los medios de comunicación. Incluyen una limpieza excesiva inicial y lavado de todas las puntas de pipetas y tubos. Elija envases de material de laboratorio apropiado para soluciones madre. Aquí, placas de pozos profundos con 12 columnas son adecuadas para el almacenamiento de Existencias variación, como todas las ocho puntas de pipetas pueden sumergir en un arreglo paralelo en las columnas bien. Esto acelera mucho de preparación de medios de comunicación. Si se utilizan tubos de 15 mL o 50 mL como depósitos, sólo una punta de pipeteo puede sumergir en él a la vez.Para otras poblaciones como el agua y Resto de Stock, se utilizan bebederos de 100 mL, como estas soluciones requieren de mayores volúmenes en total. Proporcionar un suficiente volumen total para cada solución madre compensar volúmenes de desechos, compensaciones de pipeteo de altura, etc. Introduzca un usuario del sistema antes de la etapa de inoculación, asegurando que este paso se lleva a cabo inmediatamente antes del procedimiento de cultivo de semilla. Preparar todas las soluciones stock de una manera estéril y tienda hasta su uso, en recipientes adecuados, por ejemplo, 15 mL estéril y tubos de ensayo de 50 mL. Esterilizar las placas de pozos profundo para el almacenamiento de la solución madre en una mesa de trabajo, por ejemplo, por limpiar con etanol al 70% y posterior secado en campana de flujo laminar. Iniciar el cultivo de semilla inoculando medio BHI de 50 mL que contiene kanamicina 25 mg/L con una alícuota de la WCB. Antes de la cultivación de MBR, preparar el inóculo fresco, vital crecimiento exponencialmente cultivos de semilla en una cantidad suficiente. Colocar material de laboratorio necesario todos en la mesa de trabajo de robótica y vierta soluciones en el laboratorio correspondiente. Iniciar el flujo de trabajo de robótica para la preparación de los medios de comunicación, para que el último paso (inoculación), se alcanza en el tiempo con el inicio de la cultura de la semilla. El tiempo total de ejecución del flujo de trabajo robótica debe ser evaluado previamente. Aquí, el tiempo de ejecución total era aproximadamente 1,5 h. Muestra de la cultura de la semilla después de aproximadamente 2 h, cada hora, para controlar el crecimiento de la densidad óptica (OD600). Después de aproximadamente 5 h, la cultura alcanza 3-4 OD600 y se utiliza para inocular los cultivos principales. Poner la cultura de la semilla en la mesa de trabajo de controlador líquido y seguir el protocolo de preparación de medios de comunicación. Sello de cultivo MTP después de la inoculación. Colocar el cultivo sellado MTP en el dispositivo BioLector y empezar el protocolo de cultivo previamente definidos. Desechar las soluciones stock restantes, según normas de bioseguridad en caso de necesidad y semilla de la cultura de la mesa de trabajo robótico. Limpiar el material de laboratorio reutilizable y empezar el protocolo de descontaminación líquido controlador. Cuantificación de productos y procesamiento de datos para el análisis Parar la cultura principal después de un tiempo de ejecución de 17 h. Transferir los datos de medición del dispositivo BioLector MBR a la computadora conectada con el paquete de software BioLection según manual de usuario del fabricante. Uso la “gestión de datos → transformar datos” función del paquete de software “BioLection” que acompaña el sistema MBR para convertir el archivo de datos en un formato de hoja de cálculo de fácil acceso. Copiar los datos de señal GFP para todo pozos de cultivo de la columna de marca de hora más cercana a 17 h. identificar señales de la GFP de los pocillos de cultivo de referencia y la media. Normalizar todo el restante señal GFP por la señal de referencia promedio. Cuantificar la concentración GFP utilizando métodos adicionales (si procede) Transferir las suspensiones celulares de todos los pocillos de cultivo en tubos de reacción prelabeled y obtener el sobrenadante libre de células