DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל
Summary
פרוטוקול זה מתאר את האפיון של ה-DNA פולימראז סינתזה של דנ א שונה דרך התבוננות שינויים-סגול fluorescently שכותרתו הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג’ל ג’ל הדמיה. ג’לים אקרילאמיד משמשים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של ההפרדה של חומצות גרעין קצר, אשר נודדים בקצב שונה בהתאם לגודל.
Abstract
עבור כל אנזים, שיטות חזקות, כמותיים נדרשים עבור אפיון של אנזימים הן מקומיים והן מהונדסים. עבור ה-DNA polymerases, לסינתזת DNA ניתן לאפיין באמצעות של במבחנה DNA סינתזה assay ואחריו לזיהוי בג’ל. המטרה של זה וזמינותו היא לכמת סינתזה של דנ א טבעי והן שהשתנו דנ א (M-DNA). גישות אלה שימושיים במיוחד ליישוב oligonucleotides עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המאפשרים תצפית של צעדים בודדים במהלך סינתזה oligonucleotide אנזימטיות. שיטות אלה הוחלו על ההערכה של מערך של ומאפייני הביוכימי biophysical כגון מדידת מצב יציב קצב קבועים של צעדים בודדים של סינתזת ה-DNA, שיעור שגיאה לסינתזת DNA, זיקה מחייבת את הדנ א. באמצעות שינוי רכיבים כולל, אך לא מוגבל, ששונה nucleoside triphosphates (NTP), מ- DNA ו/או מוטציה DNA polymerases, התועלת היחסית של המצע-DNA פולימראז זוגות ניתן להעריך בצורה יעילה. כאן, אנו מפרטים את הבדיקה עצמה, כולל השינויים חייבים להיעשות כדי להכיל את הדנ א תחל אנרגטיקה תיוג אסטרטגיות כגון-סגול fluorescently הנקרא DNA. בנוסף, שתוארו הצעדים הטכניים מכריע עבור ג’ל אקרילאמיד מוזג, פועל, אשר לעתים קרובות ניתן טכנית מאתגר.
Introduction
ה-DNA polymerases לבצע לסינתזת DNA מדויק ויעיל, חיוני לשמירה על תקינות הגנום. היכולת שהמנגנון מאות נוקלאוטידים בשנייה ובלי שגיאות גם עושה כלים חיוניים polymerases DNA ביולוגיה מולקולרית וביוטכנולוגיה. עם זאת, מאפיינים אלה גם להגביל את היישומים של סובסטרטים M-DNA; באופן כללי, polymerases DNA טבעי אינו יכול לסנתז סובסטרטים רבים מ- DNA ערך פוטנציאלי, ככל הנראה בשל כדי לחץ סלקטיבי גבוה נגד שימוש תקני מצעים ויוו. קבוצות רבות פיתחו גישות אבולוציה מכוונת ליצירת מוטציה polymerases DNA מסוגל M-DNA סינתזה1,2,3,4,5; מאמצים אלה הרחיבו את התועלת ביוטכנולוגי של ה-DNA-6,–7,–8.
כדי להעריך את היכולת של מוטציה polymerases DNA לסנתז M-DNA, אנחנו9,10, ועוד11,12,13 בדרך כלל להשתמש במבחנה מדידות של דנ א פעילות פולימראז, אשר מתוארים בכתב היד. בניסויים אלה, DNA polymerases הם incubated משותפת עם תוויות פריימר/תבנית דופלקס ותערובות טריפוספט nucleoside; המוצרים מוערכים על ידי אלקטרופורזה בג’ל. בהתאם ספציפי השאלה ניסיוני, מוטציה DNA polymerases, תחל ששונה, תבניות ששונו או ששונה nucleoside triphosphates יכול לשמש, הפעלת האבחון הביוכימי שיטתית של פעילות האנזים מוטציה.
מבחינה היסטורית, מבחני האלה צריכים לסמוך על 5′ רדיואקטיבי בתווית כדי לעקוב אחר לסינתזת DNA; בדרך כלל, היו בשימוש 32P ו- 33P; בדרך כלל, תיוג מושגת באמצעות T4 polynucleotide קינאז11. עם זאת, עקב סופיים שלמים עלות גבוהה יחסית רדיואקטיבי תוויות וסילוק בטוח שלהם, הקבוצה שלנו משתמש במקום זאת סינתטי 5′-סגול fluorophore הנקרא DNA. שימוש של imager ג’ל-סגול בעלות נמוכה יחסית, הבחנו דומה זיהוי גבולות. מחקרים קודמים באמצעות תוויות רדיואקטיבי (שלא פורסמו תוצאות). אנחנו בהצלחה שפירטתי בעבר תצפיות9, לא הבחנו הבדל כמותי גדול עם קצב בעבר נמדד קבועים (שלא פורסמו תוצאות).
כדי לנתח את הגודל של ה-DNA, וכך, היקף לסינתזת DNA, אנו מסתמכים על לזיהוי ג’ל אלקטרופורזה שיטות שפותחו במקור עבור רצף סנגר14 לפני כניסתו של נימי אלקטרופורזה15. המרחק של ההפרדה או ניידות יכול לשמש יחידת מידה משקל מולקולרי; פורמט גדול, ג’לים לזיהוי אנכי ניתן להשיג רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המאפשרים תצפית כמותית של ה-DNA oligonucleotides באורכים משתנים.
באופן קולקטיבי, הניסויים האלה הם שיטה חזקה אפיון פולימראז. לאור הזמן הרגיש של תגובות, הכנה וטיפול הכרחי להשגת תוצאות לשחזור. עוד יותר, ואילו הג’ל אקרילאמיד היא דרך יעילה מאוד למדוד לסינתזת DNA, כמו גם רבים אחרים DNA שינוי תגובות, עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. פרוטוקול כאן בתקווה תאפשר למשתמשים לבצע ניסויים אלה תוך הימנעות הטעויות הנפוצות ביותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הנה, תארנו assay כדי לאפיין את הסינתזה בתיווך DNA פולימראז של M-DNA. באמצעות אינפרא אדום הקרוב תחל דנ א שכותרתו ולאחר שימוש בג’ל לזיהוי denaturing כדי לפתור oligonucleotides בגודל שונה, אפשר להשיג רזולוציה נוקלאוטיד יחיד ב- oligonucleotides, מאפשר מדידה מדויקת של סינתזה. גישות אלה ניתן למדוד גם את הפעילות הכוללת של ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי חברת מחקר לקידום מדעי (Cottrell המכללה מלומד פרס #22548) ועל ידי מנרב TriLink (ResearchReward גרנט #G139).
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
