Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido
Summary
Este protocolo descreve a caracterização da síntese de DNA polimerase do ADN modificado através da observação de alterações para o infravermelho próximo fluorescente etiquetada DNA usando electroforese em gel e gel de imagem. Géis de acrilamida são utilizados para geração de imagens de alta resolução da separação de curtos ácidos nucleicos, que migram em taxas diferentes dependendo do tamanho.
Abstract
Para qualquer enzima, métodos quantitativos, robustos são necessários para a caracterização das enzimas nativas e engenharia. Para as polimerases de DNA, síntese de DNA pode ser caracterizado usando um em vitro DNA síntese ensaio seguido por eletroforese em gel de poliacrilamida. O objetivo deste ensaio é quantificar a síntese de DNA natural e DNA modificado (M-DNA). Essas abordagens são particularmente úteis para a resolução de oligonucleotídeos com resolução de nucleotídeo único, permitindo a observação dos passos individuais durante a síntese do oligonucleotide enzimática. Esses métodos foram aplicados à avaliação de uma matriz de propriedades bioquímicas e biofísicas tais como a medição das constantes de velocidade de estado estacionário de etapas individuais da síntese de DNA, a taxa de erro de síntese de DNA e afinidade de ligação do DNA. Usando modificado componentes incluindo, mas não limitado a, trifosfatos de nucleósidos modificados (NTP), M-DNA, e/ou mutante DNA polimerase, a utilidade relativa de substrato-DNA polimerase pares podem ser efetivamente avaliados. Aqui, detalhamos o ensaio em si, incluindo as alterações que devem ser feitas para acomodar a primeira demão não tradicionais DNA rotulagem estratégias tais como infravermelha fluorescente etiquetado DNA. Além disso, temos detalhados etapas técnicas cruciais para gel do acrilamido derramando e execução, que pode muitas vezes ser tecnicamente desafiador.
Introduction
As polimerases de DNA realizar preciso e eficiente síntese de DNA e são essenciais para a manutenção da integridade do genoma. A capacidade de sintetizar centenas de nucleotídeos por segundo sem cometer erros também faz ferramentas essenciais de polimerases de DNA na biologia molecular e biotecnologia. No entanto, essas propriedades também limitam as aplicações para substratos de M-DNA; de um modo geral, as polimerases de DNA naturais não podem sintetizar muitos substratos potencialmente valiosos de M-DNA, provavelmente devido à alta pressão seletiva contra o uso de substratos padronizado na vivo. Muitos grupos desenvolveram abordagens evolução dirigida para gerar as polimerases de DNA mutantes capazes de M-DNA síntese1um,2,3,4,5; Estes esforços têm se expandido o utilitário biotecnológico de DNA6,7,8.
Para avaliar a capacidade de polimerases de DNA mutantes de sintetizar DNA-M, nós9,10e outros11,12,13 normalmente usar medições em vitro de DNA atividade de polimerase, que são descritos neste manuscrito. Nesses experimentos, polimerases de DNA são co incubadas com um primer/modelo rotulado frente e verso e substratos de trifosfato de nucleósido; os produtos são avaliados por eletroforese em gel. Dependendo da pergunta específica experimental, polimerases de DNA mutantes, primers modificados, modelos modificados, ou trifosfatos de nucleósidos modificados podem ser usados, permitindo a avaliação sistemática e bioquímica da atividade da enzima mutante.
Historicamente, estes ensaios têm contado com um marcador radioativo 5′ para controlar a síntese de DNA; mais comumente, 32P e 33P têm sido utilizados; Normalmente, rotulagem é conseguido usando T4 polinucleotídicas quinase11. No entanto, devido ao tempo de vida finito e custo relativamente alto de rótulos radioativos e sua eliminação segura, nosso grupo, em vez disso usa um sintético 5′ infravermelha fluoróforo rotulado de DNA. Usando um gerador de imagens de custo relativamente baixo de gel de infravermelho próximo, temos observado semelhante limites de detecção para estudos prévios, usando rótulos radioativos (resultados não publicados). Podemos ter reproduzido com sucesso observações9, e não observamos nenhuma grande diferença quantitativa com constantes de velocidade medidos anteriormente (resultados não publicados).
Para analisar o tamanho do DNA e, portanto, a extensão da síntese de DNA, contamos com métodos de eletroforese de gel de poliacrilamida originalmente desenvolvidos por Sanger sequenciamento14 antes do advento da eletroforese capilar15. A distância de separação ou mobilidade pode ser usada como uma medida de peso molecular; grande formato, géis de poliacrilamida verticais poderão obter uma resolução de nucleotídeo único, permitindo a observação quantitativa de oligonucleotídeos de DNA de diferentes comprimentos.
Coletivamente, estas experiências são um método robusto para caracterização de polimerase. Devido ao tempo de natureza sensível das reações, preparação e cuidado é necessária para atingir resultados reprodutíveis. Além disso, enquanto o gel do acrilamido é uma forma extremamente eficaz de medir a síntese do ADN, bem como numerosos outras DNA modificando as reações, com resolução de nucleotídeo único, pode ser tecnicamente desafiador. O protocolo aqui Espero que permitirá aos usuários realizar estas experiências, evitando os erros mais comuns.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um ensaio para caracterizar a síntese de DNA polimerase-mediada de M-DNA. Usando primers de DNA etiquetadas infravermelha, e usando a eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturação para resolver oligonucleotides diferente tamanhos, podemos obter resolução de nucleotídeo único no oligonucleotides, permitindo uma medição precisa da síntese. Estas abordagens podem ser usadas para medir também a actividade global da enzima (seção 2.1) ou para medir os parâmetros de Michaelis-Menten de etap…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela corporação de pesquisa para o avanço científico (Cottrell faculdade Scholar Award #22548) e por TriLink biotecnologias (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
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