después de la centrifugación durante 10 minutos a máxima velocidad utilizando una centrífuga de sobremesa. Transfiera 200 μL de cada sobrenadante libre de células en un negro MTP de 96 pocillos con fondo transparente, y leer la fluorescencia específica de la GFP a 488/520 nm utilizando un lector de microplacas apropiado. Normalizar la señal de GFP de todos los pozos con medio de cultivo de referencia, como en el paso 1.5.3.Nota: No se puede comparar las señales de fluorescencia de GFP absolutas de dispositivos de medición diferentes. Por lo tanto, las 5 cepas de referencia de todos los cultivos principales sirven como estándar interno. La mejora de la titulación GFP se puede expresar en relación con el estándar interno. Esto permite la comparación de los resultados de diferentes experimentos y diferentes métodos de cuantificación de GFP (ver a continuación dos pasos). Determinar el contenido de proteína de los sobrenadantes libres de células con protocolos estándar, por ejemplo, ensayo de Bradford o BCA. En combinación con los resultados del paso 2, es posible la determinación de un título específico de GFP de proteína.Nota: Después de la medición de la fluorescencia, use la muestra de esta microplaca. Utilizar pipetas de varios canales facilita enormemente los necesarios pasos para manejo de líquidos. Realizar una visualización de SDS-Page de sobrenadantes libres de células siguiendo protocolos estándar para comprobar que la mayoría del contenido de proteína de aumento es debido a la mayor secreción de GFP.Nota: SDS-Page es más laborioso que los métodos anteriormente mencionados, especialmente con una carga de alto. Para fines de verificación, es a menudo suficiente ejecutar que páginas de SDS de sobrenadantes libres de células de referencia medio y final optimización cultivos medio15. 2. sensibilidad análisis (figura 1: parte B). Nota: El objetivo de esta parte es identificar los factores importantes que tienen un efecto significativo en el objetivo. Elija un rango de concentración inicial de los componentes de los medios de comunicación. La composición media de referencia debe mentir dentro de los rangos de concentración elegido. Elegir una gama apropiada. Estos diseños se pueden encontrar en la literatura, por ejemplo, del e-manual de NIST/SEMATECH de métodos estadísticos (disponible en www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). El diseño elegido depende del número de componentes de los medios de comunicación de interés (aquí, 11) y el número de experimentos realizados (aquí, 32). En el ejemplo, diseño “2IV11-6” fue elegida que resulta en 32 experimentos y permite la estimación del efecto de aumento de la concentración de uno de los once componentes en el objetivo de interés. Para ser más específicos, los efectos principales no se confunden con interacciones factor pares. Pueden ser confundidos con interacciones de orden superiores que son, sin embargo, probablemente no significativo. Utilizar los pozos restantes (aquí, 16) para realizar varias repeticiones con el medio de referencia para evaluar la reproducibilidad del proceso. Repeticiones deben transmitirse igualmente sobre la placa para descubrir efectos posicionales. El valor medio de la salida de medida de los experimentos de referencia se utiliza para la normalización. Es decir, cada medida salida del análisis de sensibilidad se divide por el valor medio de la salida de referencia. Calcular las principales y si es posible los efectos combinatorios utilizando software estadístico apropiado. El diseño clásico del experimento se basa en una aproximación polinómica45. Por ejemplo, el mvregress de función MATLAB se puede utilizar para la estimación de los coeficientes del polinomios.La función mvregress es parte de la estadística y la caja de herramientas de aprendizaje de máquina. Identificar los efectos relevantes de los diversos componentes de los medios de comunicación en el objetivo mediante una prueba t. En el ejemplo, NH4+ tiene un efecto negativo significativo y Ca2 + y Mg2 + mostrar los efectos positivos más fuertes (figura 5). Porque señal GFP fue normalizado, los coeficientes representan el cambio relativo promedio de la señal de la GFP al aumentar la concentración de lo componente en particular de su valor central, , a su valor máximo. Componentes fijos sin un efecto relevante están en su valor de referencia durante la optimización. 