Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta

De bloedsomloop systems van meercellige organismen functie voor voedingsstoffen en zuurstof naar de cellen die zijn niet in contact met de externe omgeving en het verwijderen van afvalstoffen en koolstofdioxide van deze cellen. In gewervelde dieren bestaat de primaire bloedsomloop uit het hart, welke pompen bloed door middel van een reeks van bloedvaten. De muren van de grote bloedvaten zoals slagaders en aders, bestaan uit drie lagen: ik) de intima, of binnenlaag van endotheliale cellen; II) de media, of de middelste laag van wisselende omtrek langwerpige zachte spiercellen SMCs en elastische lamellen; en iii) de adventitia, of de buitenlaag van bindweefsel en fibroblasten. De overgrote meerderheid van de studies in vasculaire biologie focus op endotheliale cellen, onderzoek naar de vorming van nieuwe endothelial cel omzoomde buizen door middel van angiogenese. In vergelijking krijgen SMCs relatief weinig aandacht. SMCs zijn echter een kritische celtype in de bouw van de normale arteriële muur en vasculaire pathologieën.

De aorta is de grootste kaliber slagader in het lichaam, het ontvangen van de cardiale output van het linkerventrikel van het hart. Het wordt geteisterd door uiteenlopende ziekten bij de mens, met inbegrip van atherosclerose en aneurysma dissectie. In volwassen organismen, worden de aorta en zijn grote takken intens bestudeerd in modellen van vasculaire ziekte. Bijvoorbeeld, hoog vet dieet gevoed muizen die zijn leeg voor de codering van de low-density lipoprotein receptor of apolipoproteïne E, gene ontwikkelen van atherosclerose, en recente lot toewijzing studies blijkt dat bestaande SMCs aanleiding geven tot meerdere celtypen in de atherosclerotische plaque¹. In de aorta aneurysma omvatten pathologische veranderingen SMC apoptosis en extracellulaire matrix remodelleren van^2,3.

Aanzienlijk minder is gekend over SMC genuitdrukking en pathogenese tijdens de embryonale en perinatale periode. Wij bieden hier protocollen voor studeren embryonale en perinatale aorta SMCs in vivo, in weefsel explantaten en geïsoleerde cellen. Bijvoorbeeld, bakent het eerste deel van het protocol lot mapping en klonen analyse in embryonale muizen. CRE recombinase uitgedrukt onder de controle van de promotor van een cel-specifieke vergemakkelijkt de markering van de specifieke cellen en hun nageslacht^4,5,6; temporele controle van cel-specifieke etikettering kan echter uitdagende zijn tijdens de embryonale ontwikkeling in muizen. In dit verband bieden met embryo’s uiting geven aan de voorwaardelijke CreER onder actief in SMCs (e.g.,Myh11 of Acta2) en een Cre-verslaggever, de promotor wij de methoden voor het injecteren van tamoxifen of zijn actieve metaboliet 4-OH-tamoxifen in zwangere dammen en voor het analyseren van de gelabelde cellen in embryo’s of postnatale nakomelingen. Bovendien, in tegenstelling tot lot toewijzing studies, waarvoor voornamelijk gebruik maken van Cre verslaggevers met een enkele verslaggever fluorophore^1,7, klonen analyse is aanzienlijk verbeterd met Multi-Color Cre verslaggevers.

De tweede en derde van protocol beschreven methoden om te isoleren en kweken van embryonale aorta explantaten en aorta SMCs van pasgeborenen, respectievelijk. Deze benaderingen toestaan voor het manipuleren van signaalroutes, specifiek in de aorta explantaten of SMCs, en voor het analyseren van de directe effecten van farmacologische agenten. Zo kan de rol van specifieke genen in het weefsel van belang worden vertoond in een veel snellere manier dan door middel van traditionele genetische manipulaties in muizen. Bovendien, de geïsoleerde SMC studies vergemakkelijken de analyse van cel migratie en adhesie, die technisch beperkt in vivo.

Tot slot, de vierde protocol sectie bakent de plaatsing van een subcutane osmotische mini pomp geladen met farmacologische agenten in zwanger (of niet-drachtige) muizen. Deze methode vereenvoudigt de analyse van het effect op de ontwikkeling van het embryo veroorzaakt door agentia die continue infusie vanwege snelle stofwisseling vereisen. Het alternatief voor frequente injecties is niet praktisch voor veel agenten en moet worden voorkomen, aangezien het groot ongemak in de zwangere dam veroorzaken kan.