Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Johannes Hemmerich; Lars Freier; Wolfgang Wiechert; Eric von Lieres; Marco Oldiges

doi:10.3791/56234

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Bioengineering

Protocole générique pour l’optimisation de la Production de protéines hétérologues à l’aide de la technologie automatisée de MICROBIOREACTEUR

Published: December 15, 2017

doi:

10.3791/56234

Johannes Hemmerich*^1,2, Lars Freier*^1,2, Wolfgang Wiechert^1,2,3, Eric von Lieres^1,2, Marco Oldiges^1,2,4

¹IBG-1: Biotechnology,Forschungszentrum Jülich, ²Research Center Jülich,Bioeconomy Science Center (BioSC), ³Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB),RWTH Aachen University, ⁴Institute for Biotechnology,RWTH Aachen University

Summary

Ce manuscrit décrit une approche générique pour une conception sur mesure de supports de culture microbienne. Cette option est activée par un flux de travail itératif combinant krigeage experimental design et MICROBIOREACTEUR technologie pour un débit suffisant la culture, qui est pris en charge par robotics lab pour augmenter la fiabilité et la rapidité dans la manipulation des médias de liquides préparation.

Abstract

Des aspects essentiels en matière de biotechnologie industrielle utilisant des usines de cellules de production microbienne sont le processus itératif de l’ingénierie de la souche et l’optimisation des conditions de bioprocédés. Un aspect important est l’amélioration du milieu de culture pour fournir un environnement optimal pour la formation microbienne du produit d’intérêt. Il est bien établi que la composition de médias peut influencer considérablement la performance globale de bioprocédés. Optimisation moyenne nutrition est connue pour améliorer la protéine recombinante production avec les systèmes microbiens et donc, c’est une étape enrichissante dans le développement de bioprocédés. Toutefois, les recettes des médias très souvent standard proviennent de littérature, depuis la conception sur mesure de la milieu de culture est une tâche fastidieuse qui exige la technologie MICROBIOREACTEUR pour un débit suffisant culture, analytique rapide produit, ainsi que soutien par robotique de laboratoire pour permettre la fiabilité dans les étapes de manipulation de liquides. En outre, des méthodes mathématiques avancées sont nécessaires pour analyser rationnellement les données de mesure et concevoir efficacement des expériences parallèles comme pour atteindre le contenu de l’information optimale.

Le caractère générique du protocole présenté permet une adaptation facile au matériel de laboratoire différents hôtes de l’expression et autres protéines cibles d’intérêt, ainsi que d’autres paramètres de bioprocédés. En outre, autres objectifs d’optimisation comme taux de production de protéines, le rendement spécifique ou la qualité des produits peuvent être choisies pour s’adapter à la portée des autres études d’optimisation. La Toolbox de krigeage appliquée (KriKit) est un outil général pour conception d’expériences (DOE) qui contribue à l’optimisation de bioprocédés globale améliorée. Il soutient également l’optimisation multi-objectif qui peut être importante dans l’optimisation des processus en amont et en aval.

Introduction

Technologie moderne gène recombinant permet l’utilisation de techniques enzymes pour différentes applications dans l’industrie pharmaceutique, l’alimentation animale, chimie organique et l’Agroalimentaire¹^,²^,³. La production d’enzymes techniques en vrac est un thème majeur pour la biotechnologie industrielle et la production de protéines recombinantes optimisé et les deux de la souche et génie des bioprocédés est nécessaire. Pour la génération des souches efficacement ingénierie production, différentes bibliothèques génétiques sont disponibles, par exemple, pour équilibré gene expression⁴ ou augmentation de la sécrétion efficacité⁵.

Corynebacterium glutamicum est un important producteur d’acides aminés à l’échelle industrielle⁶^,⁷ et représente un hôte d’expressions non conventionnelles attrayant pour la production de sécrétion de protéines recombinantes⁸ ^,,⁹. Voie de translocation à arginine (Tat) tant générales sécrétoire (s) sont présents dans c. glutamicum et ont été appliqués avec succès pour la sécrétion de protéine recombinante¹⁰. Une vaste expérience en génie des bioprocédés concernant la production d’acides aminés à l’échelle industrielle, ainsi que la capacité de sécréter des protéines g/L montants¹¹ et grande robustesse concernant des inhomogénéités de bioprocédés trouvées à grande échelle cultures¹²^,¹³, faire glutamicum c. un organisme de plate-forme prometteuse pour la production de sécrétion de protéines hétérologues à l’échelle industrielle.

Optimisation moyenne nutrition est connue pour améliorer la production de protéines recombinantes avec systèmes microbiens¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ et par conséquent, l’adaptation du milieu la composition est une étape enrichissante en bioprocédés relativement à une productivité optimale¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. D’intenses recherches sur l’application de plaques de microtitration (MTP) pour culture microbienne²²^,²³^,²⁴ a ouvert la voie pour le développement et la conception de MTP pour culture microbienne²⁵ ^,²⁶ et le développement de systèmes axés sur les MTP MICROBIOREACTEUR (MBR) avec suivi en ligne et de l’environnement de contrôle²⁷^,²⁸. MBRs permettent une augmentation significative en matière de culture expérimentale. En outre, les systèmes MBR découlant des autres types de bioréacteurs, par exemple, les colonnes de bulles ou réservoir agité réacteurs, sont disponibles pour microbial bioprocess optimisation²⁹^,³⁰^,³¹^, ³².

En règle générale, études d’optimisation de bénéficient d’un débit plus élevé expérimental, qui devient encore plus puissant en combinaison avec des méthodologies DOE, telles qu’évaluer les interactions entre variables de conception ou de réduire les espaces de grande dimension recherche. Par conséquent, l’utilisation combinée de systèmes MBR, l’automatisation de laboratoire et DOE s’est avérée pour être une méthode puissante en biotechnologie⁸^,¹⁶^,³³^,³⁴^,³⁵.

Un protocole pour l’optimisation des médias est présenté combinant state-of-the-art lab d’automatisation, technologie MBR avec surveillance des processus en ligne et données orientées sur le krigeage analyse/experimental design. La méthodologie de krigeage est implémentée dans une boîte à outils MATLAB (« KriKit ») qui peut être téléchargé et utilisé gratuitement frais³⁶. Comme exemple d’application, la maximisation de la production de protéine (GFP) sécrétrices ﬂuorescentes vert avec c. glutamicum est montrée en optimisant la composition d’un milieu minimal CgXII. Titre de la GFP a été choisi comme l’objectif d’optimisation car il peut être quantifié facilement et elle est largement appliquée comme protéine modèle pour les études sur le MBR systèmes³⁷^,³⁸^,³⁹.

