Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Johannes Hemmerich; Lars Freier; Wolfgang Wiechert; Eric von Lieres; Marco Oldiges

doi:10.3791/56234

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengineering

פרוטוקול גנרי עבור אופטימיזציה של ייצור החלבון Heterologous באמצעות טכנולוגיית Microbioreactor אוטומטיות

Published: December 15, 2017

doi:

10.3791/56234

Johannes Hemmerich*^1,2, Lars Freier*^1,2, Wolfgang Wiechert^1,2,3, Eric von Lieres^1,2, Marco Oldiges^1,2,4

¹IBG-1: Biotechnology,Forschungszentrum Jülich, ²Research Center Jülich,Bioeconomy Science Center (BioSC), ³Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB),RWTH Aachen University, ⁴Institute for Biotechnology,RWTH Aachen University

Summary

כתב יד זה מתאר גישה כללית לעיצוב בהתאמה אישית של טיפוח מיקרוביאלי מדיה. זה מופעל על-ידי זרימת עבודה איטרטיבי שילוב Kriging ניסיוני microbioreactor ועיצוב טכנולוגיה מבוססת על תפוקת טיפוח מספיקות, אשר נתמך על ידי מעבדת רובוטיקה כדי לשפר את האמינות ואת מהירות בנוזל טיפול מדיה הכנה.

Abstract

עסק הליבה בתחום הביוטכנולוגיה תעשייתי באמצעות מפעלי היצור מיקרוביאלי תא הוא תהליך איטרטיבי של זן הנדסה ואופטימיזציה של תנאי bioprocess. היבט אחד חשוב הוא השיפור של טיפוח בינוני כדי לספק סביבה אופטימלית עבור היווצרות מיקרוביאלית של המוצר עניין. זה מקובל גם כי ההרכב מדיה יכול באופן דרמטי להשפיע על הביצועים הכוללים של bioprocess. תזונה בינונית אופטימיזציה ידוע לשיפור חלבון רקומביננטי הייצור עם מערכות מיקרוביאלי, וכך זה הוא צעד מתגמלת בפיתוח bioprocess. עם זאת, לעיתים קרובות סטנדרטיים מדיה מתכונים לקוחים מתוך ספרות, מאז עיצוב בהתאמה אישית של המדיום הטיפוח-תרגול היא משימה מייגעת אשר דורש טכנולוגיה microbioreactor מספיק תפוקה של טיפוח-תרגול, ניתוח המוצר מהר, כמו גם תמיכה על ידי מעבדת רובוטיקה כדי לאפשר אמינות בנוזל טיפול צעדים. יתר על כן, שיטות מתמטיות מתקדמות נדרשות בהגיון ניתוח נתוני המדידה ועיצוב ביעילות בניסויים מקבילים כגון כדי להשיג את תוכן המידע אופטימלית.

הטבע כלליים של פרוטוקול הציג מאפשרת התאקלמות קלה ציוד מעבדה שונים, אחרים המארחים ביטוי של חלבונים היעד של עניין, כמו גם עוד יותר bioprocess פרמטרים. יתר על כן, ניתן לבחור ביעדים אחרים אופטימיזציה כמו קצב ייצור חלבון, תשואה ספציפי או איכות המוצר כדי להתאים את היקף לימודי קידום אתרים אחרים. ארגז הכלים Kriging יישומית (KriKit) הוא כלי כללי עבור עיצוב של ניסויים (DOE) אשר תורם bioprocess הוליסטית משופרת אופטימיזציה. הוא תומך גם אופטימיזציה אובייקטיבי שיכול להיות חשוב מיטוב תהליכים הן ויוצאת.

Introduction

בטכנולוגיה גנטית רקומביננטי המודרנית מאפשרת שימוש רחב של אנזימים הטכנית ליישומים שונים בתעשייה הפרמצבטית, מזון מן החי, כימיה אורגנית, אוכל עיבוד¹^,²^,³. הייצור של אנזימים טכני וכמויות הוא נושא מרכזי לביוטכנולוגיה תעשייתי, לייצור חלבון רקומביננטי ממוטבת, שניהם זן, bioprocess הנדסה דרוש. עבור הדור של זנים מהונדסים ביעילות הייצור, זמינים בספריות גנטיות שונות, למשל, עבור ביטוי גנים מאוזנת⁴ או הפרשת מוגברת יעילות⁵.

Corynebacterium glutamicum היא אחת היצרניות הגדולות של חומצות אמינו ב⁶^,בקנה מידה תעשייתי⁷ ומייצג מארח אטרקטיבי ביטוי בלתי קונבנציונלי לייצור הפרשה של חומרים⁸ ^,⁹. הפרשה כללית (שניות) והן מסלול טווין-ארגינין טרנסלוקציה (Tat) נמצאים ב- glutamicum ג ו הוחלו בהצלחה הפרשת חלבון רקומביננטי¹⁰. ניסיון רב בתחום הנדסת bioprocess בנוגע חומצת אמינו להפקה המשקל תעשייתי, כמו גם את היכולת להפריש חלבונים כמויות g/L¹¹ ועמידות מעולה בנוגע inhomogeneities bioprocess שנמצאו ב בקנה מידה גדול cultivations¹²^,¹³, להפוך glutamicum ג אורגניזם מבטיחים פלטפורמה לייצור חלבונים heterologous הפרשה את המשקל תעשייתי.

תזונה בינונית אופטימיזציה ידוע כדי לשפר את ייצור חלבון רקומביננטי עם מערכות מיקרוביאלי¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ , וכתוצאה מכך, ההתאמה של בינוני קומפוזיציה היא שלב מתגמלת bioprocess פיתוח ביחס פרודוקטיביות מיטבית¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. מחקר אינטנסיבי על היישום של לוחות microtiter (MTPs) עבור הטיפוח מיקרוביאלי²²^,²³^,²⁴ סלל את הדרך פיתוח ועיצוב של MTPs ב טיפוח מיקרוביאלי²⁵ ^,²⁶ ופיתוח של מערכות מבוססות MTP microbioreactor (MBR) עם ניטור מקוון וסביבתיים לשלוט²⁷^,²⁸. MBRs מאפשרים גידול משמעותי טיפוח ניסיוני תפוקה. חוץ מזה, מערכות ה-MBR הנובעות סוגים אחרים של ריאקטורים, למשל, אכסדרת בועות או טנק מנוער כורים, זמינים עבור חיידקים bioprocess אופטימיזציה²⁹^,³⁰^,³¹^, ³².

באופן כללי, מחקרים אופטימיזציה תועלת מוגברת תפוקת ניסיוני, אשר הופך להיות חזק יותר בשילוב עם מתודולוגיות DOE, כגון להעריך אינטראקציות בין עיצוב משתנים או להקטין רווחים החיפוש גבוה-ממדי. כתוצאה מכך, השימוש בשילוב של MBR, מעבדה אוטומציה מערכות DOE הוכיחה להיות שיטה חזקה ביוטכנולוגיה⁸^,¹⁶^,³³^,³⁴^,³⁵.

פרוטוקול עבור קידום אתרים במדיה מוצג שילוב של המדינה-of-the-art מעבדה אוטומציה, טכנולוגיית ה-MBR עם פיקוח על תהליך מקוון, תכנון ניסויים/ניתוח נתונים מבוססי Kriging. המתודולוגיה Kriging מיושם בארגז MATLAB (“krikit ב”) אשר ניתן להוריד שימוש ללא תשלום³⁶. כדוגמה היישום, מקסום של הפרשה ﬂuorescent ירוק ייצור החלבון (GFP) עם glutamicum ג מוצג על-ידי מיטוב ההרכב של CgXII בינונית מזערי. GFP כייל נבחר המטרה אופטימיזציה זה ניתן לכמת בקלות, זה מוחל נרחב כמו חלבון מודל במחקרים על ה-MBR מערכות³⁷^,³⁸^,³⁹.

המסגרת הציג מחולק ארבע מדרגות, אשר מומחשים באיור1. השלבים מסומנים באמצעות תיבת מסגרות ומתייחסים אליהם מקטעים של הפרוטוקול. השלב הראשון (איור 1 א’) הוא להגדיר את מטרות הפרוייקט וכדי לקבוע את שיטות נדרש. השילוב של DOE מתודולוגיות בטכנולוגיית MBR, אוטומציה המעבדה מאפשרת של תפוקה ניסיוני מוגברת הדורשת עיבוד נתונים רבי עוצמה. השלב השני (איור 1B) שמטרתו לזהות משתנים עיצוב רגיש (קרי, רכיבים בינוני) עם השפעה גבוהה על המטרה אופטימיזציה. זה מוביל מספר מופחת של עיצוב משתנים של עניין. הצעד השלישי (איור 1C) כוללת לאופטימיזציה איטרטיבי עבור חקירה מפורטת יותר של היחס פונקציונלי בין המשתנים עיצוב הנותרים, המטרה של ריבית. שימוש בערכת נתונים מורחבים במרוכז, הגישה Kriging מוחל לניבוי תוצאות ניסויי במיקומים ובשמחת. מחזור איטרטיבי עוצר ברגע המודל Kriging מנבאת של אופטימום או מישור עם מספיק דיוק. התוצאות יאומתו השלב הרביעי (איור 1D), החל מניתוח רגישות נוספת סביב אופטימום שזוהה. אם בתחילה, רגישות הרכיבים נמצאו להיות רגיש גם באזור אופטימלית, סביר להניח כי זה הפחד במהלך ההליך איטרטיבי אופטימיזציה בשלב השלישי. לאחר מכן, מומלץ לוודא אופטימיזציה תוצאות על-ידי יישום של שיטות אורתוגונלית, כמו assay פעילות או מרחביות-דף.

