تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد
Summary
تم تنفيذ مزيج من التقنيات البصرية المتقدمة في ليزر المسح المجهري مع الطول الموجي الفوتوني متعدد الأسفار الإثارة منذ وقت طويل لالتقاط التصوير عالية الدقة، ثلاثي الأبعاد، في الوقت الحقيقي للهجرة crest العصبي في تيراغرام (sox10:EGFP) والأجنة الزرد تيراغرام (foxd3:GFP).
Abstract
العين الخلقية والشذوذ الجمجمة تعكس اضطرابات في قمة العصبية، عدد سكانها عابر للخلايا الجذعية المهاجرة التي تؤدي إلى العديد من أنواع الخلايا في جميع أنحاء الجسم. فهم بيولوجيا crest العصبي كان محدودا، مما يعكس عدم وجود نماذج أصعب وراثيا التي يمكن دراستها في فيفو وفي الوقت الحقيقي. الزرد نموذج إنمائي أهمية خاصة لدراسة السكان خلية المهاجرة، مثل قمة العصبية. لدراسة الهجرة crest العصبي في العين النامية، تم تنفيذ مزيج من التقنيات البصرية المتقدمة في ليزر المسح المجهري مع الإثارة fluorescence فوتون متعدد الطول الموجي الطويل التقاط الفيديو عالية الدقة، ثلاثي الأبعاد، في الوقت الحقيقي للعين النامي في الأجنة المعدلة وراثيا الزرد، هما تيراغرام (sox10:EGFP) وتيراغرام (foxd3:GFP)، كما قد ثبت في العديد من النماذج الحيوانية لتنظيم المبكر crest العصبي التمايز والمرجح أن تمثل علامات للخلايا العصبية كريست sox10 و foxd3 . تصوير الوقت الفاصل بين فوتون متعددة استخدمت لتمييز السلوك وأنماط الهجرة اثنان السكان خلية crest العصبي تسهم في الإسراع بتطوير العين. هذا البروتوكول يوفر المعلومات لتوليد الوقت الفاصل بين أشرطة الفيديو أثناء الهجرة crest العصبي الزرد، على سبيل مثال، ويمكن تطبيقها أيضا على تصور التطور المبكر للعديد من الهياكل في الزرد وغيرها من الكائنات نموذج.
Introduction
أمراض العيون الخلقية يمكن أن تسبب عمي الطفولة وغالباً ما تكون بسبب شذوذ قمة العصبية الجمجمة. هي الخلايا العصبية كريست عابرة من الخلايا الجذعية التي تنشأ من الأنبوب العصبي وتشكل أنسجة عديدة في جميع أنحاء الجسم. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 الخلايا العصبية كريست، المستمدة من بروسينسيفالون وميسينسيفالون، تؤدي إلى العظام والغضاريف ميدفيس في المناطق الأمامية، وايريس، القرنية، ميشوورك ترابيكولار، والصلبة في الجزء الأمامي من العين. 4 , 6 , 7 , 8 خلايا crest العصبي من النموذج رهومبينسيفالون بلعومية الأقواس والفك، والمسالك تدفق القلب. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 قد أبرزت الدراسات بمساهمات قمة العصبية للعين والتنمية بيريوكولار، مؤكدا على أهمية هذه الخلايا في التنمية عين الفقاريات. وفي الواقع، انقطاع الهجرة الخلية كريست العصبية والتمايز تؤدي إلى الشذوذ الجمجمة والعين كما هو ملاحظ في متلازمة أكسينفيلد-ريجر ومتلازمة بيترز بالإضافة إلى. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 تقديم فهم شامل للهجرة، وانتشار والتفريق بين هذه الخلايا العصبية كريست هكذا، في نظرة ثاقبة التعقيدات الكامنة وراء أمراض العيون الخلقية.
الزرد كائن نموذج قوية لدراسة التنمية العين، هياكل العين الزرد مماثلة لنظرائهم في الثدييات، وتقحم حفظت العديد من الجينات بين الزرد والثدييات. 18 , 19 , 20 ، وباﻹضافة إلى ذلك، الأجنة الزرد شفافة والاباضه، تسهيل تصور التنمية العين في الوقت الحقيقي.
التوسع في الأعمال المنشورة سابقا، وصفت6،،من720 نمط الهجرة من الخلايا العصبية كريست استخدام فوتون متعدد الأسفار الوقت الفاصل بين التصوير على خطوط الزرد المعدلة وراثيا المسمى مع البروتين الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) تحت سيطرة جمهورية يوغوسﻻفيا (تحديد الجنس منطقة Y) النسخي-مربع 10 (sox10) أو “مربع فورخيد” D3 المناطق التنظيمية الجينات (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24-فوتون متعدد الأسفار الوقت الفاصل بين التصوير هو تقنية قوية أن يجمع بين التقنيات البصرية المتقدمة لليزر المسح المجهري مع طويلة الطول الموجي الفوتوني متعدد الأسفار الإثارة لالتقاط الصور ذات الدقة العالية، وثلاثي الأبعاد للعينات الموسومة fluorophores. 25 , 26 , 27 استخدام الليزر متعددة فوتون مزايا متميزة أكثر مجهرية [كنفوكل] القياسية، بما في ذلك اختراق الأنسجة المتزايدة وتبيض فلوروفوري انخفض.
باستخدام هذا الأسلوب، كان السكان مميزة اثنين من الخلايا العصبية كريست متفاوتة في توقيت الهجرة ومسارات الهجرة crest العصبي الذين يتعرضون للتمييز، وهي: foxd3-إيجابية الخلايا في ميسينتشيمي بيريوكولار والعين النامية وكريست العصبية الإيجابية sox10 خلايا mesenchyme الجمجمة. مع هذا الأسلوب، وهو عرض نهج لتصور الهجرة الهجرة crest العصبي العين والجمجمة في الزرد، مما يجعل من السهل لمراقبة الهجرة الخاضعة للتنظيم العصبي كريست في الوقت الحقيقي أثناء التطوير.
هذا البروتوكول يوفر المعلومات لتوليد الوقت الفاصل بين أشرطة الفيديو أثناء تطوير العين مبكرا في تيراغرام (sox10:EGFP) والزرد المعدلة وراثيا تيراغرام (foxd3:GFP)، على سبيل مثال. يمكن تطبيق هذا البروتوكول كذلك للمرئيات عالية الاستبانة، ثلاثي الأبعاد، في الوقت الحقيقي للإسراع بتطوير أي بنية العين والجمجمة المستمدة من الخلايا العصبية كريست في الزرد. وعلاوة على ذلك، يمكن كذلك تطبيق هذا الأسلوب لتصور تطوير الأنسجة والأعضاء في الزرد وغيرها نماذج حيوانية أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصوير الوقت الفاصل بين فوتون متعددة يمكن التتبع في فيفو السكان خلية العابرة والمهاجرة. يمكن استخدام هذه التقنية القوية لدراسة العمليات الجنينية في الوقت الحقيقي، وفي هذه الدراسة، نتائج هذا الأسلوب تعزيز المعارف الراهنة للهجرة الخلية crest العصبي والتنمية. عادة استخدام الدراسات الوقت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون توماس شيلينغ للاهداء يرجى الأسماك تيراغرام (sox10:eGFP)، وماري هالوران للاهداء يرجى الأسماك تيراغرام(foxd3:GFP) .
Materials
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope – FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein, ., S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