Le cadre présenté est divisé en quatre étapes, qui sont illustrées dans la Figure 1. Les étapes sont indiquées par des cadres de la boîte et correspondent aux sections du protocole. La première étape (Figure 1 a) est de définir les objectifs du projet et de déterminer les méthodes requises. La combinaison de méthodologies DOE, la technologie MBR et automatisation de laboratoire permet un débit accru expérimental qui exige le traitement de données puissant. La deuxième étape (Figure 1 b) a pour but de détecter les variables de conception sensible (c’est-à-direles composants moyennes) avec une forte influence sur l’objectif d’optimisation. Cela conduit à un nombre réduit de variables de conception d’intérêt. La troisième étape (Figure 1) comprend une optimisation itérative pour une étude plus détaillée de la relation fonctionnelle entre les variables restantes de la conception et l’objectif d’intérêt. En utilisant le jeu de données successivement étendu, l’approche de krigeage est appliquée pour prédire le résultat expérimental aux endroits non mesurés. Le cycle itératif s’arrête dès que le modèle de krigeage prédit un optimum ou un plateau avec une précision suffisante. Les résultats sont vérifiés dans la quatrième étape (Figure 1), commençant par une autre analyse de sensibilité autour de l’optimum identifié. Si au départ, les composants insensibles se trouvent être insensible aussi dans la région optimale, il est raisonnable de supposer que c’est le cas au cours de la procédure d’optimisation itérative dans la troisième étape. Par la suite, il est conseillé de vérifier les résultats de l’optimisation par l’application de méthodes orthogonales, comme une analyse de l’activité ou SDS-Page.

Le caractère générique du protocole présenté permet adaptation facile au matériel de laboratoire différents, autres hôtes expression et protéines cibles de choix, mais aussi des bioprocédés autres variables comme la température de culture ou de la valeur pH.En outre, les autres objectifs d’optimisation comme taux de production de protéines, le rendement spécifique ou la qualité des produits peuvent être choisies pour s’adapter à la portée des autres études d’optimisation.