הטבע כלליים של פרוטוקול הציג מאפשרת התאקלמות קלה ציוד מעבדה שונים, אחרים המארחים ביטוי של חלבונים היעד של בחירה, כמו גם bioprocess נוספים משתנים כמו pH טמפרטורה ערך או טיפוח.יתר על כן, ניתן לבחור ביעדים אחרים אופטימיזציה כמו קצב ייצור חלבון, תשואה ספציפי או איכות המוצר כדי להתאים את היקף לימודי קידום אתרים אחרים.

איור 1 : זרימת העבודה של המחקר אופטימיזציה. בתיבות ארבע מסגרות תואמות מקטעים של הפרוטוקול, “להריון המחקר ואת ההגדרה של שיטות” (סעיף 1), “ניתוח רגישות” (סעיף 2), “קידום אתרים איטרטיבי” (סעיף 3) ו- “אימות” (סעיף 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

1. להריון המחקר ועל ההגדרה של שיטות (איור 1: חלק א) הערה: ההגדרה של המטרה אופטימיזציה: הוא קורס בזמן היווצרות מוצר צריכה או רלוונטי רק מרווח זמן מוגבל או אפילו על נקודת זמן קבוע? כמו כן, שקול בעיות פוטנציאליות כגון יציבות, המאמץ של כימות אנליטית, או בזמן הטיפוח-תרגול. כחלופה כייל נוגדנים החלבון הסופי, מטרות אחרות יכול להיחשב כגון זמן ביומסה או טיפוח. ביומסה משתקפת ביומסה התשואה מוצר מסוים, תוך טיפוח הזמן בא לידי ביטוי על ידי מרחב-זמן-תשואה. איכות המוצר (מינימום) יכול להיות גם מטרה. אופטימיזציה אובייקטיבי עשוי להידרש במצבים מסוימים, כפי שפורט במקום40. במחקר זה, כייל נוגדנים GFP לאחר 17 שעות טיפוח נבחר המטרה אופטימיזציה. קרינה פלואורסצנטית GFP ניתן בעקבות באינטרנט שימוש בציוד זמין במחקר זה, אשר מאוד מפשט לקביעת ריכוז החלבון מודל.הערה: ההגדרה של הפרמטרים שיש למטב: CgXII בינוני מורכב מרכיבים בודדים 1641 , חוקר כל אלה בעיצוב מלא העצרת יגרום בניסויים 216 ≈ 65,000. כתוצאה מכך, שטח החיפוש צריך להיות מופחת על בסיס רציונלי, מבוססת על ניסיון. הבחירה של רכיבי המדיה נחשב למיטוב ייתמכו על-ידי ידע מומחה זמין או נתונים בספרות. להחליט איזה רכיב בינוני ריכוזים כדאי שלא ניתן לשנותם. עבור אופטימיזציה של CgXII בינוני, הרכיבים הבאים נבחרו כדי לתקן: גלוקוז הוא קבוע-10 גר’/ל’ מיטוב זה הוא טריוויאלי כי גלוקוז יותר מניב יותר GFP מפריש ביומסה. המטרה הייתה לחשוף תופעות בינוני-אינטואיטיבי. 3-(N-מורפולינו) propanesulfonic חומצה (MOPS) תהיה קבועה 42 גר’/ל’ זה מספק קיבולת מספיקה האגירה במהלך הטיפוח-תרגול אצווה, לא עובר מטבוליזם.הערה: התוספת של המגבים בריכוז סופי זה מבטיח ערך התחלתי של pH 7, אפילו עם אמצעי האחסון השונים פתרונות אחרים מלאי נוסף, אשר אינם ב- pH 7. עם זאת, כדי לא לכלול כל סטייה החל ערכי pH, ה-pH צריך להיבדק עבור קומפוזיציות בינוני שבו כל הפתרונות מניות נוספים בעוצמות שלהם מינימלי ומקסימלי. 1 g/L כל קבועות ח’2PO4 ו- K-2-HPO-4 . אלה מספקים קיבולת גם חציצה, לשמש כמקור פוספט. אוריאה תהיה קבועה 5 g/ל’ זה משמש מקור חנקן הבזליים ו pH-ייצוב סוכן, מספיק כדי למנוע N-מגבלה. ביוטין הוא קבוע-0.2 מ ג/ל’ glutamicum ג ATCC13032 auxotrophic עבור ביוטין. חומצה Protocatechuic (PCA) תהיה קבועה 30 מ ג/ל’ הוא משמש מגהץ chelating הסוכן. איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) קבוע-100 מיקרומטר. היא מעניקה ביטוי של גן ה- gfp . בחר גבוה ונמוך ריכוזים של רכיבי מדיה עבור הקרנות רגישות הראשונית. . הנה, נבחרו רכיבים מתוך שלוש קבוצות טיפוסי של רכיבי המדיה. ריכוז נמוך וגבוה ובדוקים עבור כל אחד מהרכיבים הם: מקור חנקן רגיל: (NH4)2אז4 (8-32 g/L); וריאציית מקור חנקן דווח כדי להיות. אופטימיזציה של ביומסה ספציפיים GFP אות8. יסודות קורט: מכל4 ∙ 7 שעות2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7 שעות2O (0.4-1.6 mg/L), CuSO4 ∙ 5 שעות2O (125-501 µg/L), NiCl2 ∙ 6-אייץ ‘ (2O 8-32 µg/L) ו- CoCl2 ∙ 6-אייץ ‘2O (52-208 µg/L). ההרכב של יסודות קורט הוא ירש את הפרסום הראשון של CgXII בינוני41. בנוסף, נה2MoO4 ∙ H2O (26-104 µg/L) ו- H3בו3 (20-80 µg/L) נכללו כמו יסודות קורט, כפי שהם משמשים ב- variant שפורסמו של בינוני CgXII42. מאקרו אלמנטים: MgSO4 ∙ 7 שעות2O (0.2-0.4 g/L), CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3-21.2 mg/L). אלה נמצאו בקרב אחרים קטיונים דו ערכיים כדי לשפר את ייצור ה-GFP הפרשה המחקר עוד14איפה זן glutamicum ג R שימשה עם רקע בינוני אחר, של פפטיד אות בלשכת המידע לתיירים CgR0949. הכנת חומרים, הגדרת נהליםהערה: מומלץ להגדיר ולתקן את שיטות נסיוניות ברמה מפורטת. האחדה זו מבטיחה כי תוצאות שונות יכולים להיות נעוצים השתנות ביולוגי פנימי או קומפוזיציות שונות בינונית.הערה: המדיה במלאי פתרונות: להכין מלאי פתרונות ייחודיים לכל נחקר רכיבי המדיה. להכין את מניות מרוכז כדי לאפשר דילול נפח שונה עבור כל הרכיבים. משמעות הדבר היא כי לאחר שילוב כל הפתרונות מניות בווליום הגבוה ביותר שלהם על פי התכנון, זה אינו יכול לחרוג את נפח טיפוח הסופי, cf. פסקה “הדור של רשימת pipetting פתרון מניות בינוני” שלב 1.3.3. אם התוספת של פתרון מרוכז תוצאות כאמצעי אחסון תוספת נמוכה מאוד, למשל < 1/100th של אמצעי האחסון טיפוח הסופי, לדלל את הפתרון מניות בהתאם. למשל, במחקר זה נפח pipetting של פחות מ-10 µL הוגדרה להיות מעשית. בדרך כלל, יסוד קורט פתרונות מרוכזים גבוה כמו 1,000fold ביחס הסופי ריכוז רגיל במדיום. . זה יתרון להתרכז רכיבי מדיה כמו כפולות (X-קיפול) ביחס הריכוזים במתכון הפניה. בעשותם כך, הם נמנעו כהצפנה pipetting כרכים של שברים עשרוניים. מתכונים מפורט עבור כל הפתרונות מניות של מדיום CgXII מקבלים מסמך משלים. עובד בנק תא (WCB)הערה: עבור ניסוי גידול, aliquot אחד WCB משמש. אם aliquots יותר נדרשים, להשתמש במוח 100 מ ל לב בינוני אינפוזיה (BHI) 1,000 מ ל במבוכה לנער מבחנות או לחסן מבחנות טלטול מרובים, אשר הם איחדו לפני התוספת של גליצרול פתרון. להכין אחת מושבות הביטוי רקומביננטי זן glutamicum ג pCGPhoDBs- GFP43 על פלטות אגר (אבקת BHI 37 g/L, אגר 20 גרם/ליטר, 25 מ ג/ליטר kanamycin). ציפוי בחומר יכול גם לבוא השינוי טריים או של aliquot cryopreserved.