Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos
Summary
Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.
Abstract
Angeborene Auge und kraniofaziale Anomalien reflektieren Störungen in der Neuralleiste, eine vorübergehende Bevölkerung von wandernden Stammzellen, die Anlass zu zahlreichen Zelltypen im ganzen Körper. Verständnis der Biologie der Neuralleiste beschränkt wurde, spiegelt einen Mangel an genetisch gefügig Modelle, die studierte in Vivo und in Echtzeit. Zebrafisch ist ein besonders wichtig Entwicklungs Modell für das Studium wandernde Zellenbevölkerungen, wie der Neuralleiste. Um Neuralleisten-Migration in der dritten Auge zu untersuchen, wurde eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langwelligen Multi-Photonen Fluoreszenzanregung implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Videos des dritten Auges in den transgenen Zebrafish Embryos, nämlich Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP), zu erfassen wie sox10 und foxd3 , in zahlreichen Tiermodellen gezeigt haben zu frühen Neuralleiste Differenzierung regulieren und wahrscheinlich Marker für Zellen der Neuralleiste darstellen. Multi-Photonen Zeitraffer Bildgebung wurde verwendet, um das Verhalten und die Migrationsmuster zwei Neuralleiste Zellpopulationen zur frühen Augenentwicklung zu erkennen. Dieses Protokoll enthält Informationen zur Erzeugung von Zeitraffer-Videos während der Zebrafisch Neuralleiste Migration als Beispiel und kann weiter angewendet werden, um die frühe Entwicklung von vielen Strukturen in dem Zebrafisch und sonstige Modellorganismen zu visualisieren.
Introduction
Angeborene Augenkrankheiten können dazu führen, dass Blindheit im Kindesalter und sind häufig durch Anomalien der kranialen Neuralleiste. Zellen der Neuralleiste sind vorübergehende Stammzellen, die aus dem Neuralrohr entstehen und bilden zahlreiche Gewebe im gesamten Körper. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Zellen der Neuralleiste, Prosencephalon und Mittelhirnes, abgeleitet ergeben sich die Knochen und Knorpel des Mittelgesichts und frontalen Regionen, und die Iris, Hornhaut, trabekuläre Geflecht und Sklera im vorderen Bereich des Auges. 4 , 6 , 7 , 8 Neuralleiste Zellen aus Rhombencephalon Form, die den Rachen Bögen, Kiefer und kardiale Ausflusstrakt. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 Studien haben die Beiträge von der Neuralleiste, okuläre und Periorbitalregion Entwicklung hervorgehoben, betonend, wie wichtig dieser Zellen im vertebrate Augenentwicklung. In der Tat, Störung der Neuralleiste Zellwanderung und Differenzierung führen zu okuläre und kraniofaziale Anomalien wie in Axenfeld-Rieger-Syndrom und Peters-Plus-Syndrom festgestellt. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 so, wird ein umfassendes Verständnis von Migration, Proliferation und Differenzierung dieser Zellen der Neuralleiste Einblick in die Komplexität der zugrunde liegenden angeborene Augenkrankheiten, zu schaffen.
Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für okuläre Entwicklung zu studieren, wie die Strukturen des Auges Zebrafisch Pendants Säugetier-ähneln und viele Gene evolutionär zwischen Zebrafisch und Säugetiere konserviert sind. 18 , 19 , Darüber hinaus sind 20 Zebrafisch-Embryonen transparent und ovipar, erleichtert die Visualisierung der Augenentwicklung in Echtzeit.
Erweiterung auf zuvor veröffentlichte Arbeit,6,7,20 das wandernde Muster der Zellen der Neuralleiste wurde beschrieben mit Multi-Photonen Fluoreszenz Zeitraffer imaging in transgenen Zebrafisch Zeilen beschriftet mit grün fluoreszierendes Protein (GFP) von SRY (Geschlecht-Bestimmung der Region Y) transcriptional kontrolliert-Box 10 (sox10) oder Forkhead-Box-D3 (foxd3) gen regulatorischen Regionen. 21 , 22 , 23 , 24. Zeitraffer Multi-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik, die die fortschrittliche optische Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung hochauflösende, dreidimensionale Aufnahmen der Proben mit dem Stichwort Fluorophore kombiniert. 25 , 26 , 27 die Verwendung von Multi-Photonen-Laser hat deutliche Vorteile gegenüber standard konfokalen Mikroskopie, einschließlich erhöhte Gewebe eindringen und verminderte Fluorophore bleichen.
Mit dieser Methode wurden zwei verschiedene Populationen von Zellen der Neuralleiste unterschiedlicher Zeitpunkt der Migration und wandernde Wege Neuralleiste diskriminierte, nämlich foxd3-positiven Zellen in der Periorbitalregion Mesenchym und entwickelnde Auge und Neuralleiste sox10-positiven Zellen in der kraniofazialen Mesenchym. Mit dieser Methode wird ein Konzept für die Migration von okulären und kraniofaziale Neuralleiste Migration im Zebrafisch visualisieren eingeführt, macht es einfach, regulierten Neuralleiste Migration in Echtzeit während der Entwicklung zu beobachten.
Dieses Protokoll enthält Informationen zur Erzeugung von Zeitraffer-Videos während der frühen Augenentwicklung in Tg (Sox10:EGFP) und transgenen Zebrafisch Tg (Foxd3:GFP), als Beispiel. Dieses Protokoll kann weiter für die hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Visualisierung der frühen Entwicklung der okulären und kraniofaziale Struktur abgeleitet aus Zellen der Neuralleiste im Zebrafisch angewendet werden. Darüber hinaus kann diese Methode für die Darstellung der Entwicklung der anderen Gewebe und Organe im Zebrafisch und anderen Tiermodellen weiter angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die in Vivo Verfolgung von Transienten und wandernden Zellpopulationen. Diese leistungsstarke Technik kann verwendet werden, um embryonale Prozesse in Echtzeit zu studieren, und in der vorliegenden Studie, die Ergebnisse dieser Methode erweitert das aktuelle Wissen der Neuralleiste Zelle Migration und Entwicklung. Time-Lapse bildgebende Studien nutzen in der Regel konfokale Laser-scanning-Mikroskopie. 29 , 30</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Thomas Schilling für freundlicherweise gifting Tg (Sox10:eGFP) Fisch und Mary Halloran für freundlicherweise gifting Tg(Foxd3:GFP) Fisch.
Materials
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope – FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein, ., S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
