באמצעות In Vivo , רקמות, תאים Explant גישות ללמוד מורפוגנזה ו פתוגנזה של הלידה של אבי העורקים
Summary
פרוטוקולים ללמוד העורקים מאתר של הלידה באמצעות ויוו ניתוח המשובטים, מיפוי הגורל, אבי העורקים explants שריר חלק מבודד התאים מפורטים כאן. גישות מגוונות אלה לקדם את חקירת מורפוגנזה של אבי העורקים של הלידה בהתפתחות נורמלית, בפתוגנזה של המחלה.
Abstract
אבי העורקים הוא העורק הגדול ביותר בגוף. הקיר אבי העורקים מורכב של השכבה הפנימית של תאי אנדותל, שכבה אמצעית לסירוגין lamellae אלסטית ותאי שריר חלק (SMCs), השכבה החיצונית של fibroblasts, מטריצה חוץ-תאית. בניגוד המחקר הנרחב של מודלים פתולוגי (למשל, טרשת עורקים) באבי העורקים למבוגרים, הרבה פחות ידוע על הלידה של אבי העורקים. כאן, אנו מתמקדים SMCs ולספק פרוטוקולים עבור הניתוח של מורפוגנזה ו בפתוגנזה של הלידה של אבי העורקים SMCs להתפתחות התקינה, המחלה. באופן ספציפי, הפרוטוקולים ארבע כללה הן: אני) ויוו גורל עובריים מיפוי וניתוח המשובטים; ii) explant העורקים עובריים תרבות; iii) SMC בידוד מן העורקים הלידה; ו- iv) תת עורית משאבת מיני osmotic השמה בעכברים בהריון (או שאינה בהריון). לפיכך, גישות אלה לקדם את החקירה של origin(s), גורל, אדריכלות המשובטים של SMCs אבי העורקים vivo בתוך. הם מאפשרים להתכוונן העורקים עובריים מורפוגנזה בתוך הרחם על ידי חשיפה מתמשכת סוכנים תרופתי. בנוסף, מבודד רקמות אבי העורקים explants או SMCs של אבי העורקים יכול לשמש כדי לקבל תובנות לגבי התפקיד של גנים ספציפיים מטרות במהלך תהליכי יסוד כגון muscularization, הפצה, העברה. ניסויים אלה השערת מניבות SMCs מבודדים, העורקים explanted יכול להידרש ואז בהקשר ויוו דרך גישות תרופתי גנטי.
Introduction
מערכת הדם של אורגניזמים רב תאיים פונקציה כדי לספק חומרים מזינים וחמצן לתאים כי הם לא בקשר עם הסביבה החיצונית כדי להסיר תאים אלה הפסולת, פחמן דו-חמצני. החוליות, מורכבת מערכת הדם העיקריים הלב, אשר שואב דם דרך סדרה של כלי הדם. דפנות כלי דם גדולים, כגון העורקים והוורידים, מורכבת משלוש שכבות: אני) אינטימה או השכבה הפנימית של תאי אנדותל; ii מדיה), או שכבה אמצעית לסירוגין circumferentially מוארך תאי שריר חלק SMCs ואת lamellae אלסטית; ו- iii) adventitia, או השכבה החיצונית של רקמות החיבור ואת fibroblasts. הרוב המכריע של לימודי ביולוגיה וסקולרית מתמקדים תאי אנדותל, חוקר היווצרות חדשים אנדותל מצופה תא צינורות דרך אנגיוגנזה. לשם השוואה, SMCs מקבלים תשומת לב מועטה יחסית. עם זאת, SMCs הם סוג תא קריטי בניית הקיר עורקי נורמלי, פתולוגיות כלי הדם.
אבי העורקים הוא העורק בקוטר הגדול ביותר בגוף, מקבל את תפוקת הלב של החדר השמאלי של הלב. זה הוא נגועים על ידי מחלות אנושיות מגוונות, כולל טרשת עורקים, מפרצת לנתיחה. אורגניזמים למבוגרים, אבי העורקים ואת סניפיה הגדולים נלמדים באופן אינטנסיבי במודלים של מחלת כלי דם. למשל, בשומן האכיל עכברים שאינם null עבור הגן קידוד של קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה או אפוליפופרוטאין E, לפתח טרשת עורקים, מחקרים אחרונים של מיפוי גורל מציינים כי קיימים SMCs להצמיח סוגי תאים מרובים ב- פלאק טרשת עורקים1. מפרצת אבי העורקים, שינויים פתולוגיים לכלול SMC ואפופטוזיס ו מטריצה חוץ-תאית שיפוץ2,3.
