Summary

Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida

Published: October 06, 2017
doi:

Summary

Este protocolo describe la caracterización de ADN polimerasa síntesis de ADN modificado a través de la observación de los cambios en el ADN fluorescente etiquetado infrarroja usando proyección de imagen de gel y electroforesis en gel. Geles de acrilamida se usan para obtener imágenes de alta resolución de la separación de los ácidos nucleicos cortos, que migran a distintas velocidades dependiendo del tamaño.

Abstract

Para cualquier enzima, robustos métodos cuantitativos son necesarios para la caracterización de las enzimas nativas y de ingeniería. Para polimerasas de la DNA, síntesis de ADN puede ser caracterizada mediante un en vitro síntesis análisis de ADN seguido de electroforesis en gel de poliacrilamida. El objetivo de este análisis es cuantificar la síntesis de ADN natural y DNA modificado (M-DNA). Estos enfoques son particularmente útiles para la resolución de oligonucleótidos con la resolución de un solo nucleótido, que permite la observación de pasos individuales durante la síntesis de oligonucleótidos enzimática. Estos métodos se han aplicado a la evaluación de una gran variedad de propiedades bioquímicas y biofísicas, como la medición de constantes de velocidad de estado estacionario de cada paso de la síntesis de ADN, la tasa de error de la síntesis de ADN y la afinidad de unión de ADN. Mediante el uso de modificado componentes incluyendo pero no limitado a, trifosfatos de nucleósidos modificados (NTP), M-ADN o mutantes polimerasas de la DNA, la utilidad relativa del sustrato-ADN polimerasa pares pueden evaluarse con eficacia. Detallamos aquí, el ensayo, incluyendo los cambios que deben realizarse para acomodar no tradicionales primer ADN etiquetado estrategias tales como la fluorescencia etiquetada ADN cerca de infrarrojo. Además, hemos detallado pasos técnicos cruciales para gel de acrilamida verter y correr, que puede a menudo ser un desafío técnico.

Introduction

Polimerasas de la DNA realizan precisa y eficiente la síntesis de ADN y son esenciales para mantener la integridad del genoma. La habilidad de sintetizar cientos de nucleótidos por segundo sin errores también hace herramientas esenciales de polimerasas de la DNA en biología molecular y biotecnología. Sin embargo, estas propiedades también limitan las aplicaciones de substratos DNA M; en términos generales, naturales polimerasas de la DNA no pueden sintetizar muchos sustratos potencialmente valiosos de M-DNA, probablemente debido a la alta presión selectiva contra la utilización de sustratos no estándar en vivo. Muchos grupos han desarrollado enfoques de evolución dirigida para generar mutantes polimerasas de la DNA capaces de M-DNA síntesis1a,2,3,4,5; estos esfuerzos han ampliado la utilidad biotecnológica de ADN6,7,8.

Para evaluar la capacidad del mutantes polimerasas de la DNA para sintetizar ADN M, tenemos9,10y otros11,12,13 suelen utilizar mediciones en vitro de ADN actividad de la polimerasa, que se describen en este manuscrito. En estos experimentos, polimerasas de la DNA son co incubados con una cartilla/plantilla etiqueta duplex y sustratos de trifosfato de nucleósido; los productos se evalúan por electroforesis en gel. Dependiendo de la pregunta experimental concreta, polimerasas de ADN mutantes, primers modificados, plantillas modificadas o los trifosfatos de nucleósidos modificados pueden utilizarse, permitiendo la evaluación bioquímica sistemática de la actividad de la enzima del mutante.

Históricamente, estos ensayos se han basado en una etiqueta radiactiva de 5′ a la síntesis de ADN; por lo general, se han utilizado 32P y 33P; por lo general, etiquetado se consigue utilizando T4 Polinucleótido quinasa11. Sin embargo, debido a la vida finita y relativamente alto costo de las etiquetas radiactivas y su disposición segura, nuestro grupo utiliza en cambio un fluoróforo de infrarrojo cercano de sintético 5′ etiquetado ADN. Utilizando a un toner de relativamente bajo costo de infrarrojo cercano de gel, hemos observado los límites de detección similares a estudios previos usando etiquetas radiactivas (resultados no publicados). Hemos reproducido con éxito más allá de observaciones9, y no hemos observado grandes diferencias cuantitativas con constantes de velocidad previamente medido (resultados no publicados).