Figure 1 : Flux de travail d’étude d’optimisation. Les boîtes de quatre châssis correspondent aux sections du protocole, « Concevoir l’étude et définition de méthodes » (Section 1), « Sensitivity Analysis » (article 2), « Optimisation itérative » (article 3) et « Validation » (article 4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. concevoir l’étude et la définition des méthodes (Figure 1: partie A) NOTE : Définition de l’objectif d’optimisation : est un cours de temps de formation de produit nécessaire ou n’est seulement un intervalle de temps limitées ou même d’un point de temps fixe pertinent ? Aussi, pensez à des problèmes potentiels tels que de la stabilité, l’effort de quantification analytique, ou culture temps. Comme alternative au titre de la protéine finale, les autres objectifs sont envisageables telles que la biomasse ou la culture. La biomasse est reflétée par rendement en biomasse produit spécifique, tandis que le temps de la culture se reflète par espace-temps-temps-rendement. Qualité des produits (minimum) pourrait aussi être un objectif. Optimisation multi-objectif peut être nécessaire dans certaines situations, tel que discuté ailleurs40. Dans cette étude, le titre GFP après 17 h de culture a été choisi comme l’objectif d’optimisation. Fluorescence GFP peut être suivi en ligne en utilisant le matériel disponible dans cette étude, ce qui simplifie grandement la détermination de la concentration de la protéine modèle.Remarque : Définition des paramètres à optimiser : le milieu CgXII est composé de 16 composants individuels41 et étudier tous ces selon un plan factoriel complet entraînerait 216 ≈ 65 000 des expériences. Par conséquent, l’espace de recherche doit être réduite de façon rationnelle et éprouvées. La sélection des composants media considéré pour l’optimisation peut être soutenue par des connaissances spécialisées disponibles ou des données de la littérature. Décider lesquels des concentrations moyennes de composant ne devraient pas être modifiées. Pour l’optimisation du milieu CgXII, les composants suivants ont été choisis pour être fixé : Glucose est fixé à 10 g/L. Cette optimisation est triviale, car plus de glucose donne plus GFP sécrétant de la biomasse. L’objectif était de révéler des effets du milieu non intuitives. 3-(N-morpholino) sulfonique (MOPS) est fixé à 42 g/L. Ceci fournit une capacité tampon suffisante pendant la culture lot et n’est pas métabolisé.Remarque : L’ajout de vadrouilles à cette concentration finale assure une valeur de pH 7, même avec les différents volumes des autres solutions stocks ajoutées, qui ne sont pas à un pH de 7. Toutefois, afin d’exclure toute déviation à partir des valeurs de pH, le pH doit être vérifié pour des compositions moyennes où toutes les solutions mères sont ajoutées à leurs maximum et minimum des volumes. KH2PO4 et K2HPO4 sont fixés à 1 g/L de chaque. Elles proposent également de pouvoir tampon et comme une source de phosphate. Urée est fixée à 5 g/L. Cela sert comme source d’azote basale et agent de stabilisateurs de pH, suffisant pour empêcher la limitation N. Biotine est fixé à 0,2 mg/L. c. glutamicum ATCC13032 est auxotrophe pour la biotine. L’acide protocatéchuique (PCA) est fixé à 30 mg/L. Il sert comme un fer à repasser un agent chélateur. Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) est fixé à 100 µM. Il induit l’expression de gène de la gfp . Sélectionnez hautes et basses concentrations de composants de médias pour des projections de la sensibilité initiale. Ici, les composants de trois groupes typiques de composants de médias ont été choisis. Les concentrations basses et hautes étudiées pour chaque composant sont : Source d’azote standard : (NH4)2SO4 (8-32 g/L) ; la variation de la source d’azote a été signalée à être prometteur pour l’optimisation de la biomasse spécifique GFP signal8. Oligo-éléments : FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L), MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L), ZnSO4 ∙ 7 H2O (0,4 à 1,6 mg/L), CuSO4 ∙ 5 H2O (501-125 µg/L), NiCl2 ∙ 6 H2O () 8-32 µg/L) et CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 µg/L). La composition des oligo-éléments est héritée de la première publication du moyen CgXII41. En outre, Na2MoO4 ∙ H2O (26-104 µg/L) et H3BO3 (20-80 µg/L) ont été incluses dans les éléments traces, puisqu’ils sont utilisés dans une variante publiée du moyen CgXII42. Macro éléments : MgSO4 ∙ 7 H2O (0,2 à 0,4 g/L), CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3-21,2 mg/L). On les trouve entre autres cations divalents pour améliorer secrétrices production GFP dans une autre étude14, où c. glutamicum souche R a été utilisée avec un fond différent moyen et le peptide signal CgR0949 Tat. Préparation des matériels et méthodes de définitionRemarque : Il est conseillé de définir et de fixer les méthodes expérimentales à un niveau détaillé. Cette normalisation garantit que des résultats différents peuvent être retracées à la variabilité biologique intrinsèque ou compositions moyennes différentes.NOTE : Media solutions en stock : préparer des solutions individuelles pour tous étudié les composants media. Préparer des stocks hautement concentrés pour permettre la dilution de volumes différents pour tous les composants. Cela signifie qu’après avoir combiné les solutions-mères à leur volume le plus élevé selon le plan de la conception, cela ne peut pas dépasser le volume final de la culture, cf. les étape de « Génération de liste de pipetage solution stock moyen » du paragraphe 1.3.3. Si l’ajout d’une solution très concentrée se traduit par un volume très faible addition, par exemple < 1/100ème du volume final de la culture, diluer la solution mère en conséquence. Par exemple, dans cette étude un pipetage volume de moins de 10 µL est défini pour être infaisable. En règle générale, les solutions d’oligo-élément sont aussi haut concentrées comme 1,000fold en ce qui concerne la concentration finale de standard dans le milieu. Il est avantageux de se concentrer les composants media comme multiples (X fois) en ce qui concerne les concentrations dans la recette de référence. Ce faisant, des volumes de pipetage infaisables de fractions décimales sont évités. Les recettes détaillées pour toutes les solutions mères de milieu CgXII figurent dans le document complémentaire. Banque de cellules de travail (CAT)Remarque : Pour chaque expérience de croissance, un CAT aliquote est utilisé. Si plusieurs parties aliquotes sont nécessaires, utilisation 100 mL cerveau coeur infusion (BHI) moyen dans 1 000 mL dérouté agiter les flacons ou ensemencer des flacons agitateurs multiples, où sont regroupés avant l’ajout de solution de glycérol. Préparer des colonies individuelles de l’expression recombinante souche c. glutamicum pCGPhoDBs- GFP43 sur plaques de gélose (poudre BHI 37 g/L, agar de 20 g/L, kanamycine 25 mg/L). Matériel d’électrodéposition peut soit proviennent de transformation fraîche ou d’une partie aliquote cryoconservée.Incuber à 30 ° C jusqu’à l’apparition des colonies individuelles ; Cela prend habituellement un ou deux jours. Ensemencer un shaker flacon (50 mL de milieu de BHI avec dérouté fiole de 500 mL, 250 tr/min, 25 mm, diamètre de secousses, kanamycine 25 mg/L, 30 ° C) avec du matériel de la colonie et incuber pendant la nuit (environ 16 h). Mélanger un volume de suspension de cellules qui en résulte avec un volume de solution de glycérol stérile 500 g/L et réparti en parties aliquotes de 2 mL dans des fioles de cryoconservation stérile. Conserver à-80 ° C. Protocole de culture de MBRRemarque : Pour le système de BioLector MBR indépendant dans cette étude, la lumière diffuse (biomasse) et la fluorescence GFP sont des mesures d’intensité, qui ont besoin d’une certaine valeur de gain assignée. Plus le gain est élevé, plus le signal optique est amplifié ; C’est aussi pourquoi la lumière dispersée et fluorescence sont mesurés en unités arbitraires (u.a.). Déterminer les valeurs de gain approprié pour la biomasse et de la détection de la GFP dans des expériences préliminaires, ainsi que le secouant la fréquence appropriée et de volume pour éviter la prescription d’oxygène à des concentrations plus élevées de la biomasse au cours des étapes ultérieures du processus de remplissage. Les conditions de culture indépendants (« Flowerplates », c’est-à-direen forme de fleur 48 puits MTP, secouant la fréquence de 1 200 tr/min, volume 1 000 µL, 10 g/L de glucose comme source principale de carbone remplissant) assuré d’oxygène illimité de cultures. Des taux de transfert maximal d’oxygène résultant d’autres combinaisons de volumes de remplissage et de poignées de fréquences en MTP de 48 puits en forme de fleur, les fiches techniques du fournisseur sont disponibles. En outre, défauts de croissance des cultures individuelles peuvent se produire en raison de faibles quantités de substrats secondaires (par exemple, azote, oligo-éléments). Par conséquent, de vérifier la concentration de la biomasse à la fin des cultures. Dans cette étude, aucun effet croissance ont été observées. Définir le protocole de culture pour le système MBR (« BioLector ») comme suit : Filterset 1 : Biomasse, gagner 14. Filterset 2 : pH, le gain est préréglée. Filterset 3 : pO2, le gain est préréglée. 