Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's
Summary
Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo’s.
Abstract
Aangeboren oog- en craniofaciale afwijkingen weerspiegelen verstoringen in de neurale crest, een voorbijgaande bevolking van trekkende stamcellen die aanleiding tot talrijke celtypes in het lichaam geven. Inzicht in de biologie van de neurale crest is beperkt, als gevolg van een gebrek aan genetisch hanteerbare modellen die bestudeerd in vivo worden kunnen en in real-time. Zebravis is een bijzonder belangrijk developmental model voor het bestuderen van de trekkende cel populaties, zoals de neurale crest. Onderzoek naar neurale crest migratie naar het derde oog, werd een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie uitgevoerd om vast te leggen met een hoge resolutie, drie-dimensionale, real-time video’s van het derde oog in transgene zebrafish embryo’s, namelijk GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP), zoals sox10 en foxd3 zijn aangetoond in talloze dierlijke modellen om te reguleren van vroege crest van de neurale differentiatie en waarschijnlijk vertegenwoordigen markers voor neurale kamcellen. Multi foton time-lapse imaging werd gebruikt om te onderscheiden van het gedrag en de migratiepatronen van twee neurale crest cel populaties bij te dragen tot de vroege ontwikkeling van het oog. Dit protocol biedt informatie voor het genereren van time-lapse video’s tijdens de zebravis neurale crest migratie als een voorbeeld, en verder kan worden toegepast om te visualiseren van de vroege ontwikkeling van vele structuren in de zebravis en andere modelorganismen.
Introduction
Erfelijke oogziekten jeugd blindheid kunnen veroorzaken en zijn vaak te wijten aan afwijkingen van de craniale neurale crest. Neurale kamcellen zijn voorbijgaande stamcellen die voortvloeien uit de neurale buis en vormen van talrijke weefsels in het lichaam. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 neurale kamcellen, afgeleid van het prosencephalon en mesencephalon, aanleiding geven tot de botten en het kraakbeen van de midface en frontale regio’s, en de iris, hoornvlies trabecular gevlochten en sclera in het anterieure segment van het oog. 4 , 6 , 7 , 8 neurale kamcellen uit de rhombencephalon vorm die de faryngaal bogen, kaak en cardiale uitstroom tractus. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 studies hebben gewezen op de bijdrage van de neurale crest aan oogbeschadigingen en/of en periocular ontwikkelen, wijzend op het belang van deze cellen in gewervelde oog ontwikkeling. Immers, verstoring van neurale crest cel migratie en differentiatie leiden tot craniofaciale en oogbeschadigingen en/of afwijkingen zoals waargenomen in Axenfeld-Rieger syndroom en Peters Plus syndroom. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 zo een grondig inzicht in de migratie, de proliferatie en differentiatie van deze neurale kamcellen geven inzicht in de complexiteit ten grondslag liggen aan erfelijke oogziekten.
De zebravis is een krachtige modelorganisme voor het bestuderen van oogbeschadigingen en/of ontwikkeling, zoals de structuren van de zebravis oog vergelijkbaar met hun tegenhangers van zoogdieren zijn, en vele genen zijn evolutionair bewaard tussen zebravis en zoogdieren. 18 , 19 , 20 voorts zebrafish embryo’s zijn transparant en een zoutwatervis, vergemakkelijkt de visualisatie van oog ontwikkeling in real-time.
Uitbreiding op de eerder gepubliceerde werk,6,7,20 de trekkende patroon van neurale kamcellen werd beschreven met behulp van meerdere foton fluorescentie time-lapse imaging op transgene zebrafish lijnen gemarkeerd met groen fluorescente proteïne (GFP) onder de Transcriptionele controle van het SRY (seks-bepalen regio Y)-vak 10 (sox10) of Forkhead vak D3 (foxd3) gen regelgevende regio’s. 21 , 22 , 23 , 24. multi photon fluorescentie time-lapse imaging is een krachtige techniek die combineert de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie om hoge resolutie, drie-dimensionale beelden van specimens gelabeld met fluorophores te vangen. 25 , 26 , 27 het gebruik van de multi photon laser heeft duidelijke voordelen boven standaard confocale microscopie, waaronder verhoogde weefsel penetratie en verminderde fluorophore bleken.
Met behulp van deze methode, waren twee verschillende populaties van neurale kamcellen variërend in timing van de migratie en migratiestromen trajecten gediscrimineerde, namelijk foxd3-positieve neurale kamcellen in de periocular mesenchym en het derde oog- en sox10-positieve neurale kamcellen in de craniofaciale mesenchym. Met deze methode wordt een benadering van de migratie van oculaire en craniofaciale neurale crest migratie in zebrafish visualiseren ingevoerd, waardoor het gemakkelijk is om te observeren gereglementeerde neurale crest migratie in real-time tijdens de ontwikkeling.
Dit protocol biedt informatie voor het genereren van time-lapse video’s tijdens de vroege ontwikkeling van de oog in GS (sox10:EGFP) en de transgene zebrafish GS (foxd3:GFP), als voorbeeld. Dit protocol kan verder worden toegepast voor de hoge resolutie, drie-dimensionale, real-time visualisatie van de vroege ontwikkeling van een structuur van het oogbeschadigingen en/of en craniofaciale afgeleid van neurale kamcellen in zebrafish. Bovendien kan deze methode verder worden toegepast voor de visualisatie van de ontwikkeling van andere weefsels en organen in de zebravis en andere diermodellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Multi foton time-lapse imaging kunt het volgen in vivo van voorbijgaande aard en trekvogels cel populaties. Deze krachtige techniek kan worden gebruikt om embryonale processen in real-time te bestuderen, en in de huidige studie, de resultaten van deze methode de huidige kennis van neurale crest cel migratie en ontwikkeling verbeterd. Eerdere time-lapse imaging studies gebruiken meestal confocale laser scanning microscopie. 29 , 30 , <sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Thomas Schilling voor het vriendelijk gifting de GS (sox10:eGFP)-fish and Mary Halloran voor het vriendelijk gifting de vis GS(foxd3:GFP) .
Materials
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope – FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein, ., S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
