Мульти Фотон время Замедленная съемка изображений для визуализации в режиме реального времени разработки: Визуализация миграции клеток нервной гребень в Zebrafish эмбриона
Summary
Сочетание передовых оптических методов лазерной сканирующей микроскопии с длинные волны возбуждения флуоресценции мульти ФОТОН был реализован для захвата изображений с высоким разрешением, трехмерные, реального времени нейронные крест миграции в Tg (sox10:EGFP) и тг (foxd3:GFP) zebrafish эмбриона.
Abstract
Врождённая глаз и черепно-лицевых аномалий отражают сбои в нейронные крест, переходных населения мигрирующих стволовых клеток, которые порождают многочисленные типы клеток по всему телу. Понимание биологии нейронные крест был ограниченным, что отражает отсутствие генетически шансов справиться с возникающими моделей, которые могут быть изучены в естественных условиях и в режиме реального времени. Данио рерио представляет собой особо важное значение развития модель для изучения популяций мигрирующих клеток, например нейронные крест. Для изучения миграции нейронные крест в развивающихся глаз, сочетание передовых оптических методов лазерной сканирующей микроскопии с длиной волны возбуждения флуоресценции мульти ФОТОН был реализован для захвата видео с высоким разрешением, трехмерные, реальном времени развивающихся глаза в трансгенных данио рерио эмбрионов, а именно: Tg (sox10:EGFP) и тг (foxd3:GFP), как sox10 и foxd3 было показано в многочисленных животных моделей для регулирования раннего нейронные крест дифференциации и вероятно представляют маркеры для гребня нейронные клетки. Мульти Фотон покадровой изображения была использована для различить поведение и миграционные процессы двух нейронные крест клеточных популяций способствуют раннему развитию глаз. Этот протокол предоставляет информацию для создания покадровой видео во время миграции данио рерио нейронные крест, как, например и может применяться для визуализации раннего развития многих структур в данио рерио и других модельных организмов.
Introduction
Врожденных глазных болезней может привести к слепоте детство и часто из-за аномалий черепа нейронные крест. Гребень нейронные клетки являются переходные стволовые клетки, которые возникают от нервной трубки и образуют многочисленные тканях по всему телу. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 гребень нейронные клетки, производный от переднего мозга и среднего мозга, привести к кости и хряща средней зоны лица и лобной области, Ирис, роговицы, Трабекулярная сеть, и склеры в переднего сегмента глаза. 4 , 6 , 7 , 8 гребень нейронные клетки от ромбовидный мозг форма, которую Фарингальные арки, челюсти и сердечной отток тракта. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 исследования показали вклад нейронные крест для глазной и Периокулярная развития, подчеркивая важность этих клеток в развитии позвоночных глаз. Действительно нарушению миграции клеток нервной гребень и дифференциации привести к краниофациальных и глазные аномалии наблюдаются в Axenfeld Ригер синдром и синдром плюс Питерс. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 таким образом, полное понимание миграции, пролиферации и дифференцировки клеток эти нейронные крест даст понимание сложностей, лежащих в основе врожденных глазных заболеваний.
Данио рерио представляет собой мощную модель организм для изучения развития глазной, как структуры глаза у рыбок данио похожи на млекопитающих их коллегами, и многие гены эволюционно консервируют между данио рерио и млекопитающих. 18 , 19 , 20 Кроме того, данио рерио эмбрионов являются транспарентными и яйцекладущие, облегчения визуализации развития глаз в режиме реального времени.
Расширение на ранее опубликованные работы,6,7,20 мигрирующих шаблон гребень нейронные клетки был описан с помощью нескольких Фотон флуоресценции покадровой изображений на линиях трансгенных данио рерио, помечены Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) под контролем transcriptional SRY (секс определение региона Y)-коробке 10 (sox10) или Forkhead поле D3 (foxd3) ген регулирования регионов. 21 , 22 , 23 , 24. несколько фотонных флуоресценции покадровой изображений является мощная техника, которая сочетает в себе передовые оптические технологии лазерной сканирующей микроскопии с длиной волны мульти Фотон флуоресценции возбуждения для захвата изображений с высоким разрешением, трехмерные образцов, отмеченных флуорофоров. 25 , 26 , 27 использование лазера мульти Фотон имеет явные преимущества над стандартным confocal микроскопии, в том числе рост тканей проникновения и снижение Флюорофор отбеливания.
С помощью этого метода, два отдельных популяций нейронные крест клеток разного времени миграции и миграционных путей были дискриминации, а именно foxd3-позитивных гребень нейронные клетки в Периокулярная Мезенхима и развивающихся глаз и нейронные крест sox10-положительных клеток в краниофациальных мезенхимы. С помощью этого метода вводится подход к визуализации миграции глазной и черепно-лицевых невральной гребень миграции в данио рерио, что делает его легко наблюдать регулируемых нейронные крест миграции в режиме реального времени во время разработки.
Этот протокол содержит сведения для создания покадровой видео во время раннего развития глаз в тг (sox10:EGFP) и трансгенных данио рерио тг (foxd3:GFP), в качестве примера. Этот протокол может применяться для высокого разрешения, трехмерные, в реальном времени визуализации на ранних стадиях развития любой глазной и краниофациальной структуры, производные от гребня нейронные клетки в данио рерио. Кроме того этот метод также может применяться для визуализации развития других тканей и органов в данио рерио и других животных моделях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мульти Фотон покадровой изображений позволяет отслеживать в естественных условиях переходных и мигрирующих клеточных популяций. Эта мощная техника может использоваться для исследования эмбриональных процессы в режиме реального времени, и в настоящем исследовании, результаты э…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Томас Шиллинг за любезно дар рыбы Tg (sox10:eGFP) и Мэри Хэллоран для любезно дар Tg рыбы(foxd3:GFP) .
Materials
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope – FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein, ., S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