3. iterativo optimización (figura 1: parte C) Nota: la herramienta MATLAB KriKit fue utilizado para la interpretación y análisis de datos estadísticos36. KriKit permite al usuario construir un modelo basado en datos de Kriging. Este modelo Kriging predice la relación funcional entre los componentes de los medios de comunicación y el objetivo. También proporciona información sobre la incertidumbre de la predicción. Incertidumbre alta indica datos ruidosos o densidad de datos insuficientes. DOENota: Nuevos experimentos están diseñados iterativamente, basado en los resultados de la ejecución anterior. En la primera iteración, diseñar nuevos experimentos para la investigación detallada de los componentes de los medios de comunicación identificados de interés. Resultados experimentales de la sección 2 no pueden ser transferidos a la optimización iterativa (sección 3), como las concentraciones de componentes sin efecto relevante ahora se fija al valor de referencia respectivos. Por lo tanto, los ensayos en el análisis de sensibilidad y optimización iterativa no son comparables. De lo contrario, siga el esquema que se ilustra en la figura 1, marco de la “Optimización iterativo”. Si el potencial óptimo se encuentra dentro del rango de concentración definida, nuevos experimentos se diseñan utilizando el mejoramiento esperado40,46. El diseño experimental basado en la mejora prevista está integrado en la caja de herramientas KriKit. Si el óptimo se encuentra en el límite, ampliar el intervalo de concentraciones. Realizar experimentos en los puntos de la muestra diseñada según métodos experimentales definidos en la sección 2. Análisis estadístico Construir un modelo de Kriging utilizando los datos combinados de todas las iteraciones, incluyendo el actual. Investigar el modelo de salida de visualización utilizando las herramientas integrales de KriKit (interpolación 2/3D, análisis de la película, detección de trama, etc.). Si un área óptima se calculó con precisión suficiente, dejar de optimización. Si no, continúe con el paso 3.1.Nota: La figura 6 ilustra la optimización iterativa para el estudio de la prueba. El rango de concentración fue ampliado sucesivamente hasta una meseta fue encontrada (iteración 1-6). La séptima iteración fue utilizada para explorar los límites más detalladamente. 4. verificación de resultados (figura 1: parte D) Nota: Después de terminar la optimización iterativa, las hipótesis iniciales que deba comprobarse la validez. Rehacer el análisis de sensibilidad (sección 2) para la composición óptima del medio. Es decir, las concentraciones de los componentes que se investigan en la figura 1 (parte C) están fijadas sus valores óptimos. Las concentraciones de los otros componentes son variadas según una gama apropiada.Nota: Resultados similares en ambas proyecciones indican que los niveles de concentración de los componentes investigados no alteran el efecto de los otros componentes. Si la investigación muestra diferencias significativas en los resultados de la parte B, componentes con efecto cambiado se deben agregar a la piscina de componentes investigados y en la parte C debe repetirse. En el caso de medición indirecta (por ejemplo, fluorescencia como indicador para la concentración del producto), aplicar métodos de medición ortogonales (p. ej., análisis de la actividad, Bradford o cuantificación de proteína BCA, SDS page) para confirmar el cambio en el objetivo de interés mediante la comparación de los resultados del medio de referencia y el medio optimizado15.

