Использование в естественных условиях и тканей и клеток экспланта подходы к изучению морфогенеза и патогенез эмбриональных и перинатальной аорты
Summary
Протоколы для изучения эмбриональных и перинатальной мышиных аорты, используя в vivo Клональный анализ и сопоставление судьба, аорты эксплантов и изолированных гладких мышц, которые подробно клетки здесь. Эти разнообразные подходы облегчить расследование морфогенеза эмбриональных и перинатальной аорты в нормальное развитие и патогенезе заболеваний.
Abstract
Аорты является крупнейшим артерий в организме. Аорты стена состоит из внутреннего слоя эндотелиальных клеток, средний слой знакопеременных упругих ламелей и гладкомышечные клетки (SMCs) и наружный слой фибробластов и внеклеточного матрикса. В отличие от широко распространенной изучение патологических моделей (например, атеросклероз) в взрослых аорты гораздо меньше известно о эмбриональных и перинатальной аорты. Здесь, мы ориентируемся на SMCs и предоставить протоколы для анализа Морфогенез и патогенезе эмбриональных и перинатальной aortic SMCs нормального развития и болезней. В частности, являются четыре протоколы включены: я) в естественных условиях эмбриональных судьба картирования и Клональный анализ; II) экспланта эмбриональных аорты культуры; III) SMC изоляции от перинатальной аорты; и iv) подкожной осмотического мини-насос размещение в беременных (или небеременных) мышах. Таким образом эти подходы облегчить расследование origin(s), судьба и клоновых архитектуры SMCs в аорте в естественных условиях. Они позволяют для плавного эмбриональных аорты морфогенеза в утробе матери , продолжительное фармакологических агентов. Кроме того изолированные аорты ткани эксплантах или aortic SMCs может использоваться для получения понимание роли конкретных генов цели во время основных процессов, таких как muscularization, распространением и миграции. Эти гипотезы генерации эксперименты на изолированных SMCs и explanted аорты затем может оцениваться в контексте в естественных условиях через фармакологических и генетических подходов.
Introduction
Сосудистой системы многоклеточных организмов функции для доставки питательных веществ и кислорода к клеткам, которые не контакт с внешней окружающей среды и удаления отходов и диоксида углерода из этих клеток. В позвоночных первичной сердечно-сосудистой системы состоит из сердца, которые насосы крови через серию кровеносных сосудов. Стены из крупных кровеносных сосудов, артерий и вен, состоят из трех слоев: я) интима, или внутренний слой эндотелиальных клеток; II СМИ, или средний слой чередующихся окружности удлиненные гладкомышечные клетки SMCs и упругие ламели; и iii) адвентиции или наружный слой соединительной ткани и фибробластов. Подавляющее большинство исследований в сосудистая биология сосредоточиться на эндотелиальных клеток, расследование формирования новой эндотелиальных клеток выстроились трубок по ангиогенез. В сравнении SMCs получают относительно мало внимания. Однако SMCs являются тип критической ячейки в строительстве нормальной артериальной стенки и в сосудистой патологии.
Аорты является крупнейшим калибр артерий в организме, получении сердечного выброса из левого желудочка сердца. Она страдает от различных заболеваний человека, включая атеросклероз, аневризма и рассечение. В взрослых организмов аорты и ее ветвей крупных интенсивно учился в модели сосудистых заболеваний. Например, высоким содержанием жиров кормили мышей, которые являются null для кодирования рецепторов липопротеинов низкой плотности или аполипопротеин E, ген развитие атеросклероза, и недавние судьба сопоставления исследования показывают, что существующие SMCs порождают множественные типы клеток в 1атеросклеротических бляшек. В аневризмы аорты патологические изменения включают SMC апоптоза и внеклеточного матрикса, Ремоделирование2,3.
Значительно меньше известно относительно SMC морфогенеза и патогенез периоды эмбрионального и перинатальной. Здесь мы предоставляем протоколы для изучения эмбриональных и перинатальной аорты SMCs в естественных условиях, в ткани эксплантов и изолированных клеток. Например первый раздел протокола определены судьба сопоставления и Клональный анализ в эмбриональных мышей. CRE рекомбиназа выразил под контролем клетки конкретной промоутера облегчает маркировка отдельных ячеек и их потомства4,5,6; Однако временной контроль клеток конкретных маркировки может быть сложным во время эмбрионального развития у мышей. В этом контексте с эмбрионами, выражая условного CreER под промоутер активно SMCs (e.g.,Myh11 или Acta2) и Cre репортер, мы предоставляем методы для инъекций тамоксифен или его активный метаболит 4-OH-тамоксифен в беременных плотин и для анализа помечены клетки эмбрионов или послеродовой потомство. Кроме того в отличие от судьбы картографические исследования, которые преимущественно используют Cre Репортеры с один репортер Флюорофор1,7, Клональный анализ существенно повышается с многоцветной Cre журналистами.
Второго и третьего протокола описаны методы для изоляции и культивировании эмбриональных эксплантов аорты и аортального SMCs от новорожденных, соответственно. Эти подходы позволяют для манипулирования сигнальных путей, специально в аортальной эксплантов или SMCs и для анализа прямых последствий фармакологических агентов. Таким образом роль конкретных генов в тканях интерес может проверяться в гораздо более быстрой моды чем через традиционные генетические манипуляции в мышах. Кроме того отдельные исследования SMC облегчить анализ миграции клеток и адгезии, которые технически являются ограниченными в естественных условиях.
Наконец в четвертом разделе протокол очерчивает размещения подкожной осмотического мини-насос, загружен с фармакологическими агентами в беременных (или небеременных) мышах. Этот метод облегчает анализ воздействия на эмбриональное развитие, вызванные агентов, которые требуют постоянного притока из-за быстрого метаболизма. Альтернатива частые инъекции не является практичным для многих агентов и следует избегать, так как это может вызвать значительный дискомфорт в беременных дам.
Protocol
Representative Results
Discussion
В отличие от тщательного расследования мышиных аорты и ее крупных филиалов в взрослых патологических состояний, такие как модели атеросклероза меньше известно относительно Морфогенез и патогенезе эмбриональных и перинатальной аорты. Здесь мы ориентируемся на эмбриональных/перината…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Дин ли для обмена его лаборатории протокол для аорты SMC изоляции. Финансовая поддержка была оказана национальных институтов здравоохранения (R21NS088854, R01HL125815 и R01HL133016 к D.M.G), Американской ассоциации сердца (целевые субсидии 14GRNT19990019 до D.M.G.) и Йельский университет (Браун-Кокс стипендий до утра и запуска средства для D.M.G.).
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