דגירה ב 30 ° C עד להופעתו של מושבות יחיד; זה לוקח בדרך כלל 1-2 ימים. לחסן תרבות הבקבוק שייקר (50 מ ל BHI בינוני עם 25 מ ג/ליטר kanamycin, flask במבוכה 500 מ”ל, 250 סל”ד, 25 מ מ קוטר רועדת, 30 ° C) עם חומר המושבה, דגירה ללילה (כ ח 16). לשלב אמצעי אחסון אחד של השעיה התא שנוצר עם אמצעי אחסון אחד של פתרון סטרילי גליצרול 500 g/L ולהפיץ aliquots 2 מ במבחנות הקפאה קריוגנית סטרילי. חנות ב-80 מעלות צלזיוס. ה-MBR טיפוח פרוטוקולהערה: עבור מערכת BioLector MBR מועסקים זה המחקר, מפוזרים אור (ביומסה) ו- GFP פלורסצנטיות הם עוצמת מדידות, אשר צריך ערך רווח מסוים שהוקצו. גבוה יותר רווח, גבוה יותר את האות האופטי מוגבר; זהו גם למה זריחה ואור פזורים נמדדים ביחידות שרירותי (א”א). לקבוע ערכי רווח מתאים עבור ביומסה וזיהוי GFP בניסויים ראשוניים, מתאים רועד תדר, מילוי נפח להימנע הגבלה חמצן בריכוזים גבוהים של ביומסה במהלך תהליך בשלבים מאוחרים יותר. התנאים טיפוח מועסקים (“Flowerplates”, כלומר, בצורת פרח 48-ובכן MTPs, רועד התדירות של 1,200 סל ד, מילוי נפח של 1,000 µL, 10 גרם/ליטר גלוקוז כמקור פחמן הראשי) הבטיחו חמצן cultivations ללא הגבלה. עבור שיעורי העברת החמצן המרבית הנובע שילובים אחרים של מילוי כרכים, ומנענע תדרים ב- MTPs 48-ובכן בצורת פרח, גליונות נתונים מהספק זמינים. כמו כן, פגמים צמיחה של תרבויות בודדות עלולה להתרחש עקב כמויות נמוכות של סובסטרטים המשני (למשל, חנקן, יסודות קורט). לכן, בדוק את ריכוזי ביומסה בסוף cultivations. במחקר זה, נצפו תופעות כאלה אין צמיחה. להגדיר את פרוטוקול טיפוח עבור מערכת ה-MBR (“BioLector”) כדלקמן: Filterset 1: ביומסה, לצבור 14. Filterset 2: pH, רווח הוא מוגדר מראש. Filterset 3: pO2, רווח הוא מוגדר מראש. 4: ה-GFP, לקבל 80. רועדת תדר: 1200 סל ד. טמפרטורה: 30 ° C. זמן מחזור: 15 דקות. בזמן הניסוי: ידני (טיפוח לא תופסק באופן אוטומטי). הדור של רשימת pipetting פתרון מניות בינוניהערה: כמעט כל נוזל טיפול מערכת הרובוט הוא מסוגל לקרוא את פעולות pipetting מקבצים חיצוניים. בעיקרון, המידע המינימלי הדרוש הוא נפח העברת המיקום של ריאגנט המקור, כמו גם את היעד של כל המיוצגים על-ידי עמדה מכשור מעבדתי על סיפון רובוטית, חלל מסוים בתוך מכשור מעבדתי. עם זאת, המקצב שונה עבור נוזלים שונים טיפול מערכות יש לקחת בחשבון. איור 2 מציג את מבנה קובץ לדוגמה עבור מערכת pipetting מועסקים במחקר זה. ארבעה סוגים של מניות פתרונות הן pipetted אל תוך טיפוח כל טוב: מלאי פתרונות של רכיבי המדיה, כי הם מגוונים (וריאציה מניות”). מים כדי לפצות על שונים כרכים מצטברת של מעל מניות. מניות פתרון (“מניות היתר’) המכיל את כל הרכיבים שתוקנו. פתרון מניות זה יכולה להיות מורכבת של מניות המכיל השונות הרכיבים, למשל, מאוחסן בטמפרטורות שונות או מחוטא ע י שיטות שונות. . Inoculum, אשר צריך להוסיף את הרכיב האחרון ולשים על גבי שולחן העבודה לפני תוספת למנוע שיקוע התאים. לכל טיפוח, לחשב את אמצעי האחסון להעברה עבור כל רכיבי המדיה לפי: אמצעי האחסון להוסיף מסוימים וריאציה מניות אולי אפס, כלומר, כאשר רכיב ספציפי זה מושמט. תיקון כל מחושב אמצעי האחסון Vאני עבור מספרים מתאימים. Pipetting בהפרשים קבועים של נפח אחסון צעדים לא צריך להיות קטן מדי. במידת הצורך, התאם את ריכוזי וריאציה מניות. למשל, כאן האחסון pipetting מינימלי מוגדר כ- 10 µL, תוספת מינימלי מוגדר כ- 5 µL. באופן כללי, אמצעי אחסון אלה צריכים להיות מוגדרים בהתבסס על דיוק השפעול נחוש ודיוק על הנוזל בשימוש טיפול תחנת15,44. לחשב את עוצמת הקול של שאר המניות המכיל את הרכיבים קבוע עבור כל בארות כדלקמן: איפה האחסון המצטבר המרבי של מניות וריאציה משמש. כתוצאה מכך, לחשב את ריכוזי המרכיבים קבוע במלאי מנוחה הנדרשים כמפורט להלן: להכין את יתר המניות בהתאם. לכל טיפוח, לחשב נפח המים שיתווספו כדלקמן: לכל-תרגול טוב, פרט את כל אמצעי האחסון שיש להוסיף לפי הסדר הבא של בנוסף: VH2O, VRestStock, Vאני, VInok. לעצב את רשימת pipetting בהתאם למפרטים של הנוזל טיפול תחנת, כפי שמוצג כדוגמה באיור2. תרבות זרע הכנה מדיה אוטומטיים, התחלה של תרבות הראשי ליצור פרוטוקול עבור רובוט טיפול בנוזלים. ראה איור 3 ו- 4 איור פרוטוקול דוגמה עבור מערכת “יאנוס”, מיושם התוכנה המתאימה “WinPREP”. הפרוטוקול לשקול את ההיבטים הבאים: כוללים מספיק זמן הריצה של דיור סטרילי לפני הכנת המדיה. כוללים ניקוי מוגזם הראשונית, רחיצת כל העצות pipetting וחדר אבובים. לבחור מכשור מעבדתי מתאים מכולות לפתרונות מניות. כאן, צלחות עמוק טוב עם 12 עמודות מתאימים לאחסון של וריאציה מניות, כמו כל העצות pipetting שמונה יכולה לטבול בסידור מקבילי לעמודות טוב. זה במידה רבה מאיץ מדיה הכנה. אם צינורות ריאגנט 15 מ”ל או 50 מ ל משמשים כמאגר, עצה pipetting אחת בלבד יכולה לטבול לתוכו בעת ובעונה אחת.עבור המניות האחרים כמו מים ואת שאר המניות, משמשים שקתות 100 מ ל, כמו אלה מניות מחייבות אחסון גבוהה בסך הכל. לספק מספיק הנפח הכולל עבור כל הפתרונות מניות לפצות על אמצעי אחסון פסולת, קיזוז pipetting גובה, וכו ‘ הוסף שורת המשתמש לפני השלב חיסון, המבטיח כי שלב זה מתבצע מייד לפני ההליך תרבות זרע. להכין את כל הפתרונות מניות באופן סטרילי, החנות עד השימוש, מיכלים המתאימים, למשל, סטרילי 15 מ”ל, 50 מ ל מתכלה. לחטא את הצלחות עמוק טוב עבור מניות פתרון אחסון על שולחן העבודה, למשלעל ידי מנגב עם 70% אתנול וביו -ייבוש הבאים ב תא למינארי. להתחיל את התרבות זרע מזריקים 50 מ ל BHI בינוני המכיל 25 מ ג/ליטר kanamycin עם אחד aliquot מן WCB. לפני טיפוח MBR, להכין inoculum טריים, חיוני מ שמתקדמות תרביות זרע בכמות מספקת. במקום כל מכשור מעבדתי הכרחי על שולחן רובוטית ויוצקים פתרונות מניות במכשור מעבדתי התואם. להתחיל את זרימת העבודה רובוטית עבור מדיה הכנה, כך השלב האחרון (חיסון), הגיע בזמן עם תחילת תרבות זרע. סה כ זמן הריצה של זרימת העבודה רובוטית זקוק להערכה בעבר. כאן, הריצה הכולל היה כ- 1.5 שעות. לטעום את התרבות זרע לאחר כ 2 h, אז כל שעה, כדי לנטר את הצמיחה על ידי צפיפות אופטית (OD600). לאחר כ- 5 שעות, התרבות מגיע ל 3-4 OD600 והוא משמש כדי לחסן את התרבויות הראשי. במקום התרבות זרע על שולחן העבודה המטפל נוזלי ולהמשיך את פרוטוקול הכנה מדיה. חותם טיפוח MTP לאחר חיסון. למקם את טיפוח אטום MTP במכשיר BioLector ולהתחיל פרוטוקול טיפוח מוגדרים מראש. תשליך את הפתרונות המניות הנותרים, לפי תקנות אבטחה במידת הצורך, זרע התרבות מן שולחן רובוטית. לנקות את מכשור מעבדתי שמיש מחדש ולהתחיל פרוטוקול טיהור המטפל נוזלי. כימות המוצר ואת preprocessing נתונים גולמיים עבור ניתוח לעצור את התרבות המרכזית לאחר זמן הריצה 17 h. להעביר את נתוני המדידה מהתקן ה-MBR BioLector למחשב המחובר באמצעות חבילת התוכנה BioLection על פי המדריך למשתמש של היצרן. שימוש “ניהול נתונים ← להפוך נתונים” פונקציה של חבילת התוכנה “BioLection”, המלווה את מערכת ה-MBR כדי להמיר את הקובץ נתונים גולמיים לתוך תבנית גיליון אלקטרוני עם גישה נוחה. העתק את הנתונים אות GFP כל טיפוח וולס מן העמודה חותמת הזמן הקרוב ה 17 לזהות ה-GFP אותות מן הבארות בטיפוח ההפניה את הממוצע. לנרמל את כל אות GFP הנותר ע י האות הפניה הממוצע. לכמת את כייל GFP בשיטות נוספות (אם נדרש) להעביר את המתלים תא מבארות טיפוח כל לתוך צינורות התגובה prelabeled ולקבל את תגובת שיקוע ללא תא לאחר צנטריפוגה 10 דקות במהירות מקסימלית באמצעות צנטריפוגה benchtop. להעביר 200 µL של כל תגובת שיקוע ללא תא MTP 96-ובכן שחור עם תחתית שקופה, ולקרוא קרינה פלואורסצנטית ספציפי GFP-488/520 nm שימוש בקורא microplate המתאים. לנרמל את האות ה-GFP מבארות כל עם ממוצע האיתות cultivations הפניה, כמו שלב 1.5.3.