Representative Results

Se aplicó el protocolo introducido para maximizar la concentración de GFP secretada. Específicamente, el título GFP después 17 h de cultivo fue elegido como el objetivo de la optimización. Detección en línea de la fluorescencia de GFP permite cuantificación simple producto. Sin embargo, la normalización de la señal GFP con los datos de un cultivo de referencia es indispensable para asegurar la comparabilidad de los resultados y la reproducibilidad. Se realizó una selección previa de los componentes de los medios de comunicación de manera racional como se describe en la sección 1. Los experimentos fueron realizados siguiendo las instrucciones de la sección 1: se definieron los parámetros de los procedimientos de laboratorio húmedo para el estudio entero asegurando consistencia y reproducibilidad de los resultados. Como se describe en la sección 2, se realizó una revisión inicial para identificar los componentes relevantes que muestran un impacto significativo en el objetivo de la optimización para el estudio adicional y más detallado. El sistema MBR basado en MTP permite 48 experimentos a realizar en paralelo. Teniendo en cuenta el máximo número posible de experimentos paralelos en un MTP (48) y el número total de marcas (11) componentes de los medios de comunicación el 2IV11-6 fraccional del diseño una elección apropiada. Este diseño experimental comprende 32 experimentos y permite la estimación del efecto principal para cada uno de los componentes de los medios de comunicación investigados. Los pozos restantes del cultivo (16) fueron utilizados para múltiples repeticiones de experimentos con el medio de referencia para evaluar reproducibilidad y efectos posicionales. Es decir, cada experimento se lleva a cabo una vez (sin repeticiones), excepto las de la experiencia de referencia (cinco repeticiones). La tabla 1 resume los resultados de los análisis de proyección. En el rango de concentración considerado, variando la mayoría de los componentes de los medios de comunicación no muestran un efecto notable sobre el objetivo. Componente NH4+ muestra un fuerte efecto negativo, mientras que el Ca2 + y Mg2 + muestran la más fuerte tendencia positiva. El efecto de Mg2 + no es significativo para la gama actual de concentración pero podría ser para un rango más amplio de concentración. En consecuencia, se decidió omitir NH4+ del medio y a investigar el efecto de Ca2 + y Mg2 + en experimentos adicionales. Sección 3 describe el procedimiento de optimización iterativo que se utiliza para maximizar la señal de la fluorescencia de GFP y variando las concentraciones de Ca2 + y Mg2 +. En la iteración 1, se probó la hipótesis que NH4+ puede omitirse. El rango de concentración de Ca2 + y Mg2 + se adoptó a partir del análisis de la proyección. La concentración mínima de NH4+ se establece en cero y la máxima concentración se adoptó desde el experimento de la proyección. En los siguientes experimentos, las concentraciones del componente se distribuyeron sobre un 3 x 3 x 3 rejilla dentro del rango de concentración definida, dando por resultado 27 experimentos. Durante los cultivos, se incluyeron cinco repeticiones de medio de referencia que sirve como estándar interno y para garantizar que ningún efecto posicional sobre el MTP se produjo. Para los restantes 16 pozos, las concentraciones de NH4+, Ca2 +y Mg2 + se distribuyeron al azar dentro de los rangos dados. Figura 5 A visualiza los resultados de las primeras iteraciones. Rótulos de los ejes se refieren a las concentraciones de componentes utilizadas en el medio original de referencia, indicada por x Ref. Las superficies azules representan las interpolaciones de Kriging que se calcularon con el software KriKit. Cada superficie se asocia con un nivel de concentración relativa de NH4+ (azul oscuro: 0 x Ref, cuadriculado: 1 x Ref, celeste: 2 x Ref). Esta representación visual revela que es favorable a omitir NH4+. Superficies de interpolación también muestran los efectos positivos de Mg2 + y Ca2 +, como todo lugar de planos con el aumento de las concentraciones. Basado en los resultados de la iteración 1, se decidió ampliar la concentración rango de Ca2 + y Mg2 + por la duplicación de las concentraciones máximas y cambiando la ventana de diseño experimental a la esquina superior derecha, ver figura 5 B. dentro de este rango, las concentraciones fueron distribuidas en una cuadrícula de 6 x 6. Esto asegura una distribución uniforme en el rango de concentración total, conduce a resultados óptimos de interpolación de Kriging. Figura 5 B muestra el diagrama de interpolación de Kriging basado en los datos combinados se mide en dos iteraciones (puntos rojos y amarillos cuadrados). Para ambos, Ca2 + y