4 : GFP, gagner 80. Secouant la fréquence : 1 200 tr/min. Température : 30 ° C. Durée : 15 min. Temps de l’expérience : Manuel (culture n’est pas automatiquement interrompue). Génération de liste de pipetage solution stock moyenRemarque : N’importe quel liquide système robot de manutention est capable de lire les actions pipetage de fichiers externes. Fondamentalement, l’information minimale nécessaire est le volume de transfert et de la position de la source de réactif, ainsi que la destination de chacun représenté par une position de matériel de laboratoire sur le pont robotique et une cavité spécifique au sein du platine. Cependant, on doivent considérer les syntaxes différentes pour différents liquides, systèmes de manutention. Figure 2 montre une structure de fichiers d’exemple pour le système de pipetage indépendant dans cette étude. Quatre types de solutions mères sont distribués dans chaque culture bien : Stock de composants de médias qui sont des solutions variées («Variation de Stocks»). Eau pour compenser différents volumes cumulés d’au-dessus de stocks. Une solution-mère («Reste Stock») contenant tous les composants qui ont été fixés. Cette solution-mère peut être composée de stocks contenant les différents composants qui sont, par exemple, conservés à des températures différentes ou stérilisés selon des méthodes différentes. Inoculum, qui devrait être ajouté en tant que le dernier composant et mettre sur la table de travail juste avant l’ajout d’éviter de s’installer des cellules. Par culture, Eh bien, calculez les volumes d’être transféré pour tous les composants de médias selon : Le volume à ajouter pour certains Stocks de Variation peut-être zéro, c’est-à-dire, lorsque cet élément est omis. Réviser tous les volumes calculés Vj’ai pour les numéros appropriés. Pipetage augmentations de volume des mesures de volume ne doivent pas être trop petites. Si nécessaire, ajuster la concentration de Variation de Stocks. Par exemple, le volume minimal pipetage ici a été défini comme 10 µL et l’incrément minimal a été défini comme 5 µL. En général, ces volumes doivent être définies en fonction déterminée expérimentalement de précision et d’exactitude pour le liquide usagé manutention station15,44. Calculer le volume de Stock reste contenant les composants fixes pour tous les puits comme suit : où le volume cumulatif maximal de Variation Stock est utilisé. En conséquence, calculer les concentrations requises des composants en Stock reste fixes comme suit : Préparer le Stock reste en conséquence. Par culture, calculer le volume d’eau à ajouter comme suit : Par puits de culture, de la liste tous les volumes à ajouter dans l’ordre suivant d’addition : VH2O, VRestStock, Vi, VVermeulen. Mettre en forme la liste pipetage selon les spécifications du liquide manutention station, tel qu’illustré par un exemple dans la Figure 2. La culture de semences, préparation automatisée des médias et début de culture principale Créer un protocole pour le robot de manipulation de liquides. Voir Figure 3 et Figure 4 pour un protocole de l’exemple d’un système de « Janus », mis en œuvre dans le logiciel « WinPREP » correspondant. Le protocole devrait examiner les aspects suivants : Inclure une autonomie suffisante de logements stérile avant la préparation du support. Incluent un nettoyage excessif initial et lavage de tous les conseils de pipetage et de tubes. Le choix de conteneurs de matériel de laboratoire appropriées pour solutions mères. Ici, plaques de puits profonds avec 12 colonnes conviennent pour la conservation des Stocks de Variation, car tous les huit conseils de pipetage peuvent plonger dans un arrangement parallèle dans les colonnes de bien. Cela accélère grandement préparation de médias. Si les tubes de 15 mL ou 50 mL sont utilisés comme réservoirs, qu’une seule pointe de pipetage peut plonger dedans en même temps.Pour d’autres stocks comme l’eau et Reste Stock, auges 100 mL sont utilisés, comme ces solutions courantes exigent des volumes plus élevés, au total. Fournir un volume suffisant de total pour chaque solution mère compenser les volumes de déchets, pipetage décalages de hauteur, etc. Insérer une invite utilisateur avant l’étape de l’inoculation, veiller à ce que cette étape est effectuée immédiatement avant l’intervention de la culture de semences. Préparer toutes les solutions de façon stérile et magasin jusqu’à l’utilisation, dans un emballage adéquat, par exemple, stérile de 15 mL et 50 mL tubes à essai. Stériliser les plaques de puits profonds pour le stockage de solution-mère sur une table de travail, par exemple, en frottant avec l’éthanol à 70 % et un séchage ultérieur dans une hotte à flux laminaire. Démarrer la culture de semences en inoculant 50 mL de milieu de BHI contenant kanamycine 25 mg/L avec une aliquote de la CAT. Avant la culture de MBR, préparer un inoculum frais, vital d’en croissance exponentielle des cultures de semences dans une quantité suffisante. Placer tous les matériel de laboratoire nécessaire sur la table de travail robotisé et versez-y solutions mères du platine correspondant. Démarrer le flux de travail robotisé pour la préparation des médias, alors que la dernière étape (inoculation), est atteint en un temps avec le début de la culture de semences. La duree totale du flux de travail robotique doit être évaluée auparavant. En l’espèce, la duree totale était environ 1,5 h. L’échantillon de la culture de semences après environ 2 h, puis chaque heure, à surveiller la croissance de la densité optique (OD600). Après environ 5 h, la culture atteint 3-4 OD600 et sert à ensemencer la culture principale. Placer la culture de semences sur la table de travail gestionnaire liquide et continuer le protocole de préparation de médias. Sceller la culture du PSG après l’inoculation. Placer la culture scellée du PSG dans le dispositif de BioLector et de commencer le protocole de culture prédéfinis. Disposer les solutions mères restantes, conformément à la réglementation de la prévention des risques biotechnologiques si nécessaire et la culture de la table de travail robotisé des graines. Nettoyer le matériel de laboratoire réutilisable et commencer le protocole de décontamination liquide gestionnaire. Quantification de produit et le prétraitement des données brutes pour l’analyse La culture principale s’arrête après une durée de 17 h. Transférer les données de mesure du dispositif BioLector MBR vers l’ordinateur connecté à l’aide du progiciel BioLection selon le manuel d’utilisation du fabricant. Utiliser la « gestion des données → transformer les données » fonction du logiciel « BioLection » qui accompagne le système MBR pour convertir le fichier de données brutes dans un format de feuille de calcul d’un accès facile. Copiez les données de signal GFP pour tous les puits de culture la plus proche de vous à 17 h. identifiez la GFP signaux depuis les puits de culture de référence et la moyenne de colonne timestamp. Normaliser tous les signaux GFP restants par le signal de référence moyenne. Quantifier le titre GFP en utilisant des méthodes supplémentaires (si nécessaire) Transférer les suspensions cellulaires de tous