ДНК-полимераза деятельности пробирного с использованием флуоресцентных помечены ДНК ближней ИК-области визуализирована электрофорезом геля акриламида
Summary
Этот протокол описывает характеристики синтеза ДНК-полимеразы измененных ДНК путем наблюдения изменений в ближней ИК-области дневно обозначенные ДНК с помощью электрофореза геля и гель изображений. Акриламид Гели используются для отображения с высоким разрешением разделения коротких нуклеиновых кислот, которые мигрируют по различным ставкам в зависимости от размера.
Abstract
Для любого ферментов надежные, количественные методы необходимы для характеризации как родного, так и инженерии ферментов. Для ДНК-полимеразы синтез ДНК можно охарактеризовать с помощью в vitro ДНК синтеза assay следуют электрофореза геля полиакриламида. Цель этого анализа заключается в количественном определении синтеза ДНК природных и модифицированных ДНК (M-ДНК). Эти подходы являются особенно полезными для урегулирования олигонуклеотиды с резолюцией единичных нуклеотидных, позволяя наблюдения отдельных шагов во время синтеза олигонуклеотида ферментативные. Эти методы были применены к оценке массива биофизических и биохимических свойств, таких как измерение константы скорости установившегося отдельных этапов синтеза ДНК, ошибка скорость синтеза ДНК и ДНК сродство. С помощью изменения компонентов, включая, но не ограничиваясь, модифицированных нуклеозидов трифосфаты (NTP), M-ДНК, и/или мутант полимераз, относительной полезности субстрата ДНК-полимеразы, которую можно эффективно оценивать пар. Здесь мы подробно assay, включая изменения, которые должны быть сделаны для размещения нетрадиционных грунтовка ДНК маркировки таких стратегий, как инфракрасный дневно помечены ДНК. Кроме того мы подробно важнейшие технические шаги для заливки гель акриламида и запуск, который часто может быть технически сложным.
Introduction
Полимераз выполняют точные и эффективные синтез ДНК и необходимы для поддержания целостности генома. Способность синтезировать сотни нуклеотидов в секунду без внесения ошибок также делает ДНК полимеразы необходимыми инструментами в молекулярной биологии и биотехнологии. Однако эти свойства также ограничить приложения для M-ДНК субстратов; вообще говоря, природные полимераз не может синтезировать многие потенциально ценные М-ДНК субстратов, вероятно из-за высокой селективного давления против использования нестандартных субстратов в естественных условиях. Многие группы разработали направленной эволюции подходов для создания мутантных полимераз способны M-ДНК синтез1,2,3,,45; Эти усилия расширили биотехнологических утилита ДНК6,,78.
Для оценки способности мутантных полимераз синтезировать M-ДНК, мы9,10и другие11,12,13 обычно используют в vitro измерения ДНК активность полимеразы, которые описаны в этой рукописи. В этих экспериментах полимераз совместно инкубируют с меткой дуплексный шаблон грунт и нуклеозидов трифосфата субстратов; Продукция оцениваются электрофорезом геля. В зависимости от конкретных экспериментальных вопрос, мутант полимераз, изменение грунтовки может использоваться измененные шаблоны или модифицированных нуклеозидов трифосфаты, позволяя систематической оценки биохимических мутант ферментативной активности.
Исторически эти assays полагаются на 5′ радиоактивных метку для отслеживания синтеза ДНК; чаще всего использовались 32P и 33P; как правило маркировка достигается с помощью T4 полинуклеотид киназу11. Однако из-за ограниченное время жизни и относительно высокая стоимость и их безопасного захоронения радиоактивных этикетки, наша группа вместо этого использует инфракрасный Флюорофор синтетические 5′ помечены ДНК. С помощью относительно недорогих ближней ИК-области гель тепловизор, мы наблюдали аналогичные пределы обнаружения в предыдущих исследованиях с использованием радиоактивных этикетки (неопубликованные результаты). Мы успешно воспроизводить прошлые замечания9, и мы не наблюдали большие количественную разницу с ранее измеренного коэффициента константы (неопубликованные результаты).
Чтобы проанализировать размер ДНК и таким образом, степень синтеза ДНК, мы полагаемся на методы электрофореза геля полиакриламида, первоначально разработанных для Сэнгер последовательности14 до появления капиллярного электрофореза15. Расстояние от разделения и мобильность может использоваться как измерения молекулярной массы; большой формат, вертикальные полиакриламидные гели можно добиться единичных нуклеотидных резолюции, включение количественных наблюдения ДНК-олигонуклеотиды различной длины.
В совокупности эти эксперименты являются надежный метод для характеризации полимеразы. Из-за время деликатный характер реакции, подготовка и уход необходимо добиться воспроизводимость результатов. Кроме того в то время как гель акриламида является весьма эффективным способом измерения синтез ДНК, а также многочисленные другие ДНК изменения реакции, с резолюцией единичных нуклеотидных, это может быть технически сложным. Здесь протокол позволит пользователям выполнять эти эксперименты избегая наиболее распространенных ошибок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали assay характеризовать синтеза ДНК полимеразы опосредованной M-ДНК. С помощью ближней ИК меткой ДНК грунты, а использование денатурируя электрофореза геля полиакриламида решить по-разному размера олигонуклеотиды, мы можем получить единичных нуклеотидных резолюции на ол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержку корпорацией исследований для научного прогресса (Коттрелл колледж Scholar премии #22548) и TriLink биотехнологий (ResearchReward Грант #G139).
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