הערה: לא ניתן להשוות את האותות פלורסצנטיות GFP מוחלטת עבור מכשירי מדידה שונים. לכן, 5 זנים הפניה של כל cultivations העיקרי לשמש תקן פנימי. השיפור של GFP כייל נוגדנים יכול להתבטא ביחס תקן פנימי. דבר זה מאפשר השוואה של תוצאות של ניסויים שונים ושיטות שונות GFP כמת (ראה בהמשך שני שלבים). לקבוע את תכולת חלבון supernatants ללא תא עם פרוטוקולים סטנדרטיים, למשל, ברדפורד או BCA וזמינותו. בשילוב עם התוצאות של שלב 2, הקביעה של כייל נוגדנים ספציפיים GFP חלבון אפשרי.הערה: לאחר פלורסצנטיות מדידה, השתמש המדגם ישירות מ- microplate הזה. שימוש מרובה ערוצים פיפטות מאוד מקל את הנוזל נחוץ הטיפול. ביצוע של ויזואליזציה מרחביות-דף ללא תא supernatants בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים כדי לוודא כי רוב תכולת החלבון של עלייה היא עקב הפרשת GFP מוגברת.הערה: מרחביות-דף זה יותר מפרך מאשר השיטות שהוזכרו קודם לכן, במיוחד עם עומס גבוהה לדוגמה. לצורך אימות, לעתים קרובות מספיק לפעול שלמען חברה דמוקרטית-דפי ללא תא supernatants מהפניית בינוני והאחרון ממוטב cultivations בינוני15. 2. ניתוח רגישות (איור 1: חלק ב). הערה: מטרת חלק זה היא לזהות את הגורמים החשובים שיש להם השפעה משמעותית על המטרה. בחר טווח הריכוז ההתחלתי של רכיבי המדיה. ההרכב בינוני הפניה צריך לשכב בתוך טווחים ריכוז שבחרת. לבחור של DOE המתאים. תרשימים כאלו ניתן למצוא בספרות, למשל, מ- NIST/SEMATECH e-בהוראות של שיטות סטטיסטיות (זמין ב- www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). העיצוב שבחרת תלויה במספר של רכיבי המדיה של הריבית (כאן, 11) ואת מספר ניסויים שבוצעו (כאן, 32). בדוגמה הנתונה, עיצוב “2הרביעי11-6” נבחר זה תוצאות בניסויים 32 ומאפשרת הערכת ההשפעה של הגדלת ריכוז אחד המרכיבים 11 על המטרה של ריבית. כדי להיות יותר ספציפי, ההשפעות העיקריות הן לא מבולבל עם פקטור pair-wise אינטראקציות. הם יכולים להיות ארור עם אינטראקציות סדר גבוהה יותר, דברים שהם, עם זאת, ככל הנראה לא משמעותי. השתמש הבארות הנותרים (כאן, 16) לביצוע משכפל מרובים עם המדיום הפניה כדי להעריך את הפארמצבטית של התהליך. משכפל צריכים באותה מידה מפוזרים על פני הצלחת לגלות תופעות לפי מיקום. הערך הממוצע של הפלט נמדד מן הניסויים הפניה משמשת נורמליזציה. כלומר, כל פלט מדודה של ניתוח רגישות מחולק לפי הערך הממוצע של הפלט הפניה. לחשב הראשי במידת האפשר ההשפעות קומבינטורית באמצעות תוכנת סטטיסטיקה המתאים. העיצוב הקלאסי של ניסוי מבוסס על קירוב פולינומיאלי45. למשל, mvregress פונקציה MATLAB יכול לשמש עבור הערכת המקדמים פולינום.הפונקציה mvregress הוא חלק של סטטיסטיקה, תורת הלמידה בארגז הכלים. לזהות את ההשפעות הרלוונטיים של רכיבי מדיה שונים על המטרה באמצעות מבחן t. בדוגמה, NH4+ בעל השפעה שלילית משמעותית, Ca2 + ו- Mg2 + להראות את ההשפעות החיוביות החזק ביותר (איור 5). כי אות ה-GFP היה מנורמל, מקדמי מייצגים השינוי היחסי הממוצע בתוך האות GFP בעת הגדלת ריכוז של רכיב מסוים מ ערכו מרכז, , לערך המרבי שלו. רכיבים קבועים ללא אפקט הרלוונטיים הינם ערך הייחוס שלהם במהלך אופטימיזציה. 3. איטרטיבי אופטימיזציה (איור 1: חלק ג) הערה: הכלי MATLAB KriKit שימש כדי להפוך את פרשנות ניתוח נתונים סטטיסטיים36. KriKit מאפשר למשתמש בניית מודל Kriging מבוססת נתונים. מודל זה Kriging מנבא הקשר פונקציונלי בין רכיבי מדיה של המטרה. הוא גם מספק מידע על הוודאות חיזוי. אי ודאות גבוהה מציין נתונים רועשת ו/או לא מספיק נתונים צפיפות. DOEהערה: ניסויים חדשים iteratively מתוכננים, בהתבסס על תוצאות המרוץ הקודם. ב איטרציה הראשון, עיצוב חדש ניסויים לחקירה מפורט של רכיבי המדיה שזוהה עניין. אין אפשרות להעביר את תוצאות הניסוי של סעיף 2 כדי אופטימיזציה איטרטיבי (סעיף 3), כפי הריכוזים של רכיבים ללא אפקט רלבנטי קבועים עכשיו את הערך הפניה בהתאמה. כתוצאה מכך, ניסויים ניתוח רגישות, אופטימיזציה איטרטיבי אינן דומות. אחרת, בצע את ערכת מאויר איור 1, מסגרת “איטרטיבי אופטימיזציה”. אם את הפוטנציאל האופטימלית שוכנת בתוך הטווח ריכוז מוגדרים, ניסויים חדשים מתוכננים באמצעות40,את השיפור הצפוי46. עיצוב ניסיוני המבוסס על השיפור הצפוי משולב KriKit בארגז הכלים. אם אופטימום שוכנת על הגבול, להרחיב את טווח הריכוז. ביצוע ניסויים בנקודות הדגימה מעוצב על פי שיטות נסיוניות כהגדרתה בסעיף 2. ניתוח סטטיסטי לבנות דגם Kriging באמצעות הנתונים המשולבים כל איטראציות, כולל הנוכחי. לחקור את הפלט דגם על-ידי הדמיה באמצעות הכלים מקיף של krikit ב (2/תלת-ממדי אינטרפולציה, ניתוח הסרט, הקרנת מגרש, וכו ‘). אם שטח אופטימליים הוערך עם מספיק דיוק, לעצור אופטימיזציה. אם לא, המשך לשלב 3.1.הערה: איור 6 מדגים אופטימיזציה איטרטיבי לצורך המחקר הבדיקה. טווח ריכוז הורחב במרוכז עד מישור נמצא (איטראציה 1-6). האיטראציה השביעי שימשה על מנת לחקור את הגבולות בפירוט רב יותר. 4. אימות של תוצאות (איור 1: חלק ד’) הערה: לאחר סיום אופטימיזציה איטרטיבי, ההנחות צריך להיבדק על תוקפו. בצע שוב ניתוח רגישות (סעיף 2) עבור הרכב בינוני אופטימלית. כלומר, ריכוזי רכיבים נחקרות איור 1 (חלק ג) קבועים לערכים אופטימליים. ריכוזים של רכיבים אחרים הן מגוונות על פי DOE המתאים.הערה: תוצאות דומות ב שתי הקרנות מציינים כי רמות ריכוז המרכיבים ובדוקים לא תשנה את ההשפעה של רכיבים אחרים. אם ההקרנה מראה הבדלים משמעותיים על פי התוצאות של חלק ב’, יש להוסיף רכיבים עם אפקט שהשתנו לבריכה של רכיבים ובדוקים, חלק C יש לחזור. במקרה של מדידה עקיפות (למשל, זריחה כמו מחוון עבור המוצר ריכוז), ליישם גישות המדידה אורתוגונלית (למשל, פעילות assay, ברדפורד או כימות חלבון BCA, דף מרחביות) כדי לאשר את השינוי המטרה של עניין על-ידי השוואת נובעת המדיום הפניה ומן ממוטבת בינוני15.

