Analyse d’activité de l’ADN polymérase utilisant l’ADN marqué Fluorescent proche infrarouge visualisée par électrophorèse sur Gel d’Acrylamide
Summary
Ce protocole décrit la caractérisation de la synthèse de l’ADN polymérase d’ADN modifié grâce à l’observation des changements à l’ADN fluorescent étiqueté proche infrarouge à l’aide de l’électrophorèse sur gel et gel de l’imagerie. Gels d’acrylamide sont utilisés pour l’imagerie haute résolution de la séparation des acides nucléiques courts, qui migrent à des vitesses différentes selon la taille.
Abstract
Pour n’importe quel enzyme, méthodes quantitatives robustes sont tenus pour la caractérisation des indigènes et ingénieries des enzymes. Pour les ADN polymérases, synthèse de l’ADN peut être caractérisée à l’aide d’un essai in vitro ADN synthèse avec suivi par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Le but de ce test est de quantifier la synthèse de l’ADN naturel et mis à jour l’ADN (ADN-M). Ces approches sont particulièrement utiles pour résoudre les oligonucléotides avec résolution de nucléotide, permettant l’observation des différentes étapes au cours de la synthèse d’oligonucléotide enzymatique. Ces méthodes ont été appliquées à l’évaluation d’un tableau des propriétés biochimiques et biophysiques, comme la mesure des constantes de vitesse de l’équilibre des différentes étapes de la synthèse de l’ADN, le taux d’erreur de la synthèse de l’ADN et l’affinité de liaison de l’ADN. En utilisant modifié composants y compris, mais non limité à, mis à jour le nucléosides triphosphates (NTP), M-ADN et/ou mutants polymérases d’ADN, l’utilité relative de substrat-ADN polymérase paires peuvent être évalués de manière efficace. Ici, nous détaillons le test lui-même, y compris les changements qui doivent être faits pour accommoder les ADN apprêt non traditionnels, étiquetage des stratégies telles que la proche-infrarouge fluorescent étiquetée ADN. En outre, nous avons détaillé les étapes techniques cruciales pour gel d’acrylamide coulée et en cours d’exécution, qui peut souvent être techniquement difficiles.
Introduction
ADN polymérases effectuent la synthèse d’ADN précise et efficace et sont essentiels pour préserver l’intégrité du génome. La capacité de synthétiser des centaines de nucléotides par seconde sans faire d’erreurs fait également des outils essentiels de polymérases d’ADN en biologie moléculaire et biotechnologie. Toutefois, ces propriétés limitent également les demandes pour les substrats de l’ADN monocaténaire ; de manière générale, polymérases d’ADN naturels ne peut pas synthétiser plusieurs substrats de M-ADN potentiellement intéressants, probablement à la haute pression sélective contre l’utilisation des substrats non standard en vivo. De nombreux groupes ont développé des approches d’évolution dirigée pour générer des polymérases d’ADN mutants capables de M-ADN synthèse1a,2,3,4,5; ces efforts sont multipliés l’utilitaire biotechnologique de l’ADN6,7,8.
Pour évaluer la capacité du mutant ADN polymérases de synthétiser l’ADN monocaténaire, nous avons9,10et autres11,12,13 utilisent généralement des mesures in vitro de l’ADN activité polymérase, qui sont décrites dans ce manuscrit. Dans ces expériences, les ADN polymérases sont couvés conjointement avec un apprêt/modèle duplex étiqueté et substrats de nucléoside triphosphate ; les produits sont évalués par électrophorèse sur gel. Selon la question expérimentale spécifique, mutant ADN polymérases, amorces modifiés, modèles modifiés ou mis à jour le nucléosides triphosphates peuvent être utilisé, ce qui permet une évaluation biochimique systématique de l’activité de l’enzyme mutante.
Historiquement, ces tests sont sont appuyés sur un marqueur radioactif de 5′ pour suivre la synthèse de l’ADN ; plus couramment, 32P et 33P ont été utilisées ; en règle générale, l’étiquetage est réalisé en utilisant T4 polynucléotide kinase11. Toutefois, en raison de la durée de vie et le coût relativement élevé des étiquettes radioactifs et de leur élimination en toute sécurité, notre groupe utilise à la place un fluorophore synthétique 5′ du proche infrarouge étiqueté d’ADN. À l’aide d’un imageur de coût relativement faible gel de proche-infrarouge, nous avons observé des limites de détection similaires à des études antérieures à l’aide d’étiquettes radioactives (résultats non publiés). Nous avons reproduit avec succès passé observations9, et nous n’avons pas observé de toute grande différence quantitative avec des constantes de vitesse précédemment mesurée (résultats non publiés).
Pour analyser la taille de l’ADN et par conséquent, l’étendue de la synthèse de l’ADN, nous nous appuyons sur des méthodes d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide développés à l’origine de séquençage Sanger14 avant l’avènement de l’électrophorèse capillaire15. La distance de séparation ou de mobilité peut être utilisée comme une mesure de poids moléculaire ; grand format, des gels de polyacrylamide verticales peut atteindre résolution nucléotide, permettant l’observation quantitative des oligonucléotides d’ADN de différentes longueurs.
Collectivement, ces expériences sont une méthode robuste pour la caractérisation de la polymérase. En raison du temps la nature sensible des réactions, préparation et soins est nécessaire pour obtenir des résultats reproductibles. En outre, tandis que le gel d’acrylamide est un moyen très efficace de mesurer la synthèse de l’ADN, ainsi que nombreux autres ADN modificateurs réactions, avec résolution de nucléotides, il peut être techniquement difficile. Le protocole ici permettra je l’espère aux utilisateurs d’effectuer ces expériences tout en évitant les erreurs les plus communes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit un test afin de caractériser la synthèse induite par l’ADN polymérase d’ADN monocaténaire. En utilisant des amorces ADN marqués de proche infrarouge et à électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant pour résoudre des oligonucléotides de différente tailles, nous pouvons obtenir résolution de nucléotide sur oligonucléotides, permettant une mesure précise de la synthèse. Ces approches peuvent servir à mesurer soit l’activité globale de l’enzyme (section 2.1) ou pour …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Research Corporation pour l’avancement scientifique (Cottrell College Scholar Award #22548) et triples Biotechnologies (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