Para analizar el tamaño del ADN y así, el grado de síntesis de ADN, contamos con métodos de electroforesis en gel de poliacrilamida desarrollados originalmente para secuenciación de Sanger14 antes de la llegada de electroforesis capilar15. La distancia de separación o de la movilidad puede ser utilizada como una medida del peso molecular; gran formato, geles verticales de poliacrilamida puede alcanzar la resolución de un solo nucleótido, que permite la observación cuantitativa de oligonucleótidos de ADN de diferentes longitudes.

Colectivamente, estos experimentos son un método robusto para la caracterización de la polimerasa. Debido al tiempo de naturaleza delicada de las reacciones, preparación y cuidado es necesario para lograr resultados reproducibles. Además, mientras que el gel de acrilamida es una forma altamente efectiva para medir la síntesis de ADN, así como numerosas otras DNA modificar reacciones, con la resolución de un solo nucleótido, puede ser un desafío técnico. Aquí el protocolo que permitirá a los usuarios para llevar a cabo estos experimentos evitando los errores más comunes.

Protocol

1. ensayo de actividad Nota: hay dos tipos típicos de ensayos que se ejecutan a menudo para caracterizar polimerasas de la DNA usando los métodos descritos aquí. Se diferencian en si caracterizan cualitativamente síntesis general (comprende muchos pasos de la síntesis de ADN) o si se centran cuantitativamente en pasos individuales. Describimos los pasos necesarios para cada uno de estos abajo. Nota: Como el conjunto de materiales es relativamente complejo, para los experimentos sens…

Representative Results

Se muestran un análisis de gel de poliacrilamida al éxito de una caracterización cualitativa de la actividad total (descrito en la sección 2.1, figura 1) y de la cinética de estado estacionario (descrito en la nota final de la sección 2.1, figura 2). Un análisis de gel de poliacrilamida al fracasado también se muestra (figura 3). Te…

Discussion

Aquí, hemos descrito un ensayo para caracterizar la síntesis mediada por la ADN polimerasa de la DNA de M. Utilizando cebadores de ADN etiquetados infrarrojo cercano, y usando electroforesis en gel de poliacrilamida de desnaturalización para resolver diverso tamaño de oligonucleótidos, podemos obtener la resolución de un solo nucleótido en oligonucleótidos, permitiendo una medición precisa de la síntesis. Estos enfoques se pueden utilizar para medir ya sea el conjunto de la actividad de la enzima (sección 2.1)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por la Corporación de investigación para el progreso científico (Cottrell Colegio académico Premio #22548) y biotecnologías TriLink (ResearchReward beca #G139).

Materials

Tris HCl Promega H5123
Tris Base Promega H5131
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
Acetylated BSA Promega PR-R3961
KCl Sigma P4504
Dithiothreitol (i.e. DTT) Research Products International D11000
Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) Sigma 03690-100mL
Glycerol Sigma G5516
Formamide Acros AC42374-5000
Orange G Sigma Aldrich O3756
Bromophenol blue Fisher Scientific 50-701-6973
dNTPs Fisher Scientific FERR0191
M-dNTPs (riboNTPs) Fisher Scientific 45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (all other modified NTPs) TriLink Biotechnologies assorted
primer 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
template 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
Acrylamide Research Products International A11405 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide
Tris/Borate/EDTA (TBE) solid Research Products International T22020
Urea ultrapure Research Products International U20200
Gel tape CBS Scientific GT-72-10
Large white spring clamp polypropylene CBS Scientific GPC-0001
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific BP179
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Fisher Scientific BP15020
0.75 mm spacers CBS Scientific SGS-20-0740A
33×42 Notched Glass Plate Set CBS Scientific SGP33-040A
Wedge plate separator CBS Scientific WPS-100
Comb for gel electrophoresis CBS Scientific SG33-0734
Gel electrophoresis rig CBS Scientific SG-400-33
ultrapure water we use a Milli-Q system from Millipore
DNA polymerases we prepare these in our laboratory using published protocols.

References

  1. Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
  2. Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
  3. Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
  4. Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
  5. Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
  6. Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
  7. Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
  8. Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
  9. Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
  10. Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
  11. Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
  12. Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
  13. Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
  14. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  15. Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
  16. Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
  17. Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
  18. Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
  19. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
  20. Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
  21. Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).

Play Video

Cite This Article
Lewis, E. L., Leconte, A. M. DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (128), e56228, doi:10.3791/56228 (2017).

View Video