les puits de culture dans des tubes de réaction pré-étiquetée et obtenir le surnageant acellulaire après centrifugation pendant 10 min à la vitesse maximale à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse. Transférer 200 µL de chaque surnageant acellulaire dans un noir PSG 96 puits à fond transparent, et lire la fluorescence spécifique de GFP à 488/520 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques approprié. Normaliser le signal de la GFP de tous les puits avec un signal moyen de cultures de référence, comme au point 1.5.3.Remarque : Les signaux de fluorescence GFP absolues n’est pas comparable pour les appareils de mesure différentes. Par conséquent, 5 souches de référence de toutes les cultures principales servent comme étalon interne. L’amélioration du titre GFP peut être exprimée par rapport à l’étalon interne. Cela permet de comparer des résultats des différentes expériences et différentes méthodes de quantification de GFP (voir les deux étapes suivantes). Déterminer la teneur en protéines des surnageants acellulaires avec des protocoles standard, par exemple, test de Bradford ou BCA. En combinaison avec les résultats de l’étape 2, la détermination d’un titre GFP spécifique de protéines est possible.Remarque : Après la mesure de la fluorescence, utilisez l’exemple directement à partir de ce microplaque. Utilisation des pipettes multicanaux facilite grandement la manipulation étapes de liquides nécessaires. Effectuer une visualisation de SDS-Page des surnageants acellulaires suite de protocoles standard pour vérifier que la majeure partie de la teneur en protéines augmentation est due à l’augmentation de la sécrétion GFP.NOTE : SDS-Page est plus laborieuse que les méthodes mentionnées précédemment, surtout avec une charge élevée d’échantillon. Aux fins de vérification, il est souvent suffisant pour exécuter que SDS-Pages des surnageants acellulaires de référence moyen et final optimisé cultures moyen15. 2. sensitivity Analysis (Figure 1: partie B). Remarque : L’objectif de cette partie est d’identifier les facteurs importants qui ont un effet significatif sur l’objectif. Choisissez une gamme de concentration initiale des composants media. La composition moyenne de référence devrait se situer à l’intérieur des gammes de concentration choisie. Choisissez une DOE appropriée. Ces modèles se trouvent dans la littérature, par exemple, du NIST/SEMATECH e-Manuel des méthodes statistiques (disponible à www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). La conception choisie dépend de nombre de composants de médias d’intérêt (en l’occurrence, 11) et le nombre d’expérimentations effectuées (en l’occurrence, 32). Dans l’exemple donné, conception «IV2,11-6» a été choisie qui se traduit par 32 expériences et permet d’estimer l’effet de l’augmentation de la concentration de l’un des onze composants sur l’objectif d’intérêt. Pour être plus précis, les principaux effets ne sont pas confondus avec des interactions de facteur par paires. Ils peuvent être confondus avec des interactions d’ordre supérieures qui sont, cependant, probablement pas significatif. Utilisez les autres cupules (en l’occurrence, 16) pour l’exécution de multiples répétitions avec le milieu de référence pour évaluer la reproductibilité du processus. Réplicats devraient être également réparties entre la plaque à la découverte des effets de position. La valeur moyenne de la production mesurée par les expériences de référence est utilisée pour la normalisation. Autrement dit, chaque sortie mesuré de l’analyse de sensibilité est divisé par la valeur moyenne de la production de référence. Calculer le principal et si possible les effets combinatoires à l’aide de logiciels statistiques appropriées. La conception classique de l’expérience est basée sur une approximation polynomiale45. Par exemple, le mvregress de fonction MATLAB peut être utilisé pour estimer les coefficients polynomiaux.La fonction de mvregress fait partie de la statistique et de la boîte à outils d’apprentissage automatique. Identifier les effets pertinents des différents composants de médias sur l’objectif en utilisant un test t. Dans l’exemple, NH4+ a un effet négatif significatif, et Ca2 + et Mg2 + montrent les effets positifs plus fortes (Figure 5). Parce que le signal de la GFP a été normalisée, les coefficients représentent l’évolution relative moyenne du signal de GFP lors de l’augmentation de la concentration de l’élément particulier de sa valeur de centre, , à sa valeur maximale. Des éléments fixes sans effet pertinent sont à leur valeur de référence au cours de l’optimisation. 3. itérative optimisation (Figure 1: partie C) Remarque : l’outil MATLAB KriKit a été utilisée pour l’interprétation et l’ analyse de données statistiques36. KriKit permet à l’utilisateur de construire un modèle de krigeage pilotés par les données. Ce modèle de krigeage prédit la relation fonctionnelle entre les composants de médias et de l’objectif. Il fournit également des informations sur l’incertitude de prédiction. Degré d’incertitude élevé indique données bruitées et/ou de la densité des données insuffisantes. DOENOTE : Nouvelles expériences sont conçus par itération, basé sur les résultats de l’exécution précédente. Dans la première itération, conception de nouvelles expériences pour l’étude détaillée des composantes médiatiques identifiées d’intérêt. Les résultats expérimentaux de l’article 2 ne peuvent être transférées à l’optimisation itérative (Section 3), que les concentrations des composants sans effet pertinente sont désormais fixées à la valeur de référence respectifs. Par conséquent, les expériences de l’analyse de sensibilité et de l’optimisation itérative ne sont pas comparables. Dans le cas contraire, suivez le schéma illustré à la Figure 1, cadre « Optimisation itérative ». Si le potentiel optimal se situe dans la fourchette de concentration définie, les nouvelles expériences sont conçus à l’aide de l’amélioration attendue40,46. Le protocole expérimental basé sur l’amélioration attendue est intégré dans la boîte à outils KriKit. Si l’optimum se situe sur la frontière, élargir la gamme de concentration. Réaliser des expériences sur les points d’échantillonnage conçu selon des méthodes expérimentales définies à l’article 2. Analyse statistique Construire un modèle de krigeage en utilisant les données combinées de toutes les itérations, y compris la présente. Enquêter sur les résultats du modèle de visualisation grâce aux outils complets de KriKit (interpolation 2/3D, analyse de film, dépistage de terrain, etc.). Si une zone optimale a été estimée avec une précision suffisante, arrêter l’optimisation. Si ce n’est pas le cas, passez à l’étape 3.1.Remarque : La Figure 6 illustre l’optimisation itérative pour l’étude de test. La gamme de concentration a été successivement étendue jusqu’à ce qu’un plateau a été trouvé (itération 1-6). La septième itération a été utilisée pour explorer les limites plus en détail. 4. vérification des résultats (Figure 1: partie D) Remarque : Après avoir terminé l’optimisation itérative, les hypothèses initiales doivent être vérifiés pour la validité. Refaire une analyse de sensibilité (Section 2) pour la composition du milieu optimale. Autrement dit, les concentrations des composants qui sont étudiées dans la Figure 1 (partie C) ont été fixées à leurs valeurs optimales. Les concentrations d’autres composants sont variées selon une DOE appropriée.Remarque : Des résultats similaires dans les deux projections indiquent que les niveaux de concentration des composants étudiés n’altèrent pas l’effet des autres composants. Si l’examen préalable montre une différence significative aux résultats de la partie B, composantes ayant un effet modifié doivent être ajoutées à l’ensemble des composants étudiés et partie C doit être répétée. Dans le cas d’une mesure indirecte (par exemple, fluorescence comme indicateur pour la concentration de produit), appliquer les méthodes de mesure orthogonales (p. ex., analyse de l’activité, Bradford ou quantification de BCA protéines, SDS page) pour confirmer le changement en l’objectif d’intérêt en comparant les résultats de la moyenne de référence et la moyenne optimisée15.