Mg2 +, sigue el efecto positivo del aumento de sus concentraciones. En consecuencia, el procedimiento se repitió al duplicar la concentración máxima y por lo tanto, la ventana de diseño experimental se trasladó a explorar los límites de la esquina superior derecha. Figura 6 A ofrece una visión general del procedimiento de optimización restantes. El análisis del conjunto de datos recogido hasta la iteración 3 reveló que una limitación del efecto positivo de Mg2 +, es decir, una concentración óptima gama de Mg2 + se identificó. Por lo tanto se decidió ampliar el rango de concentración sólo para Ca2 + (iteración 4). Este procedimiento se repitió dos veces (iteración 5 y 6) hasta que se encontró una saturación de la señal de la GFP. Esta saturación se explica por la precipitación de sales de Ca para las concentraciones aplicadas de Ca2 +, que no están disponibles para las células. Como los resultados experimentales son siempre perturbados por el ruido, la interpolación Kriging resultante aparece irregular e inspección visual podría conducir a conclusiones falsas. Sin embargo, el rango de concentración óptimo de componentes de los medios de comunicación para la señal saturada de GFP se puede identificar confiablemente con el estadístico z -test, que también se implementa en KriKit. El z -test utiliza directamente la intrínseca información estadística proporcionada por el Kriging método, es decir, valores de predicción y las incertidumbres de la predicción. Figura 6 B muestra la meseta identificada, como determinado y visualizado utilizando el toolbox KriKit.KriKit herramientas libremente disponibles36 y viene con un tutorial detallado que explica cómo utilizar sus características. Si se encuentran más de dos componentes relevantes, visualización 3D llega a su límite. KriKit proporciona otros métodos posibles de representación visual como películas o “proyección de parcela”. Si el potencial óptimo se encuentra dentro del rango de concentración definida, nuevos experimentos se diseñan automáticamente utilizando el mejoramiento esperado40,46. El diseño experimental basado en la mejora prevista está integrado en la caja de herramientas KriKit. Información más detallada puede encontrarse en la documentación del software. Después del procedimiento iterativo, se realizó una verificación de los resultados, como se describe en la parte D. La validez de la hipótesis iniciales se comprobó mediante la realización de un análisis de sensibilidad adicional utilizando la óptima composición media. Es decir, todos los componentes de los medios de comunicación inicial de interés fueron variados, pero Ca2 + y Mg2 + fijaron a sus niveles de concentración óptima. En este estudio, las concentraciones óptimas = 32 x Ref y = 6.8 x Ref fueron elegidos. La tabla 2 muestra los resultados de la evaluación de validación. Similar a la sensibilidad inicial de cribado (CF. tabla 1), NH4+ todavía tiene una influencia negativa importante y efectos restantes son aún insignificantes. Debido al fácil acceso, la señal de la fluorescencia de GFP de la suspensión del cultivo se utilizó para cuantificar la concentración extracelular de GFP durante todos los experimentos. Por razones de verificación, la fluorescencia de GFP fue validada contra otras medidas. Porque GFP es secretada a través de la vía de Tat, la señal de fluorescencia no puede discriminar entre intra – y extracelular GFP. Así, los cultivos fueron reproducidos utilizando el medio de referencia y el medio optimizado. Además de la medición de la fluorescencia de los sobrenadantes libres de células de cultivo, contenido de proteínas se cuantificó por el ensayo de Bradford y (semi)-mejoramiento cualitativo de la GFP visualizado por SDS-Page15. Todas las mediciones resultantes señales aproximadamente se duplicó para cultivos con medio optimizado en comparación con el medio de referencia y validado los aproximadamente 100% mejoramiento de rendimiento de secreción del medio optimizado. En consecuencia, fluorescencia específica de la GFP de suspensión de cultivo se puede considerar una métrica adecuada para el objetivo de la optimización, es decir, la concentración extracelular de GFP. Figura 2 : Captura de pantalla de la lista de pipetas de volumen para análisis de sensibilidad. Entradas en la primera columna asignan un identificador único para todos los volúmenes de una fila; Este identificador es el MTP bien número de cultivo objetivo MTP en la mesa de trabajo de controlador líquido, CF. C figura 4. Columnas restantes codifican volúmenes para diferentes soluciones (“Sln-01” a “Sln-15”) para se pipetea. El volumen acumulado de una fila se corresponde con el volumen de cultivo final del bien. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Captura de pantalla del software de control “WinPREP” para manejo de líquidos. Izquierda: Ordenó por filas los comandos, incluyendo un comando de transferencia para cada solución madre a se pipetea. Antes el comando final para la adición de inóculo, se inserta un prompt de usuario para garantizar que la cultura de la semilla se coloca en la mesa justo a tiempo. Derecha: Esquema de la mesa de trabajo, incluyendo el laboratorio fuente para variación de existencias (dos placas de pozos profundos con 12 pozos de columna), el canal de reactivo Stock resto, inóculo, agua y el cultivo de objetivo de preparación de medios MTP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : Recopilación de capturas de pantalla detallada de configuración de uso de una solución madre. (A) sin envolver comando para el pipeteo de la acción de Fe. Fuente para laboratorio y fuente bien dentro están marcados en la mesa de trabajo por el marco de lectura y columna roja de la placa de la pozo profundo correspondiente. Laboratorio de destino y destino pozos dentro están marcadas por marco azul alrededor de los pozos azules del cultivo objetivo MTP. (B) vista de ejemplo detallado en la asignación de volúmenes para este paso (solución stock de Fe). Número de destinos se lee de la lista de pipeteo, que tiene 48. Los volúmenes de descarga para todos los pozos de destino para solución stock de Fe se encuentra en la columna 4 en la lista de pipeteo. Observe que la primera columna en la lista de pipeteo contiene identificadores y no volúmenes transferidos, véase la figura 2. (C) detalles en destino bien de numeración. Escrito en la fila #1 de la lista correspondiente de pipetear los volúmenes se pipetea en bien marcada como #1 y así sucesivamente. Pozos #01, #08, #41 y #48 corresponden a pozos A01, A08, F01 y F08 para la codificación alfanumérica, que también se imprime en la cultivación MTP sí mismo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5 : Detalla los resultados de la primera iteración. (A) interpolación Kriging basado en los datos experimentales de la iteración 1. Puntos rojos indican el conjunto de datos. Para la comparación, todas las superficies de interpolación tres estén superpuestas en una parcela (azul oscuro: 0 x Ref, cuadriculado: 1 x Ref, celeste: 2 x Ref). Una representación alternativa de los resultados puede encontrarse en otra parte15. (B) interpolación Kriging basado en los experimentos realizados en iteración 1 (puntos rojos) y la iteración 2 (cuadros amarillos).Partes de los datos presentados en esta figura han sido previamente publicados15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6 : Representación de los resultados de optimización iterativa recogidos. Kriging Final (A) modelo de predicción. (B) identificación estadística de zona óptima (rojo) basado en el estadístico z-test, que es proporcionado por KriKit. Cajas indican pasos sucesivos de diseño iterativo y ejecución de experimentos. Partes de los datos presentados en esta figura han sido previamente publicados15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Componente Valor medio del coeficiente normalizado Fe2 + -0,08 MN2 + -0,05 Zn2 + -0,21 Cu2 + -0,21 NH4+ -2.04 Ni2 + -0,11 Co2 + -0,10 MoO42- 0.03 BO33- 0.06 CA2 + 1.00 Mg2 + 0.45 Tabla 1: resultados de los análisis de sensibilidad. Valores del coeficiente que representa el efecto promedio al aumento de la concentración de componente de medios respectivos de su valor de centro hasta su valor máximo. Para diseños experimentales óptimos, como en la literatura estándar y había utilizado aquí, la desviación estándar representa directamente la variación experimental debido a la replicación del experimento de referencia. Valores del coeficiente fueron normalizados por el valor máximo (0.0422 para componente Ca2 +). Desviación típica Coeficiente normalizado y absoluta es de 0.54 y 0.0226, respectivamente. Componente Valor medio del coeficiente normalizado Fe2 + -1.00 MN2 + 1.00 Zn2 + -3.48 Cu2 + -0,52 NH4+ -15.95 Ni2 + 0.69 Co2 + -0.51 MoO42- -0.45 BO33- -1.11 Tabla 2: resultados de los análisis de sensibilidad final. Valores del coeficiente que representa el efecto promedio al aumento de la concentración de componente de medios respectivos de su valor de centro hasta su valor máximo. Como se utilizó un diseño experimental óptimo, la desviación estándar sólo depende de la variación experimental usando la composición medio optimizada. Variación experimental aumentó levemente en comparación con la variación usando el medio de referencia. Valores del coeficiente fueron normalizados por el valor máximo (0.0106 para componente Mn2 +). Desviación típica Coeficiente normalizado y absoluta es de 3.63 y 0.0385, respectivamente.

