自動 Microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル

1. 妊娠研究とメソッドの定義 (図 1: A パート) 注: 最適化の目的の定義: 必要なプロダクト形成の時間コースですか限られた時間間隔のみまたは固定時点のものですか?また、安定性、分析の定量化や培養時間の努力などの潜在的な問題を検討してください。最終的な蛋白質価する代わりに、バイオマスや栽培時間などの他の目的が考えられます。バイオマスは、空間時間収量によって、栽培時間を反映しながらバイオマス特定製品の歩留まりに反映されます。(最小) 製品の品質は、目標もあります。多目的最適化は、40他の所で説明したように、特定の状況で必要があります。本研究では栽培の 17 h 後 GFP 抗体価は最適化目的として選ばれました。GFP の蛍光は、簡素化モデル蛋白質の集中の決定本研究で利用できる機器を使用してオンラインに続くことができます。メモ: 最適化するパラメーターの定義: CgXII 中41 16 個々 のコンポーネントで構成され、216 ≈ 65,000 実験と、完全実施要因実験でこれらのすべてを調査します。その結果、検索スペースは合理的かつ経験主導的に減少する必要があります。最適化対象のメディア コンポーネントの選択は、利用可能な専門的な知識や文献データでサポートできます。 どの培地成分濃度を変化しない必要がありますを決定します。CgXII メディアの最適化、次のコンポーネントは、修正される選ばれました。 ブドウ糖 10 g/l. で固定であります。この最適化は、多くのブドウ糖がバイオマスを分泌より GFP を得られますので簡単です。目的は非直感的な中くらい効果を明らかにすることでした。 3-(N morpholino) 42 g/l. で固定である propanesulfonic 酸 (モップ)これは、バッチ培養中に十分なバッファー容量を提供し、代謝されています。注: この最終濃度でモップの添加により追加、他の原液の別のボリュームにも pH 7 の開始値 pH 7 ではないです。しかし、pH 値の開始に任意の偏差を除外する培地成分の最大値と最小のボリュームで在庫のすべてのソリューションを追加する場所の pH をチェックしなければなりません。 KH2PO4と K2HPO4は、1 g/L で固定されます。これらはまたバッファキャパシティを提供、リン酸ソースとして機能します。 尿素 5 g/l. で固定であります。これは、基肥窒素ソースと pH 安定剤、N 制限を防ぐために十分な提供しています。 0.2 mg のビオチンを固定/l. c. 型ATCC13032 はビオチンの栄養です。 プロトカテキュ酸 (PCA) は 30 mg/l. に固定します。それは、鉄キレート剤として機能します。 イソプロピル-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) は、100 μ M で固定されます。それは、 gfp遺伝子の発現を誘導します。 ハイとローの初期感度上映メディア成分濃度を選択します。ここでは、メディア コンポーネントの 3 つの典型的なグループからのコンポーネントが選ばれました。各コンポーネントの調査低および高濃度は次のとおりです。 標準的な窒素源: (NH4)2SO4 (8-32 g/L);窒素源の変化は、バイオマス固有 GFP シグナル8の最適化のために有望であると報じられました。 微量元素: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L)、MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L)、ZnSO4 ∙ 7 H2O (0.4 1.6 mg/L)、CuSO4 ∙ 5 H2O (125 501 μ g/L)、NiCl2 ∙ 6 H2O (8-32 μ g/L) と CoCl2 ∙ 6 H2O (52 208 μ g/L)。微量元素の組成は、CgXII 中41の最初の出版物から継承されます。さらに、ナ2MoO4 ∙ H2O (26 104 μ g/L) と H3ボー CgXII 中42の公開されているバリアントで使用されている3 (20-80 μ g/L) が微量成分として含まれていた。 