Representative Results

Le protocole introduit a été appliqué pour maximiser le titre de GFP sécrétée. Plus précisément, le titre GFP après que 17 h de culture a été choisi comme l’objectif d’optimisation. Détection de fluorescence en ligne de GFP permis quantification produit simple. Toutefois, la normalisation du signal GFP avec les données d’une culture de référence est indispensable pour garantir la reproductibilité et la comparabilité des résultats. Une présélection des composants media a été réalisée sur une base rationnelle, comme décrit dans la Section 1. Expériences ont été effectuées en suivant les instructions de la Section 1 : les paramètres des procédures de laboratoire ont été définis pour l’étude de toute cohérence et reproductibilité des résultats. Comme décrit dans la Section 2, l’analyse initiale a été réalisée pour identifier les composants pertinents montrant un impact significatif sur l’objectif d’optimisation pour l’étude de l’autre, plus détaillée. Le système MBR axée sur le PSG permet 48 expériences pour être exécutée en parallèle. Compte tenu du nombre maximal possible des expériences parallèles sur un plan à moyen terme (48) et le nombre total de marques (11) les 2IVde composantes médias11-6 fractionnaire concevoir un choix approprié. Ce dispositif expérimental est composé de 32 expériences et permet l’estimation de l’effet principal de chacune des composantes médias étudiés. Les autres puits de culture (16) ont été utilisés pour multiples répétitions d’expériences avec le milieu de référence pour évaluer la reproductibilité et des effets de position. Autrement dit, chaque expérience est réalisée une fois (aucune réplique), à l’exception de l’expérience de référence (cinq répétitions). Le tableau 1 résume les résultats de l’analyse de dépistage. Dans la gamme de concentration réfléchie, variant la majorité des composantes médias ne montre pas un effet sensible sur l’objectif. Composant NH4+ montre un fort effet négatif, alors que Ca2 + et Mg2 + affichent la plus forte tendance positive. L’effet de Mg2 + n’est pas significatif pour la gamme de concentration actuelle mais peut-être pour une plus large gamme de concentration. En conséquence, il a été décidé d’omettre NH4+ du milieu et pour étudier l’effet de Ca2 + et Mg2 + dans d’autres expériences. La section 3 décrit la procédure d’optimisation itérative qui est utilisée pour optimiser le signal de fluorescence GFP tout en variant la concentration de Ca2 + et Mg2 +. Dans l’itération 1, on a vérifié l’hypothèse que NH4+ peut être omis. La plage de concentrations de Ca2 + et Mg2 + a été adoptée dans l’analyse de dépistage. Les concentrations minimales de NH4+ a été mises à zéro et la concentration maximale a été adoptée dans l’expérience de dépistage. Dans les expériences suivantes, les concentrations de composants ont été réparties en 3 x 3 x 3 grille à l’intérieur de la gamme de concentration définie, ayant pour résultat 27 expériences. Au cours de toutes les cultures, cinq séries de milieu de référence ont été inclus, qui a servi comme étalon interne tout en assurant qu’aucun effets de position sur le PSG s’est produite. Pour les 16 autres cupules, les concentrations de NH4+, Ca2 +et Mg2 + ont été distribuées au hasard à l’intérieur de la donnée varie. Figure 5 A visualise les résultats des premières itérations. Étiquettes de l’axe se référer pour les concentrations de composants utilisées dans le milieu de référence initial, indiqué par x Ref. Les surfaces bleues représentent les interpolations de krigeage qui ont été calculées en utilisant le logiciel KriKit. Chaque surface est associé à un niveau de concentration relative pour NH4+ (bleu foncé : 0 x Ref, damier : 1 x Ref, bleu clair : 2 x Ref). Cette représentation visuelle révèle qu’il est favorable d’omettre NH4+. Surfaces d’interpolation montrent également les effets positifs de Mg2 + et Ca2 +, comme tous les avions montée avec des concentrations croissantes. Selon les résultats de l’itération 1, il a été décidé d’étendre la concentration gamme de Ca2 + et Mg2 + en doublant les concentrations maximales et de déplacer la fenêtre de conception expérimentale à l’angle supérieur droit, voir la Figure 5 B. à l’intérieur de cette gamme, les concentrations ont été distribuées sur une grille 6 x 6. Ceci assure une distribution égale dans la gamme pleine concentration, conduisant à des résultats optimaux d’interpolation par krigeage. Figure 5 B montre l’intrigue d’interpolation par krigeage basé sur la combinaison des données mesurées dans les deux itérations (points rouges et jaunes places). Pour les deux, Ca2 + et Mg2 +, l’effet positif de l’augmentation de leurs concentrations se poursuit. En conséquence, la procédure a été répétée en doublant la concentration maximale et ainsi, la fenêtre de conception expérimentale a été déplacée à explorer les frontières de l’angle supérieur droit. Figure 6 A donne un aperçu de la procédure d’optimisation restants. L’analyse de l’ensemble des données collectée jusqu’à itération 3 a révélé qu’une limitation de l’effet positif de Mg2 +, c’est-à-dire, une concentration optimale en gamme de Mg2 + a été identifiée. Il a donc été décidé d’étendre la gamme de concentration que pour Ca2 + (itération 4). Cette procédure a été répétée deux fois (itération 5 et 6) jusqu’à ce qu’une saturation du signal GFP a été trouvée. Cette saturation est expliquée par la précipitation des sels de Ca pour les concentrations appliquées de Ca2 +, qui ne sont pas disponibles pour les cellules. Comme toujours, les résultats expérimentaux sont perturbées par le bruit, l’interpolation par krigeage résultante apparaît irrégulier et inspection visuelle peut conduire à des conclusions fausses. Cependant, la gamme de concentration optimale des composants media pour le signal saturé de GFP peut être identifiée de manière fiable avec la statistique z -test, qui est également implémenté dans KriKit. Le test zutilise directement les informations statistiques intrinsèques fournies par krigeage méthode, c’est-à-dire, des valeurs de prédiction et incertitudes de la prévision. Figure 6 B montre le plateau identifié, comme déterminé et visualisées à l’aide de la boîte à outils KriKit.La boîte à outils KriKit est librement disponible36 et vient avec un didacticiel détaillé qui explique comment utiliser ses fonctionnalités. Si plus de deux composants pertinents sont trouvent, visualisation 3D atteint sa limite. KriKit fournit plusieurs autres méthodes de représentation visuelle possible comme des films ou « parcelle de dépistage ». Si le potentiel optimal se situe dans la fourchette de concentration définie, les nouvelles expériences visent automatiquement à l’aide de l’amélioration attendue40,46. Le protocole expérimental basé sur l’amélioration attendue est intégré dans la boîte à outils KriKit. On trouvera des informations plus détaillées dans la documentation du logiciel. Après la procédure itérative, une vérification des résultats a été réalisée, comme décrit dans la partie D. La validité des hypothèses initiales a été vérifiée en effectuant une analyse de sensibilité supplémentaire à l’aide de la composition du milieu optimale. Autrement dit, tous les composants de support initial d’intérêt étaient variées, mais Ca2 + et Mg2 + ont été mis à leur niveau de concentration optimale. Dans cette étude, les concentrations optimales = 32 x Ref et = 6,8 x Ref ont été choisis. Le tableau 2 montre les résultats de l’examen de validation. Semblable à la sensibilité initiale préalable (cf. tableau 1), NH4+ a toujours une influence négative significative et effets restants sont encore négligeables. En raison d’un accès facile, le signal de fluorescence GFP de la suspension de la culture a été utilisé pour quantifier le titre GFP extracellulaire au cours de toutes les expériences. À des fins de vérification, fluorescence GFP a été validé par rapport autres mesures. Parce que GFP est sécrétée par la voie de la Tat, le signal de fluorescence ne peuvent pas distinguer entre intra – et extracellulaire GFP. Ainsi, les cultures ont été reproduites en utilisant le milieu de référence et le milieu optimisé. Outre la mesure de la fluorescence de surnageants de culture acellulaire, teneur en protéines a été quantifiée par l’analyse de Bradford et la (semi)-amélioration qualitative de GFP visualisée par SDS-Page15. Toutes les mesures qui en résultent des signaux ont pratiquement doublé pour cultures avec milieu optimisé par rapport à la moyenne de référence et validé les environ 100 % amélioration de la performance de la sécrétion du milieu optimisé. Par conséquent, fluorescence spécifique GFP de suspension de la culture peut être considéré comme une mesure appropriée pour l’objectif de l’optimisation, c’est-à-direle titre GFP extracellulaire. Figure 2 : Capture d’écran de la liste de pipetage de volume pour une analyse de sensibilité. Entrées dans la première colonne assigner un identificateur unique à tous les volumes d’une ligne ; Cet identificateur est le PSG bien numéro de la culture cible du PSG sur la table de travail gestionnaire liquide, cf. Figure 4C. Colonnes restantes encodent les volumes des solutions différentes (« Sln-01 » à « Sln-15 ») pour être distribués. Le volume cumulatif d’une ligne correspond au volume de culture final du bien correspondant. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Capture d’écran du liquide manutention contrôle logiciel « WinPREP ». Gauche : Ordonnées par ligne, y compris les commandes une commande de transfert pour chaque solution stock à distribuer. Avant la commande définitive pour l’addition de l’inoculum, une invite d’utilisateur est insérée pour s’assurer que la culture de semences est placée à la table juste à temps. A droite : Schéma de la table de travail, y compris du platine de la source de Variation de Stocks (deux plaques de puits profonds avec 12 puits de colonne-like), la fosse de réactif pour reste Stock, l’eau et inoculum et la culture de cible préparation médias PSG. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Compilation des captures d’écran détaillé pour l’installation de pipetage d’une solution mère. (A) déballé la commande pour le pipetage de stock de Fe. Labware source et source bien dans les limites sont marquées sur la table de travail par la trame de lecture et de la colonne rouge de la plaque correspondante de puits profonds. Destination de laboratoire et des puits de destination au sein sont marquées par le cadre bleu autour et le puits bleus de la culture cible du PSG. (B) vue d’exemple détaillé sur la cession de pipetage volumes pour cette étape (solution mère Fe). Nombre de destinations est lue à partir de la liste de pipetage, qui a 48 rangs. Les volumes de distribution pour tous les puits de destination pour Fe solution-mère se trouve dans la colonne 4 dans la liste de pipetage. Notez que la première colonne dans la liste de pipetage contienne des identificateurs et pas les volumes à transférer, voir la Figure 2. (C) les détails sur destination bien numérotation. Volumes écrits dans la ligne #1 de la liste correspondante de pipetage vont être distribués dans bien marqué comme #1 et ainsi de suite. Puits #01, 08 #, #41 et 48 # correspondent aux puits A01, A08, F01 et F08 pour le codage alphanumérique, qui est également imprimé dans la culture PSG lui-même. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Résultats de la première itération détaillés. (A) l’interpolation par krigeage basé sur des données expérimentales de l’itération 1. Les points rouges indiquent l’ensemble des données. Pour comparaison, toutes les surfaces d’interpolation trois sont superposées dans un complot (bleu foncé : 0 x Ref, damier : 1 x Ref, bleu clair : 2 x Ref). Une autre représentation des résultats peut être trouvée ailleurs15. (B) interpolation par krigeage basée sur les expériences effectuées dans l’itération 1 (points rouges) et itération 2 (carrés jaunes).Parties des données présentées dans cette figure ont été publiées antérieurement15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Représentation des résultats de l’optimisation itérative collectées. Krigeage Final (A) modèle de prédiction. (B) l’identification statistique de zone optimale (rouge) basée sur la statistique z-test, qui est fourni par KriKit. Les cases indiquent les étapes successives de la conception itérative et l’exécution d’expériences. Parties des données présentées dans cette figure ont été publiées antérieurement15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Composant Valeur moyenne du Coefficient normalisé Fe2 + -0,08 Mn2 + -0,05 Zn2 + -0,21 Cu2 + -0,21 NH4+ -2.04 Ni2 + -0,11 Co2 + -0,10 MoO42- 0,03 BO33- 0,06 Ca2 + 1,00 Mg2 + 0,45 Tableau 1 : résultats de l’analyse de sensibilité. Valeurs du coefficient représentant l’effet moyen lors de l’augmentation de la concentration de composant de médias respectifs de sa valeur de centre à sa valeur maximale. Pour les conceptions expérimentales optimales, comme trouvé dans la littérature standard et utilisé ici, l’écart-type représente directement la variation expérimentale en raison de la réplication de l’expérience de référence. Valeurs des coefficients ont été normalisées par la valeur maximale (0.0422 pour composant Ca2 +). Écart-type coefficient normalisé et absolue est de 0,54 et 0,0226, respectivement. Composant Valeur moyenne du Coefficient normalisé Fe2 + -1,00 Mn2 + 1,00 Zn2 + -3.48 Cu2 + -0,52 NH4+ -15.95 Ni2 + 0,69 Co2 + -0,51 MoO42- -0,45 BO33- -1.11 Tableau 2 : résultats de l’analyse de sensibilité final. Valeurs du coefficient représentant l’effet moyen lors de l’augmentation de la concentration de composant de médias respectifs de sa valeur de centre à sa valeur maximale. Comme une conception expérimentale optimale a été utilisée, l’écart-type dépend uniquement de la variation expérimentale à l’aide de la composition du milieu optimisée. Variation expérimentale a légèrement augmenté par rapport à la variation en utilisant le milieu de référence. Valeurs des coefficients ont été normalisées par la valeur maximale (0,0106 pour composant Mn2 +). Écart-type coefficient normalisé et absolue est de 3,63 et 0.0385, respectivement.