Representative Results

פרוטוקול שהוצג הוחל עבור למקסם את כייל של GFP המופרש. באופן ספציפי, ה-GFP כייל נוגדנים לאחר 17 שעות טיפוח נבחר המטרה אופטימיזציה. קרינה פלואורסצנטית באינטרנט זיהוי של GFP מותר מוצר פשוט כמת. עם זאת, נירמול של אות ה-GFP בנתונים בטיפוח ההפניה הוא חיוני כדי להבטיח הפארמצבטית comparability של תוצאות. מבחר טרום רכיבי מדיה בוצעה על בסיס רציונלי כמתואר בסעיף 1. הניסויים בוצעו ועקוב אחר ההוראות של סעיף 1: הפרמטרים של ההליכים מעבדה רטוב הוגדרו לצורך המחקר כולו עקביות של הפארמצבטית של תוצאות. כמתואר בסעיף 2, ההקרנה הראשונית בוצעה לזיהוי רכיבים הרלוונטיים שמראה השפעה משמעותית על המטרה אופטימיזציה מחקר נוסף, מפורט יותר. המערכת MBR מבוססות MTP מאפשרת ניסויים 48 להתבצע במקביל. אם ניקח בחשבון את המספר האפשרי מקסימלי של ניסויים מקבילים על אחד MTP (48) ואת המספר הכולל של רכיבי מדיה (11) גורם 2הרביעי11-6 החלקי עיצוב הבחירה המתאימה. עיצוב ניסיוני זה כוללת 32 ניסויים ומאפשרת הערכת ההשפעה העיקרי עבור כל הרכיבים מדיה ובדוקים. הבארות טיפוח הנותרים (16) שימשו משכפל מרובים של הניסויים עם המדיום הפניה כדי להעריך הפארמצבטית ואפקטים לפי מיקום. כלומר, ניסוי מבוצע פעם אחת (לא משכפל), חוץ של הניסוי הפניה (משכפל חמש). טבלה 1 מסכמת את התוצאות של ניתוח הקרנה. בטווח ריכוז נחשב, משתנה רוב רכיבי מדיה לא הראה השפעה ניכרת על המטרה. רכיב NH4+ מראה השפעה שלילית חזקה, בעוד Ca2 + ו- Mg2 + מציגים את הנטייה החיובי החזק ביותר. ההשפעה של Mg2 + אינה משמעותית עבור טווח הריכוז הנוכחי, אך ייתכן עבור טווח ריכוז רחבה יותר. כתוצאה מכך, הוחלט להשמיט NH4+ של המדיום, לחקור את ההשפעה של Ca2 + ו- Mg2 + בניסויים נוספים. סעיף 3 מתאר את ההליך אופטימיזציה איטרטיבי המשמשת עבור למקסם את האות פלורסצנטיות GFP תוך שינוי הריכוזים של Ca2 + ו- Mg2 +. ב איטרציה 1, נבחנה ההשערה כי NH4+ יכול להיות מושמט. טווח ריכוז עבור Ca2 + ו- Mg2 + אומצה מניתוח ההקרנה. הריכוז המינימלי של NH4+ היה מוגדר כאפס ואומצה הריכוז המרבי של הניסוי ההקרנה. בניסויים הבאים, הריכוזים רכיב הופצו מעל 3 x 3 x 3 רשת בתוך הטווח ריכוז מוגדרים, וכתוצאה מכך 27 ניסויים. במהלך כל cultivations, משכפל חמש הפניה בינוני היו כלולים, אשר שימש תקן פנימי כדי להבטיח כי אין תופעות מיקומיים מעל MTP התרחשה. בשביל הבארות 16 הנותרים, ריכוזי NH4+, Ca2 +ו- Mg2 + חולקו באופן אקראי בתוך טווחים נתון. איור 5 א . מדמיין את התוצאות של האיטראציות הראשון. תוויות ציר להפנות ריכוז רכיב להשתמש במדיום ההפניה המקורית, המצוין על-ידי x Ref. המשטחים הכחולים מייצגים את interpolations Kriging אשר חושבו באמצעות התוכנה krikit. כל אחד מממדי משויכת רמת הריכוז היחסי עבור NH4+ (כחול כהה: 0 x שופט, משובץ: 1 x שופט, תכלת: 2 x Ref). ייצוג חזותי זה מגלה כי היא חיובית כדי להשמיט NH4+. אינטרפולציה משטחים להציג גם את ההשפעות החיוביות של הן מ ג2 + ו- Ca2 +, כמו כל עלייה מטוסים עם הגדלת ריכוזים. בהתבסס על תוצאות איטרציה 1, הוחלט להרחיב את ריכוז מגוון של Ca2 + ו- Mg2 + על ידי הכפלת ריכוז מרבי, הסטה בחלון העיצוב ניסיוני בפינה הימנית העליונה, ראה איור 5 B. בתוך טווח זה, הופצו הריכוזים על רשת 6 x 6. פעולה זו מבטיחה ריפודי כתופיים על פני הטווח ריכוז מלא, מובילים לתוצאות אינטרפולציה של האופטימלית Kriging. איור 5 מראה B העלילה אינטרפולציה Kriging בהתבסס על הנתונים המשולבים נמדד שתי חזרות (נקודות אדומות, ריבועים צהובים). עבור שניהם, Ca2 + ו- Mg2 +, ממשיך ההשפעה החיובית של הגדלת ריכוזים שלהם. כתוצאה מכך, ההליך חזר על עצמו על ידי הכפלת ריכוז מרבי, לפיכך, חלון העיצוב ניסיוני הועבר לחקור את הגבולות בפינה הימנית העליונה. איור 6 A נותן סקירה של ההליך אופטימיזציה הנותרים. ניתוח הנתונים של ערכת הנתונים שנאספו עד איטראציה 3 גילה שמגבלה של ההשפעה החיובית של Mg2 +, דהיינו, של ריכוז אופטימלי טווח של Mg2 + זוהה. לכן הוחלט להרחיב את טווח ריכוז רק עבור Ca2 + (איטראציה 4). תהליך זה חזר על עצמו פעמיים (איטראציה 5 ו- 6) עד רוויה של אות ה-GFP נמצאה. הרוויה זה מוסבר על ידי משקעים של Ca-מלחי עבור הריכוזים יישומית של Ca2 +, אשר אינם זמינים לתאים. תוצאות ניסויית הם תמיד מוטרד על ידי רעש, אינטרפולציה Kriging וכתוצאה מכך מופיעה לא סדיר, בדיקה ויזואלית עלול להוביל למסקנות שווא. עם זאת, טווח ריכוז אופטימלי של רכיבי מדיה עבור האות GFP רווי ניתן לזהות באופן אמין עם סטטיסטי z -המבחן, המיושמת גם krikit. במבחן z -משתמש ישירות במידע סטטיסטי פנימיים הניתנים על ידי Kriging בשיטה, קרי, חיזוי ערכים חיזוי הוודאות. איור 6 B מראה הרמה מזוהה, דמיינו ונחוש באמצעות הכלים krikit.ארגז הכלים KriKit היא זמינה בחופשיות36 ומגיע עם ערכת לימוד מפורט המסביר כיצד להשתמש בתכונות שלה. אם נמצאו יותר משני רכיבים הרלוונטיים, הדמיית 3D מגיע מהמגבלה. KriKit מספק מספר שיטות הייצוג החזותי אחרים כגון סרטים או “הקרנת מגרש”. אם את הפוטנציאל האופטימלית שוכנת בתוך הטווח ריכוז מוגדרים, ניסויים חדשים מתוכננים באופן אוטומטי באמצעות40,את השיפור הצפוי46. עיצוב ניסיוני המבוסס על השיפור הצפוי משולב KriKit בארגז הכלים. מידע מפורט יותר ניתן למצוא בתיעוד התוכנה. בתום התהליך האיטרטיבי אימות של התוצאות נערך, כמתואר בחלק ד’ תוקפה של ההנחות שנבדקה על ידי ביצוע ניתוח רגישות נוספים באמצעות הרכב בינוני מיטבי. כלומר, כל רכיבי התקשורת הראשונית של עניין היו מגוונות, אך Ca2 + ו- Mg2 + הוגדרו רמות ריכוז אופטימלי שלהם. במחקר זה, ריכוז אופטימלי = 32 x Ref, = x 6.8 Ref נבחרו. בטבלה 2 מציגה את התוצאות של ההקרנה אימות. בדומה הרגישות ראשונית ההקרנה (.ראה טבלה 1), NH4+ עדיין יש השפעה שלילית משמעותית, אפקטים הנותרים עדיין זניח. בשל גישה נוחה, האות פלורסצנטיות GFP מן התליה טיפוח שימש כדי לכמת את כייל GFP חוץ-תאית במהלך כל הניסויים. מסיבות אימות, זריחה GFP אומתה נגד מדידות אחרות. כי GFP מופרש דרך השביל Tat, האות פלורסצנטיות לא יכול להפלות בין אינטרה – GFP חוץ-תאית. לפיכך, cultivations שוחזר באמצעות המדיום הפניה המדיום ממוטבת. מלבד המדידה זריחה של טיפוח נטולי תא supernatants, תכולת החלבון הייתה לכמת על ידי שיטת ברדפורד (חצי)-שיפור GFP איכותי דמיינו ידי מרחביות-עמוד15. כל מדידה וכתוצאה מכך אותות היו כ הכפילה של cultivations עם אופטימיזציה בינוני לעומת ההתייחסות בינוני ואומת כ 100% שיפור של הפרשת ביצועים בינוני ממוטבת. כתוצאה מכך, GFP פלורסצנטיות ספציפי של טיפוח השעיה יכול להיחשב מדד של מתאימים עבור אופטימיזציה המטרה, קרי, כייל-GFP חוץ-תאית. איור 2 : צילום מסך מתוך הרשימה pipetting אמצעי האחסון עבור ניתוח רגישות. הערכים בעמודה הראשונה להקצות מזהה ייחודי לכל אמצעי האחסון של שורה; מזהה זה הוא MTP מספר טוב של טיפוח היעד MTP על שולחן העבודה המטפל נוזלי,. cf. איור 4C. יתר העמודות לקודד אמצעי אחסון עבור פתרונות שונים (“Sln-01” ל “Sln-15”) כדי להיות pipetted. נפח המצטברת של שורה אחת מקביל נפח טיפוח הסופית המתאימה היטב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : צילום מסך מתוך הנוזל הטיפול תוכנת שליטה “WinPREP”. משמאל: הורה שורה פקודות, לרבות פקודת ההעברה עבור כל הפתרונות מניות להיות pipetted. לפני הפקודה האחרונה inoculum בנוסף, הנחיה למשתמש נוסף כדי להבטיח שהתרבות זרע ממוקמת ליד השולחן בדיוק בזמן. מימין: תיאור סכמטי של שולחן העבודה, כגון מכשור מעבדתי של מקור וריאציה מניות (שתי צלחות עמוק טוב עם 12 עמודות כמו וולס), את השוקת ריאגנט שאר המניות, מים, inoculum, מדיה הכנה המטרה גידול MTP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : אוסף של נתונים היסטוריים צילומי מסך עבור ההתקנה של pipetting של פתרון מניות. (א) פתח את הפקודה עבור pipetting של מניות Fe. מכשור מעבדתי מקור ומקור טוב בהישג מסומנים על שולחן העבודה על ידי מסגרת קריאה אדום עמודה של צלחת עמוקה היטב המתאימים. מכשור מעבדתי היעד ווולס היעד בתוך מסומנים על ידי מסגרת כחול סביב בארות כחול של טיפוח היעד MTP. (B) תצוגה לדוגמה מפורט על הקצאה של אמצעי אחסון pipetting בשלב זה (פתרון מניות Fe). מספר יעדים הוא לקריאה מתוך הרשימה pipetting, שבו יש 48 שורות. אמצעי האחסון dispense עבור כל יעד בארות לפתרון מניות Fe נמצא בעמודה 4 ברשימה pipetting. שימו לב כי העמודה הראשונה ברשימה pipetting מכיל מזהי ואמצעי אחסון לא יועברו, ראה איור 2. (ג) פרטים על יעד טוב מספור. כרכים שנכתב בשורה #1 של הרשימה pipetting המתאים pipetted לבאר מסומן #1, וכן הלאה. וולס #01, #08, #41, #48 תואמות בארות A01, A08, F01, F08 לקידוד אלפא-נומרי, אשר גם מודפס לתוך הטיפוח MTP עצמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5 : מפורט תוצאות איטרציה הראשון. (א) Kriging אינטרפולציה בהתבסס על נתוני הניסוי של איטראציה 1. הנקודות האדומות מציינות את ערכת הנתונים. לשם השוואה, כל אינטרפולציה שלושה משטחים הם תיפרס מגרש אחד (כחול כהה: 0 x שופט, משובץ: 1 x שופט, תכלת: 2 x Ref). ייצוג אלטרנטיבי של התוצאות ניתן למצוא במקום אחר15. (B) אינטרפולציה Kriging מבוסס על הניסויים שבוצעו ב איטרציה 1 (נקודות אדומות) ו איטראציה 2 (ריבועים צהובים).חלקים של הנתונים המוצגים באיור זה כבר שפורסמו בעבר15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 6 : תיאור תוצאות אופטימיזציה שנאספו iteratively. (א) Kriging הסופי מודל חיזוי. (B) זיהוי סטטיסטי של האופטימלית אזור (אדום) מבוסס על סטטיסטי z-לבדוק, אשר מסופק על ידי krikit ב. תיבות מצביעים על שלבים רצופים של עיצוב איטראטיבית בביצוע הניסויים. חלקים של הנתונים המוצגים באיור זה כבר שפורסמו בעבר15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. רכיב הערך הממוצע מקדם מנורמל Fe2 + -0.08 Mn2 + -0.05 Zn2 + -0.21 Cu2 + -0.21 מלון NH4+ -2.04 ני2 + -0.11 Co2 + -0.10 4moO2- 0.03 3. בו3- 0.06 Ca2 + 1.00 Mg2 + 0.45 טבלה 1: תוצאות של ניתוח רגישות. מקדם ערכים המייצגים את ההשפעה הממוצע בעת הגדלת רכיב המדיה המתאימים הריכוז מ ערכו מרכז לערך המרבי שלו. של האופטימלית עיצובים ניסיוניים, כמו שנמצאו בספרות רגיל ולא להשתמש בו כאן, מייצג סטיית התקן ישירות וריאציית ניסיוני עקב שכפול של הניסוי הפניה. מקדם ערכים היו מנורמל לפי הערך maxium (0.0422 עבור רכיב Ca2 +). סטיית תקן מקדם מנורמל והמוחלט הוא 0.54 ו- 0.0226, בהתאמה. רכיב הערך הממוצע מקדם מנורמל Fe2 + -1.00 Mn2 + 1.00 Zn2 + -3.48 Cu2 + -0.52 מלון NH4+ -15.95 ני2 + 0.69 Co2 + -0.51 4moO2- -0.45 3. בו3- -1.11 בטבלה 2: תוצאות של ניתוח רגישות הסופי. מקדם ערכים המייצגים את ההשפעה הממוצע בעת הגדלת רכיב המדיה המתאימים הריכוז מ ערכו מרכז לערך המרבי שלו. השתמש עיצוב ניסיוני אופטימלית, סטיית התקן רק תלוי וריאציית ניסיוני באמצעות הקומפוזיציה בינוני ממוטבת. וריאציה ניסיוני גדל במקצת בהשוואה וריאציית תוך שימוש באמצעי עזר. מקדם ערכים היו מנורמל לפי הערך maxium (0.0106 עבור רכיב Mn2 +). סטיית תקן מקדם מנורמל והמוחלט הוא 3.63 ו- 0.0385, בהתאמה.