マクロ要素: MgSO4 ∙ 7 H2O (0.2 0.4 g/L)、CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3 21.2 mg/L)。これらは異なる培地背景と CgR0949 Tat 信号ペプチドc. 型ひずみ R を用いて別研究14、分泌の GFP の生産を高めるために他の 2価陽イオンの間で見つかりました。 材料およびプロシージャが定義の準備注: 定義し、詳細なレベルでの実験の方法を修正する勧めします。この標準化によって、異なる結果は、本質的な生物学的変動や異なる培地成分にさかのぼることができます。注: メディア在庫ソリューション: すべての個々 の貯蔵液の準備メディア コンポーネントを調査します。すべてのコンポーネントに対して異なるボリュームの希釈のために非常に集中して株式を準備します。これは、設計計画によると、最高のボリュームですべて在庫ソリューションを組み合わせた後、最終的な栽培ボリューム、 cf.項「中原液ピペッティング リストの世代」ステップ 1.3.3 を超えることはできませんこれを意味します。高濃度溶液の添加など非常に低ボリュームの場合 < 最終的な栽培量の 1/100thはそれに応じて原液を希釈します。たとえば、本研究ではすることは不可能未満 10 μ L 分注量が定義されました。通常、トレース要素ソリューション、として、高濃縮 1,000fold 培地で最終の標準濃度に関して。参照レシピで濃度に関して (X 倍) の倍数としてメディア コンポーネントを集中すると便利です。これにより小数桁数の実行不可能なピペッティング ボリュームが回避されます。CgXII 媒体のすべての貯蔵液の詳細なレシピは、補足文書で与えられます。 ワーキング ・ セル ・ バンク (WCB)注: 各成長実験 1 つ WCB 因数が使用されます。もっと因数が必要な場合使用 100 mL 脳心臓注入 (BHI) 1,000 mL 困惑中はフラスコを振るまたは複数のシェイク フラスコは、グリセロール溶液添加前にプールを接種します。 組換え発現ひずみC. 型pCGPhoDBsGFP43 (37 g/L BHI 粉、寒天 20 g/L、25 mg/L カナマイシン) 寒天培地プレート上のシングル コロニーを準備します。メッキ来ることができるいずれかの新鮮な変換や凍結因数から。単一のコロニーの外観まで, 30 ° C でこれは、通常 1 〜 2 日かかります。 植民地素材シェーカー フラスコ培養 (25 mg/L カナマイシン、500 mL 困惑してフラスコ、250 rpm、揺れ直径 25 mm、30 ° C で 50 mL BHI 培地) を接種し、, 一晩 (約 16 h)。 500 g/L 滅菌グリセロールの解決の 1 つのボリュームの結果細胞懸濁液の 1 つのボリュームを結合し、滅菌凍結保存バイアル 2 mL 因数で配布します。-80 ° C でストア MBR 栽培プロトコル注: これで雇われた BioLector MBR システムの研究では, 散乱光 (バイオマス) GFP 蛍光、強度の測定は、一定のゲイン値が割り当てられている必要があります。高いほどのゲインが高いほどの光信号を増幅すると;これはまた、任意の単位 (a.u.) での散乱光や蛍光を測定する理由です。バイオマスと一緒に適切な周波数を振動・充填プロセスの後の段階でより高いバイオマス濃度で酸素制限を避けるために量の予備実験で GFP 検出の適切な値を決定します。雇われた栽培条件 (“Flowerplates”、すなわち、お花 48 ウェル Mtp、1,200 rpm の周波数を振動充填量 1,000 μ l、主な炭素源としてブドウ糖を 10 g/L) 確保酸素無制限耕作。他のボリュームを充填し、48 ウェル Mtp の花の形の周波数を振動の組み合わせから生じる最大酸素転送レート、サプライヤーからデータシートがあります。また、セカンダリ基板 (例えば窒素、微量元素) の少量のため個々 の文化の成長欠陥が発生します。したがって、耕作の終わりにバイオマス濃度をチェックします。本研究ではそのような成長の影響は認められなかった。 MBR システム (「BioLector」) の栽培プロトコル次ように定義します。 フィルター セット 1: バイオマス 14 を得る。フィルター セット 2: pH、利得がプリセットです。