Discussion

Le caractère générique du protocole présenté permet diverses adaptations, par exemple, pour étudier d’autres expression microbienne hôtes⁹^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^, ⁵¹, ou pour optimiser les autres propriétés de la protéine cible, comme les obligations de motif ou de bisulfure de glycosylation. Le protocole devrez peut-être aussi être adapté à l’équipement de laboratoire disponibles. L’intégration d’un système MBR permet d’augmenter le débit expérimental, qui permet d’importantes économies dans le temps. Cependant, lors du remplacement des bioréacteurs entièrement instrumentés et contrôlables par les systèmes MBR, évolutivité des résultats doit considérer⁸^,³⁷^,⁵²^,⁵³. L’utilisation de méthodologies DOE et la modélisation mathématique permet de maximiser l’information contenue dans les données de mesure en ce qui concerne l’ objectif étudiés⁵⁴ par efficace de planification expérimentale et interprétation de données basées sur le modèle¹⁵.

Modifications à la méthode
À côté de polyvalent et extensible robotic manipulation de liquides systèmes comme celui utilisé dans cette étude, il convient de mentionner qu’il y a plusieurs liquides plus petits systèmes disponibles dans le commerce qui sont capables d’accomplir cette tâche et peuvent être placés à l’intérieur des bancs de travail à flux laminaire. Si aucun système de pipetage automatisée n’est disponible, des compositions de différents supports selon le régime DOE également peuvent être réalisées que par pipetage manuel à l’aide de pipettes unique ou multi canaux. Puisque la préparation manuelle est plus sujette aux erreurs et exigera des travaux très ciblé pour un temps assez long, il est conseillé de préparer un nombre inférieur de compositions de différents médias.