Discussion

הטבע כלליים של פרוטוקול הציג מאפשר adaptions שונים, למשל, לימוד אחרים ביטוי מיקרוביאלי מארחים⁹^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^, ⁵¹, או כדי למטב את מאפיינים אחרים של החלבון היעד, כמו אג ח, תבנית או disulphide, גליקוזילציה. הפרוטוקול ייתכן שתצטרך גם להיות מותאם ציוד המעבדה הזמינות. השילוב של מערכת ה-MBR מאפשר הגדלת תפוקת ניסיוני, אשר מאפשר חיסכון עצום בזמן. עם זאת, בעת החלפת ריאקטורים מלא שעברו אינסטרומנטציה, לשליטה על ידי מערכות ה-MBR, מדרגיות של תוצאות הריכוזיות⁸^,–³⁷^,–⁵²^,–⁵³. השימוש של DOE מתודולוגיות ומודלים מתמטיים מסייעת למקסם את תוכן המידע נתוני המדידה ביחס אובייקטיבי למדה⁵⁴ על ידי תכנון ניסיוני יעיל של נתונים מבוססי מודל פרשנות¹⁵.

שינויים בשיטת
ליד רב תכליתי וניתן להרחבה רובוטית נוזלי טיפול מערכות כמו האחד השתמשו במחקר זה, יש לציין כי ישנם מספר נוזלי קטן יותר טיפול מערכות זמינים מסחרית אשר מסוגלים לבצע משימה זו, ניתן להציב בפנים זרימה שכבתית עבודה ספסלים. אם אין מערכת אוטומטית pipetting זמין, ניתן למימוש יצירות מדיה שונים לפי התוכנית DOE גם על-ידי pipetting ידנית באמצעות פיפטות יחיד או רב ערוצית. מאז הכנה ידנית הוא יותר לשגיאות, ידרוש עבודה מאוד ממוקד במשך זמן רב, מומלץ להכין מספר נמוך יותר של יצירות מדיה שונים.

