Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide
Summary
Questo protocollo descrive la caratterizzazione della sintesi di DNA polimerasi di DNA modificato attraverso l’osservazione dei cambiamenti al DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso mediante elettroforesi su gel e gel di imaging. Gel di acrilammide sono usati per l’imaging ad alta risoluzione della separazione degli acidi nucleici breve, che migrano a velocità diverse a seconda delle dimensioni.
Abstract
Per qualsiasi enzima, robusti, quantitativi metodi sono necessari per la caratterizzazione degli enzimi sia nativi che derivati dal. Per le polimerasi del DNA, sintesi del DNA possono essere caratterizzato usando un in vitro del DNA sintesi analisi seguito da elettroforesi in gel di poliacrilammide. L’obiettivo di questo test è quello di quantificare la sintesi di DNA naturale e di DNA modificato (M-DNA). Questi approcci sono particolarmente utili per la risoluzione dei oligonucleotides con risoluzione di singolo nucleotide, consentendo l’osservazione delle singole fasi durante la sintesi del oligonucleotide enzimatica. Questi metodi sono stati applicati per la valutazione di una matrice di proprietà biochimiche e biofisiche quali la misurazione delle costanti di tasso costante di singoli passaggi della sintesi del DNA, il tasso di errore della sintesi del DNA e affinità di legame del DNA. Utilizzando componenti tra cui, ma non limitatamente a, i trifosfati del nucleoside modificato (NTP), M-DNA, e/o mutante polimerasi del DNA, il relativo programma di utilità di substrato-DNA polimerasi coppie possono essere efficacemente valutate modificati. Qui, abbiamo dettaglio il dosaggio stesso, comprese le modifiche che devono essere fatte per ospitare contrassegno strategie quali DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso del DNA primer non tradizionali. Inoltre, abbiamo dettagliate passi fondamentali tecnici per colata di gel di acrilammide e in esecuzione, che spesso può essere tecnicamente impegnativo.
Introduction
DNA polimerasi eseguire accurata ed efficiente sintesi di DNA e sono essenziali per mantenere l’integrità genomica. La capacità di sintetizzare centinaia di nucleotidi al secondo senza fare errori fa anche strumenti essenziali di DNA polimerasi in biologia molecolare e biotecnologie. Tuttavia, queste proprietà anche limitano le applicazioni per substrati M-DNA; in linea generale, naturale polimerasi del DNA non possono sintetizzare molti potenzialmente preziosi substrati di M-DNA, probabilmente dovuta alla alta pressione selettiva contro l’uso di substrati non standard in vivo. Molti gruppi hanno sviluppato approcci evoluzione diretto per generare la polimerasi del DNA mutante capace di M-DNA sintesi1a,2,3,4,5; questi sforzi hanno ampliato l’utilità biotecnologica del DNA6,7,8.
Per valutare la capacità della polimerasi del DNA mutante di sintetizzare M-DNA, abbiamo9,10e gli altri11,12,13 in genere utilizzano misurazioni in vitro del DNA attività della polimerasi, che sono descritte in questo manoscritto. In questi esperimenti, la polimerasi del DNA sono co-incubate con un primer con etichettato/modello duplex e nucleosidi trifosfato substrati; i prodotti sono valutati mediante elettroforesi in gel. A seconda della specifica domanda sperimentale, polimerasi del DNA mutante, modificate gli iniettori, modelli modificati, o trifosfati del nucleoside modificato possono essere utilizzato, consentendo la valutazione biochimica sistematica dell’attività dell’enzima mutante.
Storicamente, questi saggi hanno fatto affidamento su un’etichetta radioattiva 5′ per tenere traccia di sintesi del DNA; più comunemente, sono stati utilizzati 32P e 33P; tipicamente, etichettatura è realizzato utilizzando T4 polinucleotide chinasi11. Tuttavia, a causa della durata limitata nel tempo e il costo relativamente elevato di etichette radioattive e del loro smaltimento sicuro, il nostro gruppo utilizza invece un fluoroforo vicino infrarosso sintetico 5′ DNA contrassegnato. Utilizzando un costo relativamente basso vicino infrarosso gel imager, abbiamo osservato i limiti di rilevazione simile ai precedenti studi utilizzando etichette radioattive (dati non pubblicati). Abbiamo riprodotto con successo passato osservazioni9, e non abbiamo osservato alcuna grande differenza quantitativa con costanti di tasso precedentemente misurato (dati non pubblicati).
Per analizzare la dimensione del DNA e quindi, nella misura della sintesi del DNA, ci basiamo su metodi di elettroforesi del gel di poliacrilammide sviluppati originariamente per di sequenziamento Sanger14 prima dell’avvento di elettroforesi capillare15. La distanza di separazione o di mobilità può essere utilizzata come una misura di peso molecolare; grande formato, i gel di poliacrilammide verticali può raggiungere la risoluzione di singolo nucleotide, consentendo l’osservazione quantitativa di oligonucleotidi di DNA di lunghezza variabile.
Collettivamente, questi esperimenti sono un metodo affidabile per la caratterizzazione della polimerasi. A causa del tempo natura sensibile delle reazioni, la preparazione e la cura è necessaria per ottenere risultati riproducibili. Ulteriormente, mentre il gel dell’acrilamide è un modo molto efficace per misurare la sintesi del DNA, così come numerose altre reazioni modificazione di DNA, con risoluzione di singolo nucleotide, può essere tecnicamente difficile. Il protocollo qui speriamo che consentirà agli utenti di eseguire questi esperimenti, evitando gli errori più comuni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto un test per caratterizzare la sintesi di DNA polimerasi-mediata di M-DNA. Utilizzando primer di DNA con etichetta vicino infrarosso, e utilizzando l’elettroforesi del gel di poliacrilammide denaturante per risolvere diverse dimensioni oligonucleotidi, possiamo ottenere risoluzione di singolo nucleotide su oligonucleotidi, consentendo la misurazione precisa di sintesi. Questi approcci possono essere usati per misurare l’attività complessiva dell’enzima (sezione 2.1) o per misurare i parametri di Mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da Research Corporation per l’avanzamento scientifico (Cottrell College Scholar Award n. 22548) e da TriLink Biotechnologies (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