Selon les capacités du système MBR indépendant, le protocole de culture correspondant peut varier. Par exemple, si aucune mesure en ligne de formation de la biomasse est disponible, il peut être suffisant mesurer la concentration de la biomasse issue de l’expérience de la croissance. En combinaison avec un suivi en ligne du pH et l’oxygène dissous, qui est implémenté dans plusieurs systèmes de MBR, la saturation de la croissance peut être déterminée en toute sécurité. En principe, les expériences de croissance peuvent être effectuées en MTP seul placé à l’intérieur de secouer les incubateurs, sans l’utilisation d’un système MBR. Dans ce cas, les conditions de culture bon doivent être assurés : (1) cultures limitées en oxygène peuvent être évité en utilisant MTP avec des géométries adaptés, en combinaison avec bon secouant les fréquences et secouant les diamètres, par exemple, carré 96 ou 24 ” profondeur plaques bien exploité à 1 000 tr/min à 3 mm jet ou à 250 tr/min à 25 mm jet, respectivement. Ce qui est important, plus les taux de transfert d’oxygène maximale réalisable, plus la source principale de carbone devrait être concentrée. Comme mentionné ci-dessus, pour cette étude, l’utilisation de 10 g/L de glucose a été adaptée afin d’éviter la prescription d’oxygène pour les conditions de culture indépendants ; (2) l’échantillonnage des cultures du PSG pour la quantification de la biomasse et les produits doit être réduit au minimum. Chaque fois que le PSG est retiré de l’incubateur agitateur, transfert d’oxygène sera immédiatement panne qui peut aboutir à des conditions de culture défavorables ; (3) de l’avis des auteurs, l’utilisation de lecteurs du PSG comme dispositifs de culture n’est pas recommandée car ces appareils n’a été élaborés à cet effet. Par exemple, agitation mécanique ont été construite pour le mélange occasionnelle de microplaques après l’addition de réactif et ainsi, manque souvent de robustesse pour de longues distances de continu durée secouer pendant jours. En outre, suffisamment puissance d’entrée nécessaire pour les cultures microbiennes ne peut être réalisée dans ces lecteurs. L’intégration de lectures de densité optique en bref des intervalles de temps nécessite l’arrêt de la motion secousse, résultant en des périodes répétées de limitation de l’oxygène. En outre, évaporation dans de tels systèmes sur une période longue culture faussera les résultats. Pour plus de détails sur le sujet étonnamment complexe sur l’utilisation de MTP pour cultures microbiennes, on se reportera à la littérature citée²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶et références.

D’autres considérations
Aux étapes d’optimisation itérative de Speed-up, il est conseillé de sélectionner avec soin la méthode d’analyse pour le dosage du produit. Rapides et simple des méthodes doivent être privilégiées au détriment de la précision et l’exactitude, comme la stratégie de conception expérimentale itératif tolère des imprécisions expérimentales. Toutefois, les résultats définitifs doivent être confrontées avec des méthodes de quantification suffisamment précise et exacte de produit qui pourraient être plus compliqués. En général, une évaluation soigneuse et prise de décisions sur les procédures d’étude nécessitent un effort au début de l’étude, mais payent à long terme, après que des méthodes de routine ont été établis.

Il est fortement recommandé de définir une expérience de référence qui est comparée à toutes les expériences pendant l’optimisation. Autrement dit, la composante moyenne appliquée concentrations ainsi que sortie mesuré est normalisée par divisant par des valeurs de référence. De cette façon, chacune appliquée et la valeur mesurée peut être interprété comme le x-giron de la valeur de référence. Afin de tenir compte des variations entre les plaques, cinq expériences de référence sont effectués sur chaque plaque. La valeur moyenne des résultats mesurés est utilisée pour la normalisation.

Il généralement ne peut être garantie que le milieu développé est également optimal pour les autres souches. Cependant, le support amélioré aussi sera probablement approprié pour la culture des souches d’expression avec de petites différences génétiques, par exemple, lors de produire des variantes de l’enzyme avec des substitutions d’acides aminés unique obtenue (études de mutagenèse même de simples mutations ponctuelles ont été décrits au métabolisme cellulaire effet et expression hétérologue performance⁵⁵^,,⁵⁶). Dans ce cas, le protocole présenté peut être une première étape, suivie des protocoles haut débit expression projections⁵⁷. Si le protocole est utilisé pour le développement moyen avec intensification ultérieure aux cultures fed-batch, le milieu optimisé doit être vérifié pour les conditions correspondantes de bioprocédés, comme clone dépistage des campagnes à la micro-échelle identifié différent haut artistes interprètes ou exécutants pour différentes stratégies d’alimentation et de la culture médiatique⁵²^,⁵⁸. En outre, l’introduites KriKit³⁶ peut généralement contribuer à optimisation améliorée bioprocédés holistique.Récemment encore, les capacités de l’outil ont été étendues pour prendre également en charge optimisation multi-objectif⁴⁰, qui peut être important pour optimiser les processus en amont et en aval⁵⁹^,⁶⁰.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les activités scientifiques du Bioeconomy Science Center étaient soutenues financièrement par le ministère de l’Innovation, la Science et la recherche dans le cadre de la BioSC NRW-Strategieprojekt (no. 13 313/323-400-002). Les auteurs tiennent à remercier le ministère de l’Innovation, la Science et recherche de Rhénanie du Nord-Westphalie et l’Heinrich Heine Université Düsseldorf une bourse d’études pour Lars Freier au sein de la biotechnologie industrielle du Cluster CLIB-diplômé. Un financement supplémentaire a été reçu de l’activation du programme espaces « Helmholtz Innovation Labs » de l’Association allemande Helmholtz pour soutenir le « Microbial Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab ».

Materials

BioLector	m2p-labs	G-BL-100
Flowerplate	m2p-labs	MTP-48-BOH	For cultivation in the BioLector device
Sealing foil	m2p-labs	F-GP-10	Sterile sealing for Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	n/a	Freely available, MATLAB installation required
Janus pipetting robot	Perkin Elmer	n/a	Includes "WinPrep" software installation
12-column deep well microplate	E&K Scientific	EK-2034	Container for medium stock solutions
96 well microplates, transparent, F-bottom	Greiner	655101	For Bradford protein assay
µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom	Greiner	655087	For flourescence measurement in cell-free supernatants
Pipette Research plus multi-channel pipettes	Eppendorf	n/a	Facilitates manual liquid handling with microplates
TruPAG Precast Gels	Sigma	PCG2002	For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
Bradford Reagent	Sigma	B6916
C. glutamicum pCGPhoD^Bs-GFP	n/a	n/a	Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

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Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

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