Discussion

La naturaleza genérica del protocolo presentado permite adaptaciones diferentes, por ejemplo, para el estudio de otros expresión microbiana anfitriones⁹^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^, ⁵¹, o para optimizar otras propiedades de la proteína diana, como los bonos de disulfuro o patrón de glicosilación. El protocolo también deba adaptarse a los equipos de laboratorio disponibles. La integración de un sistema MBR permite aumentar el rendimiento experimental, que permite grandes ahorros en el tiempo. Sin embargo, al reemplazar Biorreactores completamente instrumentadas y controlables por sistemas MBR, escalabilidad de resultados debe considerar⁸^,³⁷^,⁵²^,⁵³. El uso de modelos matemáticos y metodologías DOE ayuda a maximizar el contenido de información de datos de medición con respecto a los objetivos estudiados⁵⁴ eficiente planificación experimental y datos basados en el modelo de interpretación¹⁵.

Modificaciones al método
Junto al multiusos expandible robótica manejo de líquidos y sistemas como el utilizado en este estudio, cabe mencionar que existen varios sistemas disponibles comercialmente que son capaces de realizar esta tarea y pueden ser colocados dentro para manejo de líquidos menor de bancos de trabajo de flujo laminar. Si no existe ningún sistema de pipeteo automatizado, composiciones de diferentes medios según el plan DOE pueden realizarse mediante pipeteo manual utilizando pipetas individuales o múltiples canales. Puesto que la preparación manual es más propenso y requerirá trabajo altamente enfocado durante mucho tiempo, se recomienda preparar un menor número de composiciones de diferentes medios de comunicación.

Dependiendo de las capacidades del sistema MBR empleada, el correspondiente protocolo de cultivo variará. Por ejemplo, si no hay medición en línea de formación de biomasa está disponible, puede ser suficiente medir la concentración de biomasa después de la terminación del experimento de crecimiento. En combinación con monitoreo en línea del pH y oxígeno disuelto, que está implementado en varios sistemas MBR, la saturación del crecimiento puede ser determinada con seguridad. En principio, el crecimiento puede realizar experimentos en MTPs solo colocadas dentro sacudiendo incubadoras, sin el uso de un sistema MBR. En este caso, las condiciones de cultivo apropiado deben garantizarse: (1) cultivos de oxígeno limitado pueden evitarse utilizando MTPs con geometrías adecuadas, en combinación con adecuada agitación frecuencias y sacudiendo diámetros, por ejemplo, Plaza 96 o 24 profundo placas bien funcionaron a 1.000 rpm en pasos de 3 mm o en 250 rpm en pasos de 25 mm, respectivamente. Lo importante es menor las velocidades de transferencia de oxígeno máxima alcanzable, menor la fuente de carbono debe ser concentrada. Como se mencionó anteriormente, para este estudio, el uso de glucosa 10 g/L es conveniente evitar la limitación de oxígeno para las condiciones de cultivo empleadas; (2) muestras de las culturas MTP para la cuantificación de biomasa y producto deben reducirse al mínimo. Cada vez que el MTP se retira de la incubadora de agitación, transferencia de oxígeno será inmediatamente avería que puede resultar en condiciones de cultivo desfavorables; (3) en la opinión de los autores, no se recomienda el uso de lectores MTP como dispositivos de cultivo como estos dispositivos no fueron desarrollados para este propósito. Por ejemplo, agitación mecánica fueron construida para la mezcla ocasional de microplacas después de añadir el reactivo y por lo tanto, a menudo carece de robustez para tramos largos de duración continua agitación durante días. Por otra parte, suficiente entrada de potencia necesaria para cultivos microbianos no puede realizarse en estos lectores. La integración de lecturas de densidad óptica en breve intervalos requiere detener el movimiento de agitación, resultando en repetidos períodos de la limitación de oxígeno. Además, evaporación en dichos sistemas durante períodos de larga de la cultivación distorsionaran los resultados. Para más detalles sobre el tema sorprendentemente complejo sobre el uso de MTPs para cultivos microbianos, el lector es referido a la literatura citada²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶y referencias en esto.