フィルター セット 3: pO2、ゲインはプリセットです。4: GFP、80 を得る。 振動周波数: 1,200 rpm。 気温: 30 ° c サイクル時間: 15 分。 実験時間: マニュアル (栽培は停止せずに自動的に)。 中型原液ピペッティング一覧の生成注: あらゆる液体搬送ロボット システムはピペッティング操作を外部ファイルから読み取ることが可能です。基本的には、必要最小限の情報は、データ転送量と試薬ソースの位置だけでなく、ロボット デッキと実験器具内にある特定のキャビティの実験器具の位置によって表されるそれぞれの目的地。ただし、異なる液体処理システムの異なる構文を考慮しなければなりません。図 2は、本研究で採用のピペッティング システムのファイル構造の例を示します。 4 種類の原液がよく各栽培に戻します。 メディア コンポーネントのソリューションを株式 (「変異株」) を変化させます。 株の上の別の累積的なボリュームを補うために水。 固定されているすべてのコンポーネントを含む原液の (「残り在庫」)。この原液を含む別の株式から構成できるコンポーネントは、例えば、異なる温度に保存または別の方法で滅菌します。 接種は、最後のコンポーネントとして追加し細胞の定着を避けるために追加の直前に作業テーブル上に置く必要があります。 栽培あたりによるとすべてのメディア コンポーネントに転送するために、ボリュームを計算します。 すなわち、この特定のコンポーネントが省略された場合に、追加する特定の変異株多分ボリュームがゼロします。 適当な数字のVは私すべての計算のボリュームを修正します。ボリュームの手順でピペッティング ボリューム単位は小さすぎていけません。必要な場合は、変異株の濃度を調整します。例えば、ここに最小限のピペッティング ボリュームとして定義されて 10 μ L、5 μ L として定義された最小限のインクリメント。一般に、これらのボリュームは、実験精度と駅15,44の処理に使用される液体の正確さに基づいて定義する必要があります。 次のようにすべての井戸の固定部品を含む残り在庫の量を計算します。 どこ変化株式の最大累積量が使用されます。その結果、次のとして残り在庫固定コンポーネントの必要な濃度を計算します。 それに応じて残りの在庫を準備します。 栽培あたりも、次のように追加する水の量を計算します。 栽培も、あたり追加された次の順序で追加するすべてのボリュームのリスト: VH2O、VRestStockV私、VInok。図 2の例に示すように、駅を処理液の仕様に従ってピペッティング リストを書式します。 種子培養、自動メディア準備、主な文化の開始 液体ハンドリング ロボットのためのプロトコルを作成します。「ヤヌス」システムは、対応する「WinPREP」ソフトウェアで実装例プロトコルは図 3および図 4を参照してください。プロトコルは、次の側面を考慮する必要があります。 メディアの準備する前に滅菌の住居のための十分なランタイムが含まれます。 初期の過剰な洗浄やすべての分注チップの洗浄、チューブがあります。 在庫ソリューションの適切な実験器具のコンテナーを選択します。ここでは、12 列でディープ ウェル プレートは、よく列に並列配置で浸すことができるすべての 8 つのピペッティング ヒントとして変異株ストレージに適しています。これは、メディアの準備が大幅にスピードアップします。貯水池として 15 mL や 50 mL の試薬チューブを使用している場合のみ 1 つのピペット チップを一度にそれにつけてもいい。水と残り在庫のような他の株式は、これらの貯蔵液は合計で高いボリュームを必要とに 100 mL 谷を使用します。 在庫ソリューションごとに廃棄物処理量、高さピペッティング オフセット等を補うために十分な容量を提供します。 種子培養法の直前に、この手順が実施されることを確認、接種手順の前にユーザー プロンプトを挿入します。 適切な容器、例えば、滅菌 15 mL および 50 mL の試験管に使用するまで滅菌方法とストアで在庫のすべてのソリューションを準備します。 70% のエタノールと層流フードでその後乾燥を拭くなど、作業テーブルに原液保存するためディープ ウェル プレートを滅菌します。 25 mg/L、WCB から 1 つの因数とカナマイシンを含む 50 mL BHI 培地に接種して種子の培養を開始します。