Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra
Summary
Uma combinação das técnicas de microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar imagens de alta resolução, tridimensional, em tempo real de migração da crista neural em Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish embriões.
Abstract
Olho congênito e anomalias craniofaciais refletem as interrupções na crista neural, uma população transiente de migratórias células-tronco que dão origem a numerosos tipos de células por todo o corpo. Noções básicas sobre a biologia da crista neural tem sido limitada, refletindo a falta de modelos tractable geneticamente que podem ser estudados em vivo e em tempo real. Zebrafish é um modelo de desenvolvimento particularmente importante para o estudo de populações de células migratórias, tais como a crista neural. Para examinar a migração da crista neural no olho em desenvolvimento, uma combinação das técnicas de microscopia com comprimento de onda longo multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar vídeos de alta resolução, tridimensionais, em tempo real do olho em desenvolvimento em embriões de zebrafish transgênicos, ou seja, Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP), como sox10 e foxd3 tem sido demonstrados em vários modelos animais para regular a diferenciação de crista neural precoce e provavelmente representam marcadores para as células da crista neural. Fóton multi imagem de lapso de tempo foi usada para discernir o comportamento e os padrões migratórios de duas populações de células da crista neural contribuindo para o desenvolvimento inicial do olho. Este protocolo fornece informações para gerar vídeos de lapso de tempo durante a migração da crista neural zebrafish, como exemplo e pode ser aplicado mais para visualizar o desenvolvimento precoce de muitas estruturas no zebrafish e outros organismos-modelo.
Introduction
Doenças congênitas do olho podem causar cegueira de infância e são muitas vezes devido a anomalias da crista neural cranial. Células da crista neural são transitórias células-tronco que surgem a partir do tubo neural e formam numerosos tecidos por todo o corpo. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 as células da crista Neural, derivadas do prosencéfalo e o mesencéfalo, originar o osso e cartilagem da há regiões frontais e a íris, córnea, malha trabecular e esclera no segmento anterior do olho. 4 , 6 , 7 , Células da crista Neural 8 do rombencéfalo forma que arcos da faringe, mandíbula e trato de saída cardíaca. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 estudos evidenciaram as contribuições da crista neural para ocular e periocular desenvolvimento, enfatizando a importância destas células no desenvolvimento do olho de vertebrados. Com efeito, migração de células da crista neural e diferenciação levar à anomalias craniofaciais e oculares como observado na síndrome de Axenfeld-Rieger e síndrome de Plus de Peters. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 assim, uma compreensão abrangente da migração, proliferação e diferenciação dessas células da crista neural irá fornecer insights sobre as complexidades subjacentes doenças oculares congênitas.
O peixe-zebra é um organismo modelo poderoso para estudar o desenvolvimento ocular, como as estruturas do olho zebrafish são semelhantes aos seus homólogos dos mamíferos, e muitos genes são conservados evolutivamente entre zebrafish e mamíferos. 18 , 19 , 20 além disso, zebrafish embriões são transparentes e ovíparos, facilitando a visualização do desenvolvimento do olho em tempo real.
Expansão no trabalho anteriormente publicado,6,7,20 o padrão migratório de células da crista neural foi descrita usando multi fóton fluorescência de lapso de tempo de imagem em linhas de zebrafish transgênicos rotuladas com proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle transcricional do SRY (região sexo-determinando Y)-caixa 10 (sox10) ou D3 Forkhead Box regiões reguladoras do gene (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24. lapso de tempo imagem multi fóton fluorescência é uma técnica poderosa que combina as avançadas técnicas de ópticas do laser, microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação para capturar imagens de alta resolução, tridimensionais de espécimes marcados com fluorophores. 25 , 26 , 27 o uso do fóton multi laser tem vantagens distintas sobre microscopia confocal padrão, incluindo o tecido maior penetração e diminuição da fluoróforo branqueamento.
Usando este método, duas populações distintas de células da crista neural variando em tempo de migração e os caminhos migratórios foram discriminadas, ou seja positiva foxd3 crista neural células do mesênquima periocular e olho em desenvolvimento e crista neural de positivo sox10 células da mesênquima craniofacial. Com este método, é introduzida uma abordagem para visualizar a migração de migração ocular e craniofaciais crista neural no zebrafish, tornando-se fácil observar regulamentado crista neural migração em tempo real durante o desenvolvimento.
Este protocolo fornece informações para gerar vídeos de lapso de tempo durante o desenvolvimento precoce de olho no Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish transgênico, por exemplo. Este protocolo pode ser mais aplicado para a visualização de alta resolução, tridimensional, em tempo real do desenvolvimento precoce de qualquer estrutura ocular e craniofacial, derivada de células da crista neural no zebrafish. Além disso, este método ainda pode ser aplicado para a visualização do desenvolvimento de outros tecidos e órgãos no zebrafish e outros modelos animais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fóton multi imagem de lapso de tempo permite o rastreamento em vivo de populações de células migratórias e transitória. Esta técnica poderosa pode ser usada para estudar processos embrionários em tempo real, e no presente estudo, os resultados deste método aprimorado o conhecimento atual da migração de células da crista neural e do desenvolvimento. Estudos de imagiologia lapso de tempo anteriores normalmente utilizam laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. 29 <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores graças a Thomas Schilling para gentilmente gifting o peixe Tg (sox10:eGFP) e Mary Halloran para gentilmente gifting peixe Tg(foxd3:GFP) .
Materials
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope – FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
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