Otras consideraciones
A pasos de optimización iterativo de acelerar, se aconseja seleccionar con cuidado el método analítico para la cuantificación del producto. Métodos rápidos y simples se debe preferir a costa de precisión y exactitud, como la estrategia de diseño experimental iterativo tolera imprecisión experimental. Sin embargo, los resultados finales deben ser verificados contra los métodos de cuantificación de producto suficientemente preciso y exacto que podrían ser más complicados. En general, una evaluación cuidadosa y toma de decisiones acerca de los procedimientos de estudio requieren esfuerzo al principio del estudio, pero pagarán a largo plazo, después de que se han establecido métodos de rutina.

Se recomienda definir un experimento de referencia que se compara a todos los experimentos durante la optimización. Es decir, el componente medio aplicado concentraciones así como salida medido se normaliza mediante dividiendo los valores de referencia. Esta manera, cada una aplicada y valor medido se puede interpretar como el x-fold del valor de referencia. Para tener en las variaciones de la cuenta entre las placas, cinco experimentos de referencia se realizan en cada plato. El valor medio de los resultados medidos se utiliza para la normalización.

Generalmente no se puede garantizar que el medio desarrollado también es óptimo para otras cepas. Sin embargo, el mejor medio es muy probable que también será apropiado para el cultivo de cepas de expresión con pequeñas diferencias genéticas, por ejemplo, cuando producir variantes de la enzima con solo aminoácido las substituciones obtenidos de los estudios de mutagénesis ( Aunque incluso mutaciones puntuales se han descrito para el metabolismo celular efecto y expresión heteróloga rendimiento⁵⁵^,⁵⁶). En este caso, el protocolo presentado puede ser un primer paso, seguido por protocolos de expresión de alto rendimiento proyecciones⁵⁷. Si se utiliza el protocolo de desarrollo medio con posterior escala a los cultivos fed-batch, el medio optimizado debe verificarse para las condiciones correspondientes de bioprocesos, clon campañas en la microescala de evaluación identificados diferentes top ejecutantes de diferentes estrategias de alimentación y cultivo medios⁵²^,⁵⁸. Además, el introducido KriKit³⁶ generalmente pueden contribuir a la optimización de bioprocesos holística mejorada.Sólo recientemente, las capacidades de la herramienta se ampliaron para apoyar también optimización multi-objetivo⁴⁰, que puede ser importante para la optimización de ambos procesos upstream y downstream⁵⁹^,⁶⁰.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Las actividades científicas del centro de ciencia de bioeconomía fueron apoyadas financieramente por el Ministerio de innovación, ciencia y tecnología en el marco de la Strategieprojekt NRW BioSC (núm. 313/323-400-002 13). Los autores agradecen a la Consejería de innovación, ciencia e investigación de Renania del Norte-Westfalia y la Heinrich Heine University Düsseldorf para una beca a Lars Freier dentro de la Biotecnología Industrial graduado de CLIB Cluster. Más financiación recibió del programa de espacios de activación “Laboratorios de innovación de Helmholtz” de alemán Asociación de Helmholtz para la “microbiana bioprocesos Lab – A Helmholtz laboratorio de innovación”.

Materials

BioLector	m2p-labs	G-BL-100
Flowerplate	m2p-labs	MTP-48-BOH	For cultivation in the BioLector device
Sealing foil	m2p-labs	F-GP-10	Sterile sealing for Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	n/a	Freely available, MATLAB installation required
Janus pipetting robot	Perkin Elmer	n/a	Includes "WinPrep" software installation
12-column deep well microplate	E&K Scientific	EK-2034	Container for medium stock solutions
96 well microplates, transparent, F-bottom	Greiner	655101	For Bradford protein assay
µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom	Greiner	655087	For flourescence measurement in cell-free supernatants
Pipette Research plus multi-channel pipettes	Eppendorf	n/a	Facilitates manual liquid handling with microplates
TruPAG Precast Gels	Sigma	PCG2002	For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
Bradford Reagent	Sigma	B6916
C. glutamicum pCGPhoD^Bs-GFP	n/a	n/a	Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

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Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

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