MBR 栽培前に指数関数的に成長のための十分な量の種子文化から新鮮な重要な接種を準備します。 ロボットの作業テーブルにすべての必要な実験器具を配置し、対応する実験器具で原液を注ぐ。 種子培養の開始に間に合う最後のステップ (接種) が達されるようにメディア制作のロボットのワークフローを開始します。ロボットのワークフローの合計実行時間は、以前に評価する必要があります。ここでは、合計実行時間は約 1.5 時間だった。 約 2 h、光学濃度 (OD600) によって成長を監視するため、それぞれの時間から種子培養をサンプリングします。約 5 時間後文化は 3-4 OD600に達すると、主な文化を接種する使用されます。 液体ハンドラー ワーク テーブル上種子培養を置き、メディアの準備のプロトコルを続行します。接種後栽培 MTP をシールします。 BioLector デバイスで MTP のシールの栽培しあらかじめ定義された耕作プロトコルを起動します。 必要に応じて、バイオ セーフティ規則に従って残り原液を処分でロボット作業テーブルから文化をシードします。再使用可能な器具をきれいにし液体ハンドラー除染プロトコルを起動します。 製品数量と生データ分析のための前処理 17 h ランタイム後主な文化を停止します。 BioLector MBR デバイスから製造元のマニュアルによると BioLection のソフトウェア パッケージを使用して、接続されているコンピューターに測定データを転送します。 使用、「データ管理 → データ変換」便利なスプレッドシート形式に raw データを変換する MBR システムに付属している「BioLection」ソフトウェア パッケージの機能。17 h 参照栽培井戸と平均からの信号は、GFP の識別に最も近いタイムスタンプ列からすべての栽培井戸の GFP 信号データをコピーします。平均基準信号すべて残り GFP シグナルを正規化します。 追加のメソッドを使用して (必要な場合) GFP 抗体価を数値化します。 すべて栽培井戸から prelabeled 反応チューブに細胞懸濁液を転送し、ベンチトップ遠心分離機を使用して最大速度で 10 分間遠心分離後細胞上清を取得します。 各細胞上清 200 μ L に透明底黒 96 ウェル MTP 転送し、488/520 で GFP 特異蛍光を読み取る適切なマイクロ プレート リーダーを使用して nm。1.5.3 のステップのように、参照の耕作からの平均信号のすべての井戸から gfp を正規化します。注: 異なる測定装置の絶対の GFP 蛍光信号を比較できません。したがって、すべての主要な耕作から 5 参照系統は内部標準として機能します。GFP 抗体価の改善は、内部標準に関連して表現できます。さまざまな実験や GFP 定量化方法 (次の 2 つの手順を参照してください) からの結果の比較が可能になります。 標準プロトコル、例えば、ブラッドフォードまたは BCA アッセイと細胞上清の蛋白質内容を決定します。ステップ 2 からの結果と組み合わせて、タンパク質特異 GFP 抗体価の定量が可能です。注: 蛍光測定、このマイクロ プレートから直接サンプルを使用します。マルチ チャンネル ピペットの使用大きくステップの処理に必要な液体が容易になります。 SDS ページの可視化を行う細胞培養上清の GFP 分泌の増加により、増加蛋白質内容のほとんどを確認する標準プロトコルを次します。注: SDS ページはより高いサンプル負荷、特に前述の方法よりも骨の折れるです。確認のため、中規模および最終的な参照から細胞上清の SDS ページ最適化培地栽培15を実行するための十分な頻繁です。 2. 感度解析 (図 1: 一部 B)。 注: この部分の目的は目的に重要な影響を及ぼす重要な要因を識別するためにです。 メディア コンポーネントの初期濃度範囲を選択します。培地成分が参照する必要があります選択した濃度範囲内うそをつきます。 適切な DOE を選択します。そのような設計は、文学、例えば、統計的手法 (www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm で入手可能) の NIST/SEMATECH e 手引から見つけることが。選ばれたデザインは関心のメディア コンポーネントの数によって異なります (ここで 11) と実行実験数 (ここで 32)。