בהתאם ליכולות של מערכת ה-MBR מועסקים, פרוטוקול טיפוח המתאימים ישתנו. למשל, אם אין מדידה מקוון של ביומסה היווצרות זמין, ייתכן מספיקות למדוד ריכוז ביומסה לאחר סיום הניסוי צמיחה. בשילוב עם ניטור מקוון של חומציות, חמצן מומס, המיושמת מספר מערכות ה-MBR, הרוויה צמיחה ניתן לקבוע בבטחה. בעקרון, הניסויים גדילה יכול להתבצע ב- MTPs לבד ממוקמים בתוך רועד אינקובטורים, ללא השימוש של מערכת ה-MBR. במקרה זה, טיפוח נכונה תנאים חייבים להבטיח שמפות: cultivations חמצן מוגבלת (1) ניתן למנוע באמצעות MTPs גיאומטריות מתאימים, בשילוב עם נאות רועד תדרים, ומנענע קטרים, למשל, כיכר 96 או 24 עמוק צלחות טוב המופעל ב- 1,000 סל ד ב 3 מ מ לזרוק או ב 250 סל”ד-זריקה 25 מ מ, בהתאמה. חשוב, נמוך יותר קצבי העברה של השגה חמצן מקסימלי, התחתון מקור הפחמן העיקרי צריך להיות מרוכז. כאמור לעיל, במחקר זה, השימוש גלוקוז 10 גרם/ליטר היה מתאים למנוע חמצן הגבלה על התנאים טיפוח מועסקים; (2) הדגימה של התרבויות MTP על כימות ביומסה, מוצר צריכה להצטמצם למינימום. בכל פעם ש-MTP יוסר החממה חזק, העברת חמצן מיד פריצה מטה אשר עלולה לגרום ליתר התנאים שלילי טיפוח-תרגול; (3) לדעתו של המחברים, בשימוש בקוראי MTP כהתקני טיפוח לא מומלץ כי התקנים אלה פותחו לא למטרה זו. לדוגמה, מכניקה חזק נבנו עבור ערבוב מזדמן של microplates לאחר הוספת ריאגנט, לכן, לעתים קרובות חוסר חוסן עבור רצפים ארוכים של רציף שנמשך ימים חזק. יתר על כן, לא יכול להגשים כניסת מתח מספיק לצורך cultivations חיידקים אלה הקוראים. השילוב של צפיפות אופטית קריאות בקיצור במרווחי זמן דורש לעצור את המגמה חזק, וכתוצאה מכך תקופות חוזרות ונשנות של חמצן הגבלה. יתר על כן, אידוי במערכות כאלה על פני תקופות זמן טיפוח יעוות תוצאות. לקבלת פרטים נוספים על הנושא מורכב באופן מפתיע על השימוש MTPs עבור חיידקים cultivations, הקורא מכונה בספרות מצוטט²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶הפניות המצוי בו.

שיקולים נוספים
לצעדים אופטימיזציה איטרטיבי במהירות, מומלץ כדי לבחור בקפידה את השיטה האנליטית על המוצר כימות. שיטות מהירה ופשוטה צריך להיות מועדף על חשבון דיוק ודיוק, כמו אסטרטגיית תכנון ניסויים איטרטיבי סובלנית דיוקים ניסיוני. עם זאת, יש צורך לאמת את התוצאות הסופיות נגד שיטות כימות מדויק מספיק מוצר מדויק יותר מורכב. באופן כללי, הערכה זהירה וקבלת החלטות על הליכי מחקר דורשים מאמץ בתחילת המחקר, אך לשלם בטווח הארוך, לאחר שיטות שגרתיות הוקמו.

מומלץ מאוד להגדיר ניסוי הפניה זה מושווה ל כל ניסויים במהלך אופטימיזציה. כלומר, ריכוזי רכיב בינוני יישומית, כמו גם פלט נמדד הם מנורמל באמצעות חלוקת לפי ערכי הייחוס. כך כל אחד מוחלת, ערך נמדד אפשר לפרש את x או את הקיפול של הערך הפניה. לקחת בחשבון וריאציות בין הלוחות, חמישה ניסויים הפניה מבוצעות על כל צלחת. הערך הממוצע של התוצאה נמדד משמש נירמול.

זה בדרך כלל לא ניתן להבטיח כי המדיום מפותחת היא גם אופטימלית עבור זנים אחרים. עם זאת, המדיום משופרת סביר יהיה גם מתאים טיפוח זנים ביטוי עם הבדלים גנטיים קטן, למשל, כאשר לייצר גרסאות עם חומצה אמינית בודדת החלפות המתקבל (מחקרים מוטגנזה מכוונת למרות מוטציות נקודה אפילו יחיד תוארו חילוף החומרים הסלולר אפקט, ביטוי heterologous-ביצועים-⁵⁵^,–⁵⁶). במקרה זה, פרוטוקול שהוצגו יכול להיות צעד ראשון, ואחריו פרוטוקולים עבור ביטוי בתפוקה גבוהה הקרנות⁵⁷. אם הפרוטוקול משמש לפיתוח בינוני עם עוקבות בהיקף של עד cultivations נמאס-אצווה, המדיום ממוטבת צריך לאמת עבור bioprocess התנאים המתאימים, שתוארו שיבוט הקרנת קמפיינים ב microscale העליון שונה שחקנים עבור אסטרטגיות הזנה שונות וטיפוח-מדיה-⁵²^,–⁵⁸. יתר על כן, הציג krikit ב³⁶ בדרך כלל יכול לתרום bioprocess הוליסטית משופרת אופטימיזציה.רק לאחרונה, היו יכולות הכלי להרחיב גם תמיכה אופטימיזציה אובייקטיבי⁴⁰, אשר יכול להיות חשוב עבור מיטוב⁵⁹^,שני תהליכים ויוצאת⁶⁰.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

הפעילות המדעית של המרכז המדע Bioeconomy נתמכו כלכלית על ידי משרד של חדשנות, מדע, מחקר במסגרת BioSC NRW-Strategieprojekt (מספר 313/323-400-002 13). המחברים תודה משרד של חדשנות, מדע, ואת המחקר של נורדריין-וסטפאליה של היינריך היינה אוניברסיטת דיסלדורף למלגה. לארס פראייר בתוך ביוטכנולוגיה תעשייתי האשכול CLIB-בוגר. מימון נוסף התקבל מהתוכנית רווחים הפעלת “הלמהולץ מעבדות החדשנות” אגודת הלמהולץ גרמנית כדי לתמוך את “חיידקים Bioprocess מעבדה – A הלמהולץ המעבדה לחדשנות”.

Materials

BioLector	m2p-labs	G-BL-100
Flowerplate	m2p-labs	MTP-48-BOH	For cultivation in the BioLector device
Sealing foil	m2p-labs	F-GP-10	Sterile sealing for Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	n/a	Freely available, MATLAB installation required
Janus pipetting robot	Perkin Elmer	n/a	Includes "WinPrep" software installation
12-column deep well microplate	E&K Scientific	EK-2034	Container for medium stock solutions
96 well microplates, transparent, F-bottom	Greiner	655101	For Bradford protein assay
µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom	Greiner	655087	For flourescence measurement in cell-free supernatants
Pipette Research plus multi-channel pipettes	Eppendorf	n/a	Facilitates manual liquid handling with microplates
TruPAG Precast Gels	Sigma	PCG2002	For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
Bradford Reagent	Sigma	B6916
C. glutamicum pCGPhoD^Bs-GFP	n/a	n/a	Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

