بوليميراز الدنا نشاط الإنزيم استخدام القريبة من الأشعة تحت الحمراء الحمض النووي المسمى الفلورسنت تصور بالتفريد هلام الاكريلاميد
Summary
ويصف هذا البروتوكول وصف توليف دنا بوليميريز الحمض النووي تم التعديل من خلال مراقبة التغيرات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي القريبة من الأشعة تحت الحمراء باستخدام هلام التفريد وتصوير جل. المواد الهلامية الاكريلاميد تستخدم لتصوير عالية الدقة لفصل الأحماض النووية القصيرة، التي تهاجر بمعدلات مختلفة اعتماداً على حجم.
Abstract
لأي إنزيم، أساليب قوية وكمية مطلوبة من أجل توصيف الإنزيمات الأصلي وهندستها على حد سواء. للحمض النووي [بولمرس]، يمكن وصف تركيب الدنا باستخدام في المختبر الحمض النووي توليف مقايسة تليها هلام polyacrylamide التفريد. أن الهدف من هذا التحليل تحديد مقدار توليف الحمض النووي الطبيعية وتعديل الحمض النووي (م-DNA). هذه الطرق مفيدة بشكل خاص لحل النوكليوتيد مع القرار النوكليوتيدات واحدة، تمكن مراقبة خطوات الفردية خلال التوليف اليغنوكليوتيد الانزيمية. طبقت هذه الأساليب لتقييم مجموعة خصائص البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية مثل قياس معدل الحالة المستقرة الثوابت من الخطوات الفردية لتوليف الحمض النووي، ومعدل الخطأ لتوليف الحمض النووي، والحمض النووي ملزم تقارب. باستخدام تعديل مكونات بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، تريفوسفاتيس المعدلة نوكليوزيد بولمرس (NTP)، M-الحمض النووي، و/أو متحولة الحمض النووي، الفائدة النسبية للركيزة-دنا بوليميريز أزواج يمكن تقييم فعالية. هنا، نحن التفصيل المقايسة نفسها، بما في ذلك التغييرات التي يجب إجراؤها لاستيعاب وسم استراتيجيات مثل القرب من الأشعة تحت الحمراء فلوريسسينتلي المسمى الحمض النووي الحمض الخلوي الصبغي التمهيدي غير التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، نحن مفصلة الخطوات التقنية الحاسمة لهلام الاكريلاميد صب والتشغيل، التي يمكن غالباً ما تكون صعبة من الناحية التقنية.
Introduction
[بولمرس] الحمض النووي إجراء توليف الحمض النووي دقيقة وفعالة وضرورية للحفاظ على سلامة الجينوم. القدرة على تجميع مئات النيوكليوتيدات في الثانية دون أخطاء أيضا يجعل الحمض النووي [بولمرس] أدوات أساسية في البيولوجيا الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية. ومع ذلك، هذه الخصائص تحد أيضا من طلبات الحصول على ركائز M-الحمض النووي؛ وبصفة عامة، الطبيعية الحمض النووي [بولمرس] لا يمكن توليف العديد من ركائز M-الحمض النووي يحتمل أن تكون قيماً، يرجح أن الواجب لارتفاع الضغط الانتقائي ضد استخدام ركائز غير قياسي في فيفو. ووضعت العديد من المجموعات نهج التطور الموجه لتوليد متحولة بولمرس الحمض النووي قادر على م-الحمض النووي التوليف1،2،3،4،5؛ وتوسعت هذه الجهود الأداة الحيوية للحمض النووي6،،من78.
لتقييم قدرة متحولة الحمض النووي [بولمرس] توليف م الحمض النووي، ونحن9،10، والبعض الآخر11،،من1213 عادة استخدام القياسات في المختبر للحمض النووي النشاط بوليميريز، التي يرد وصفها في هذه المخطوطة. في هذه التجارب، بولمرس الحمض النووي المحتضنة يشترك مع مسمى التمهيدي/قالب الطباعة على الوجهين وركائز ثلاثي نوكليوزيد؛ بالتفريد جل تقييم المنتجات. اعتماداً على مسألة تجريبية محددة، متحولة الحمض النووي [بولمرس]، كبسولة تفجير معدلة، قوالب معدلة، أو تريفوسفاتيس نوكليوزيد المعدلة يمكن استخدامها، تمكين البيوكيميائية التقييم المنتظم لنشاط إنزيم المسخ.
تاريخيا، كانت تعتمد هذه الاختبارات على تسمية 5 ‘ مشعة لتتبع الحمض النووي التوليف؛ الأكثر شيوعاً، استخدمت 32ف و 33ف؛ عادة، يتم تحقيق وسم استخدام T4 بولينوكليوتيدي كيناز11. ومع ذلك، نظراً لمدى الحياة المحدودة والتكلفة المرتفعة نسبيا لتسميات المشعة والتخلص المأمون، مجموعتنا بدلاً من ذلك يستخدم قرب من الأشعة تحت حمراء فلوروفوري اصطناعية 5 ‘ المسمى الحمض النووي. استخدام تصوير جل القريبة من الأشعة تحت الحمراء منخفضة تكلفة نسبيا، وقد لاحظنا حدود الكشف مماثلة للدراسات السابقة باستخدام تسميات المشعة (نتائج غير منشورة). ونحن، استنسخت بنجاح في الماضي9من الملاحظات، ولم نلاحظ أي اختلاف كمية كبيرة مع الثوابت معدل قياس سابقا (نتائج غير منشورة).
لتحليل حجم الحمض النووي، وبالتالي، مدى توليف الحمض النووي، نعتمد على أساليب التفريد polyacrylamide هلام وضعت أصلاً سانغر التسلسل14 قبل مجيء التفريد الشعرية15. يمكن استخدام المسافة الفاصلة أو التنقل كمقياس للوزن الجزيئي؛ تنسيق كبير، يمكن تحقيق العمودي polyacrylamide الجل القرار النوكليوتيدات واحدة، مما يتيح مراقبة كمية من النوكليوتيد الحمض النووي لفترات متفاوتة.
مجتمعة، هذه التجارب وسيلة قوية لتوصيف بوليميراز. نظراً للوقت الطبيعة الحساسة لردود الفعل والتحضير والرعاية اللازمة لتحقيق النتائج استنساخه. علاوة على ذلك، بينما هلام الاكريلاميد وسيلة فعالة للغاية لقياس تركيب الدنا، فضلا عن عديدة الحمض النووي تعديل ردود أفعال أخرى، مع قرار النوكليوتيدات واحدة، يمكن أن تمثل تحديا من الناحية التقنية. وسيمكن البروتوكول هنا نأمل أن المستخدمين لإجراء هذه التجارب مع تجنب الأخطاء الأكثر شيوعاً.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهنا، التي وصفناها مقايسة لتوصيف التوليف بوليميراز الدنا بوساطة M-الحمض النووي. باستخدام الإشعال الحمض النووي المسمى القريبة من الأشعة تحت الحمراء، واستخدام يشوه جل polyacrylamide التفريد لحل النوكليوتيد الحجم بشكل مختلف، يمكننا الحصول على قرار واحد النوكليوتيدات في النوكليوتيد، تمكين القيا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل شركة أبحاث “التقدم العلمي” (كوتريل الكلية الباحث جائزة #22548) وقبل “تريلينك الأحيائية” (ريسيرتشريوارد منحة #G139).
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