特定の例をし興味の目的に 11 のコンポーネントのいずれかの濃度を増加させる効果の推定を許可する 32 の実験結果「2IV11-6」のデザインが選ばれました。具体的には、主な効果はない対因子相互作用混同します。彼らはより高い順序の相互作用と混同することができますは、しかし、ほとんどない重要な。 残りの井戸を使用して (ここで 16) プロセスの再現性を評価するために参照媒体の複数の複製を実行するため。複製は、ポジショニング エフェクトを発見する板の上に均等に分けてください。参照実験から測定された出力の平均値は、正規化されます。つまり、感度分析の各測定の出力は、参照の出力の平均値で除算されます。 メインの計算と組み合わせ効果が適切な統計ソフトウェアを使用可能な場合。実験の古典的なデザインは、45の多項式近似に基づいています。例えば、多項式の係数の推定の MATLAB 関数 mvregress を使用できます。Mvregress 関数は、統計と機械学習ツールボックスの一部です。 T検定を用いて目的に関連のある各種メディア効果を識別します。例では、NH4+には有意な負の効果を示し Ca2 +と Mg2 +最強の肯定的な効果 (図 5)。その中心値から特定のコンポーネントの濃度を増加させるときに係数が GFP シグナルの平均の相対的な変化を表します GFP シグナルが正常化したので、最大値。 関連する効果なし固定コンポーネントは、最適化の間、基準値にされます。 3. 反復最適化 (図 1: C) 注: KriKit 解釈の統計的データ分析36使用された MATLAB ツール。KriKit では、データ駆動型クリギング モデルを構築することができます。このクリギング モデルは、メディア コンポーネントと目的の機能の関係を予測します。また、予測の不確実性についても説明します。高い不確実性には、ノイズの多いデータおよび/または不十分なデータ密度を示します。 DOE注: 新しい実験が繰り返しに基づいて設計されて、以前の実行の結果。 最初のイテレーションでは、目的の特定メディア コンポーネントの詳細な調査のための新しい実験をデザインします。セクション 2 から実験結果は、関連する効果なし成分濃度がそれぞれの基準値に修正今、反復最適化 (セクション 3) に転送できません。その結果、感度解析と最適化反復実験は比較されていません。 それ以外の場合に示す図 1フレーム「反復最適化」スキームに従ってください。潜在的な最適な定義された濃度範囲の内側にある、新しい実験は、予想される改善40,46を使用して設計されています。予想される改善に基づく実験的なデザインは、KriKit ツールボックスに統合されています。最適な境界上にある、する場合は、濃度範囲を展開します。 セクション 2 で定義されている実験方法に従って設計されたサンプル点で実験を実行します。 統計解析 現在を含むすべてのイテレーションから結合されたデータを用いたクリギング モデルを構築します。 KriKit (2/3 D 補間、映画分析、プロット等をスクリーニング) の包括的なツールを使用して可視化によるモデルの出力を調べます。 最適な領域を十分な精度で推定された場合は、最適化を停止します。ない場合は、ステップ 3.1 を続行します。注:図 6試験学習のための最適化反復を示します。濃度範囲を高原が見つかりました (イテレーション 1-6) まで引き続いて増築。7 番目のイテレーションより詳細に境界を探索に使われました。 4. 結果の検証 (図 1: D 部) 注: 反復最適化が終わったら、最初の仮定の妥当性をチェックする必要があります。 感度解析 (セクション 2) 最適な培地組成のやり直し。つまり、図 1 (C パート) で検討した成分の濃度は、それぞれの最適値に固定されます。その他の成分濃度は適切なエネルギー省によるとさまざまです。注: 両方の上映で同様の結果は、調査の成分の濃度は、他の成分の効果を変更しないことを示します。スクリーニングは、B 部から結果に有意な差を示している場合, コンポーネントのプールに変更された効果を持つコンポーネントを追加するか、C の部分を繰り返す必要があります。 間接測定 (例えば、製品濃度の指標として蛍光)、場合において直交計測手法 (例えば活性、ブラッドフォード、BCA タンパク質定量、sds-page) 変更を確認するには参照媒体と最適化された中型15からの結果を比較することによって興味の目的。