References

Choi, J. -. M., Han, S. -. S., Kim, H. -. S. Industrial applications of enzyme biocatalysis: Current status and future aspects. Biotechnol Adv. 33 (7), 1443-1454 (2015).
Li, S., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., Wang, X. Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), (2012).
Adrio, J. L., Demain, A. L. Microbial enzymes: tools for biotechnological processes. Biomolecules. 4 (1), 117-139 (2014).
Yim, S. S., An, S. J., Kang, M., Lee, J., Jeong, K. J. Isolation of fully synthetic promoters for high-level gene expression in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 2959-2969 (2013).
Hemmerich, J., et al. Use of a Sec signal peptide library from Bacillus subtilis.for the optimization of cutinase secretion in Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 15 (1), 208 (2016).
Wendisch, V. F. Microbial production of amino acids and derived chemicals: synthetic biology approaches to strain development. Curr Opin Biotechnol. 30, 51-58 (2014).
Lee, J. -. Y., Na, Y. -. A., Kim, E., Lee, H. -. S., Kim, P. The Actinobacterium Corynebacterium glutamicum, an Industrial Workhorse. J Microbiol Biotechnol. 26 (5), 807-822 (2016).
Rohe, P., Venkanna, D., Kleine, B., Freudl, R., Oldiges, M. An automated workflow for enhancing microbial bioprocess optimization on a novel microbioreactor platform. Microb Cell Fact. 11 (1), 144 (2012).
Liu, X., et al. Expression of recombinant protein using Corynebacterium glutamicum.: progress, challenges and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 652-664 (2016).
Freudl, R., Burkovski, A. Corynebacterium glutamicum as a Platform Organism for the Secretory Production of Heterologous Proteins. Corynebacterium glutamicum: From systems biology to biotechnological applications. , 161-177 (2015).
Yim, S. S., et al. Development of a new platform for secretory production of recombinant proteins in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 113 (1), 163-172 (2015).
Limberg, M. H., et al. Metabolic profile of 1,5-diaminopentane producing Corynebacterium glutamicum under scale-down conditions: Blueprint for robustness to bioreactor inhomogeneities. Biotechnol Bioeng. 114 (3), 560-575 (2016).
Käβ, F. Assessment of robustness against dissolved oxygen/substrate oscillations for C. glutamicum DM1933 in two-compartment bioreactor. Bioprocess Biosyst Eng. 37 (6), 1151-1162 (2014).
Teramoto, H., Watanabe, K., Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. High yield secretion of heterologous proteins in Corynebacterium glutamicum.using its own Tat-type signal sequence. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 677-687 (2011).
Freier, L., Hemmerich, J., Schöler, K., Wiechert, W., Oldiges, M., von Lieres, E. Framework for Kriging-based iterative experimental analysis and design: Optimization of secretory protein production in Corynebacterium glutamicum. Eng Life Sci. 16 (6), 538-549 (2016).
Huber, R., Roth, S., Rahmen, N., Büchs, J. Utilizing high-throughput experimentation to enhance specific productivity of an E. coli. T7 expression system by phosphate limitation. BMC Biotechnol. 11 (1), 22 (2011).
Kottmeier, K., Müller, C., Huber, R., Büchs, J. Increased product formation induced by a directed secondary substrate limitation in a batch Hansenula polymorpha culture. Appl Microbiol Biotechnol. 86 (1), 93-101 (2010).
Kennedy, M. J., Krouse, D. Strategies for improving fermentation medium performance: A review. J Ind Microbiol Biotechnol. 23 (6), 456-475 (1999).
Kleman, G. L., Strohl, W. R. Developments in high cell density and high productivity microbial fermentation. Curr Opin Biotechnol. 5 (2), 180-186 (1994).
Jones, R., Gadd, G. Ionic nutrition of yeast: Physiological mechanisms involved and implications for biotechnology. Enzy Microb Technol. 12 (6), 402-418 (1990).
Zhang, J., Greasham, R. Chemically defined media for commercial fermentations. Appl Microbiol Biotechnol. 51 (4), 407-421 (1999).
Kensy, F., et al. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates: Determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time measurement during microbial growth. Biotechnol Bioeng. 89 (6), 698-708 (2005).
Hermann, R., Lehmann, M., Büchs, J. Characterization of gas-liquid mass transfer phenomena in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 81 (2), 178-186 (2002).
Duetz, W. A. Microtiter plates as mini-bioreactors: Miniaturization of fermentation methods. Trends Microbiol. 15 (10), 469-475 (2007).
Funke, M., Diederichs, S., Kensy, F., Müller, C., Büchs, J. The baffled microtiter plate: Increased oxygen transfer and improved online monitoring in small scale fermentations. Biotechnol Bioeng. 103 (6), 1118-1128 (2009).
Lattermann, C., Funke, M., Hansen, S., Diederichs, S., Büchs, J. Cross-section perimeter is a suitable parameter to describe the effects of different baffle geometries in shaken microtiter plates. J Biol Eng. 8, 18 (2014).
Samorski, M., Müller-Newen, G., Büchs, J. Quasi-continuous combined scattered light and fluorescence measurements: A novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 92 (1), 61-68 (2005).
Kensy, F., Zang, E., Faulhammer, C., Tan, R. -. K., Büchs, J. Validation of a high-throughput fermentation system based on online monitoring of biomass and fluorescence in continuously shaken microtiter plates. Microb Cell Fact. 8 (1), 31 (2009).
Puskeiler, R., Kaufmann, K., Weuster-Botz, D. Development, parallelization, and automation of a gas-inducing milliliter-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng. 89 (5), 512-523 (2005).
Bareither, R., Pollard, D. A review of advanced small-scale parallel bioreactor technology for accelerated process development: Current state and future need. Biotechnol Prog. 27 (1), 2-14 (2011).
Hortsch, R., Stratmann, A., Weuster-Botz, D. New milliliter-scale stirred tank bioreactors for the cultivation of mycelium forming microorganisms. Biotechnol Bioeng. 106 (3), 443-451 (2010).
Isett, K., George, H., Herber, W., Amanullah, A. Twenty-four-well plate miniature bioreactor high-throughput system: Assessment for microbial cultivations. Biotechnol Bioeng. 98 (5), 1017-1028 (2007).
Motta Dos Santos, L. F., Coutte, F., Ravallec, R., Dhulster, P., Tournier-Couturier, L., Jacques, P. An improvement of surfactin production by B. subtilis BBG131 using design of experiments in microbioreactors and continuous process in bubbleless membrane bioreactor. Bioresour Technol. 218, 944-952 (2016).
Islam, R. S., Tisi, D., Levy, M. S., Lye, G. J. Framework for the Rapid Optimization of Soluble Protein Expression in Escherichia coli Combining Microscale Experiments and Statistical Experimental Design. Biotechnol Prog. 23 (4), 785-793 (2007).
Huber, R., et al. Robo-Lector: A novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb Cell Fact. 8 (1), 42 (2009).
. Kriging toolKit (KriKit) Available from: https://github.com/modsim/KriKit (2017)
Kensy, F., Engelbrecht, C., Büchs, J. Scale-up from microtiter plate to laboratory fermenter: evaluation by online monitoring techniques of growth and protein expression in Escherichia coli.and Hansenula polymorpha fermentations. Microb Cell Fact. 8 (1), 68 (2009).
Lu, C., Bentley, W. E., Rao, G. A high-throughput approach to promoter study using green fluorescent protein. Biotechnol Prog. 20 (6), 1634-1640 (2004).
Zanzotto, A., Boccazzi, P., Gorret, N., van Dyk, T. K., Sinskey, A. J., Jensen, K. F. In situ measurement of bioluminescence and fluorescence in an integrated microbioreactor. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 40-47 (2006).
Freier, L., von Lieres, E. Multi-Objective Global Optimization (MOGO): Algorithm and Case Study in Gradient Elution Chromatography. Biotechnol J. , (2016).
Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum.: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J Bacteriol. 175 (17), 5595-5603 (1993).
Weuster-Botz, D., Kelle, R., Frantzen, M., Wandrey, C. Substrate Controlled Fed-Batch Production of L-Lysine with Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Prog. 13 (4), 387-393 (1997).
Meissner, D., Vollstedt, A., van Dijl, J. M., Freudl, R. Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 76 (3), 633-642 (2007).
Morschett, H., Wiechert, W., Oldiges, M. Automation of a Nile red staining assay enables high throughput quantification of microalgal lipid production. Microb Cell Fact. 15, 34 (2016).
Fisher, R. A. . The design of experiments. , (1935).
Morschett, H., Freier, L., Rohde, J., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. A framework for accelerated phototrophic bioprocess development: Integration of parallelized microscale cultivation, laboratory automation and Kriging-assisted experimental design. Biotechnol Biofuels. 10, 26 (2017).
Le Loir, Y., et al. Protein secretion in Lactococcus lactis: An efficient way to increase the overall heterologous protein production. Microb Cell Fact. 4 (1), 2 (2005).
Anné, J., Vrancken, K., van Mellaert, L., van Impe, J., Bernaerts, K. Protein secretion biotechnology in Gram-positive bacteria with special emphasis on Streptomyces lividans. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1750-1761 (2014).
Gupta, S. K., Shukla, P. Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (6), 1089-1098 (2016).
Fu, L. L., Xu, Z. R., Li, W. F., Shuai, J. B., Lu, P., Hu, C. X. Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: implication for optimization of heterologous protein secretion. Biotechnol Adv. 25 (1), 1-12 (2007).
Yoon, S., Kim, S., Kim, J. Secretory Production of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Rec Pat Biotechnol. 4 (1), 23-29 (2010).
Hemmerich, J., et al. Comprehensive clone screening and evaluation of fed-batch strategies in a microbioreactor and lab scale stirred tank bioreactor system: application on Pichia pastoris producing Rhizopus oryzae lipase. Microb Cell Fact. 13 (1), 36 (2014).
Glazyrina, J., Krause, M., Junne, S., Glauche, F., Strom, D., Neubauer, P. Glucose-limited high cell density cultivations from small to pilot plant scale using an enzyme-controlled glucose delivery system. New Biotechnol. 29 (2), 235-242 (2012).
Gernaey, K. V., et al. Monitoring and control of microbioreactors: An expert opinion on development needs. Biotechnol J. 7 (10), 1308-1314 (2012).
Rahmen, N., Fulton, A., Ihling, N., Magni, M., Jaeger, K. -. E., Büchs, J. Exchange of single amino acids at different positions of a recombinant protein affects metabolic burden in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 14, 10 (2015).
Rahmen, N., et al. A particular silent codon exchange in a recombinant gene greatly influences host cell metabolic activity. Microb Cell Fact. 14, 156 (2015).
Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in E. coli. J Vis Exp. (89), e51464 (2014).
Scheidle, M., et al. High-throughput screening of Hansenula polymorpha clones in the batch compared with the controlled-release fed-batch mode on a small scale. FEMS Yeast Res. 10 (1), 83-92 (2010).
Baumann, P., Bluthardt, N., Renner, S., Burghardt, H., Osberghaus, A., Hubbuch, J. Integrated development of up- and downstream processes supported by the Cherry-Tag™ for real-time tracking of stability and solubility of proteins. J Biotechnol. 200, 27-37 (2015).
Baumann, P., Hahn, T., Hubbuch, J. High-throughput micro-scale cultivations and chromatography modeling: Powerful tools for integrated process development. Biotechnol Bioeng. 112 (10), 2123-2133 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

Automatically Generated