באופן משמעותי פחות ידוע לגבי SMC מורפוגנזה ו פתוגנזה בתקופות של הלידה. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים עבור הלומדים הלידה של אבי העורקים SMCs ויוו, explants רקמות, תאים בודדים. למשל, החלק הראשון של הפרוטוקול משרטט גורל מיפוי וניתוח המשובטים בעכברים עובריים. Recombinase Cre הביע תחת השליטה של תאים ספציפיים מקדם מכירות מאפשר הסימון של תאים ספציפיים, שלהם רומא4,5,6; עם זאת, שליטה הטמפורלי של תאים ספציפיים תיוג יכול להיות מאתגר במהלך התפתחות עובריים בעכברים. בהקשר זה, עם עוברי לבטא את CreER מותנה תחת מקדם מכירות פעיל של SMCs (e.g.,Myh11 או Acta2), עיתונאי Cre, אנו מספקים שיטות הזרקת טמוקסיפן או שלה המטבוליט הפעיל 4-OH-טמוקסיפן, סכרים בהריון עבור ניתוח התאים שכותרתו עוברי או צאצא כמחנכת. יתר על כן, בניגוד גורל מיפוי מחקרים, אשר predominately לנצל Cre עיתונאים עם1,fluorophore7כתב יחיד, ניתוח המשובטים באופן משמעותי מוגברת עם צבע רב Cre כתבים.
החלקים השני והשלישי של פרוטוקול מתארים שיטות בידוד, culturing עובריים explants של אבי העורקים, אבי העורקים SMCs מ- neonates, בהתאמה. גישות אלה מאפשרות המניפולציה של איתות המסלולים, בפרט explants של אבי העורקים או SMCs, וכן ניתוח ההשפעות הישירות של סוכנים תרופתי. לפיכך, התפקיד של גנים ספציפיים ברקמות עניין יכולים להיות מוקרן בצורה מהירה הרבה יותר מאשר דרך מסורתית שינויים גנטיים בעכברים. בנוסף, המחקרים SMC מבודד להקל על הניתוח של נדידת תאים, הדבקה, אשר מבחינה טכנית מוגבל בתוך vivo.
בסופו של דבר, החלק הרביעי פרוטוקול מתארת את המיקום של משאבת מיני תת עורית osmotic נטען עם סוכנים תרופתי בהריון (או שאינה בהריון) עכברים. שיטה זו מקלה על הניתוח של ההשפעה על התפתחות הנגרמת על ידי סוכנים הדורשים תקינות בגלל חילוף חומרים מהיר. החלופה של זריקות תכופות אינה מעשית עבור סוכנים רבים, יש להימנע, שכן היא עלולה לגרום אי נוחות משמעותי בסכר בהריון.
Protocol
Representative Results
Discussion
בניגוד חקירה מקיפה של העורקים מאתר ואת סניפיה הגדולים במצבים פתולוגיים למבוגרים, כגון מודלים של טרשת עורקים, פחות ידוע לגבי את מורפוגנזה בפתוגנזה של העורקים של הלידה. כאן, אנו מתמקדים העורקים עובריים/הלידה, במיוחד SMCs, ולספק פרוטוקולים ללמוד העורקים באמצעות ויוו, רקמת explant, ואת הגישות S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים דין Li על שיתוף הפרוטוקול של המעבדה שלו לבידוד SMC אבי העורקים. תמיכה במימון סופק על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R21NS088854, R01HL125815, R01HL133016 אל D.M.G), איגוד הלב האמריקני (מענק הסיוע 14GRNT19990019 כדי D.M.G.), ואת אוניברסיטת ייל (מלגת בראון-Coxe כדי לפנות בוקר וההרצה כספים D.M.G.).
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
