Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta
Summary
Protokolle für das Studium der embryonalen und perinatalen murinen Aorta mit in Vivo klonalen Analyse und Schicksal Mapping, Aorten-Explantaten und isolierten glatte Muskulatur, die Zellen detailliert sind hier. Diese unterschiedlichen Ansätze ermöglichen die Untersuchung der Morphogenese der embryonalen und perinatale Aorta in normale Entwicklung und die Pathogenese in Krankheit.
Abstract
Die Aorta ist die größte Arterie im Körper. Die aortalen Wand besteht aus einer Innenlage aus Endothelzellen, einer Mittelschicht aus alternierenden elastische Lamellen und glatten Muskelzellen (SMCs) und eine äußere Schicht der Fibroblasten und extrazelluläre Matrix. Im Gegensatz zu der weit verbreiteten Studie von pathologischen Modelle (z.B. Arteriosklerose) in der Erwachsenen Aorta ist über die embryonale und perinatale Aorta weit weniger bekannt. Hier konzentrieren wir uns auf SMCs und Protokolle für die Analyse der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorten SMCs in normale Entwicklung und Krankheit. Insbesondere die vier Protokolle enthalten sind: ich) in Vivo embryonalen Schicksal Kartierung und klonale Analyse; (II) Explant embryonalen Aorta Kultur; (III) SMC isoliert von der perinatalen Aorta; und iv) subkutane osmotische Mini-Pumpe Platzierung in schwanger sind (oder nicht-schwangeren) Mäuse. Diese Ansätze ermöglichen die Untersuchung des Origin(s), des Schicksals und der klonalen Architektur von SMCs in die Aorta in Vivo. Sie ermöglichen für die Modulation embryonalen Aorta Morphogenese im Mutterleib durch die ständige Einwirkung von pharmakologischen Wirkstoffen. Darüber hinaus isolierte Aorta Gewebe explants oder Aorten SMCs Einblicke in die Rolle des spezifischen gen Ziele während grundlegende Prozesse wie Muscularization, Proliferation und Migration eingesetzt werden. Diese Hypothese schaffende Experimente an isolierten SMCs und der explantierten Aorta können dann im Kontext in Vivo durch pharmakologische und genetische Ansätze beurteilt werden.
Introduction
Die Herz-Kreislauf-Systeme der Mehrzeller Funktion, Nährstoffe und Sauerstoff zu den Zellen zu liefern sind, die nicht in Kontakt mit der äußeren Umgebung und Abfallstoffe und Kohlendioxid aus diesen Zellen zu entfernen. Bei Wirbeltieren besteht das primäre Herz-Kreislauf-System des Herzens, welche pumpt durch eine Reihe von Blutgefäßen Blut. Die Wände der großen Blutgefäße wie Arterien und Venen, bestehen aus drei Schichten: ich) die Intima oder innere Schicht von Endothelzellen; (II) die Medien oder mittlere Schicht abwechselnd umlaufend länglichen glatten Muskelzellen SMCs und elastische Lamellen; und Iii) der Adventitia oder äußere Schicht von Bindegewebe und Fibroblasten. Die überwiegende Mehrheit der Studien in der vaskulären Biologie konzentrieren sich auf Endothelzellen, die Bildung von neuen endothelial Zelle gesäumten Röhren durch Angiogenese untersucht. Im Vergleich dazu erhalten SMCs relativ wenig Beachtung. SMCs sind jedoch eine kritische Zelltyp in den Bau der normalen Arterienwand und vaskuläre Erkrankungen.
Die Aorta ist die größte Kaliber Arterie im Körper, das Herzzeitvolumen aus dem linken Ventrikel des Herzens empfangen. Es wird von vielfältigen menschlichen Krankheiten, einschließlich Arteriosklerose, Aneurysma und Dissektion heimgesucht. Im erwachsenen Organismus sind die Aorta und ihre Hauptzweige in Modellen von Gefäßerkrankungen intensiv untersucht. Zum Beispiel fettreiche Diät gefüttert Mäuse, die für die Codierung der Rezeptor Low density Lipoprotein oder Apolipoprotein E, gen null sind entwickeln Atherosklerose und den letzten Schicksal Mapping Studien zeigen, dass bereits vorhandene SMCs mehrere Zelltypen entstehen die atherosklerotischen Plaque1. In Aortenaneurysmen pathologische Veränderungen gehören SMC Apoptose und extrazelluläre Matrix Umbau2,3.
Während der embryonalen und perinatale ist wesentlich weniger über SMC Morphogenese und Pathogenese bekannt. Hier bieten wir Protokolle für ein Studium embryonaler und perinataler Aorten SMCs in Vivo, in Gewebe Explantaten und in isolierten Zellen. Beispielsweise beschreibt der erste Abschnitt des Protokolls Schicksal Kartierung und klonale Analyse embryonaler Mäuse. Cre-Rekombinase ausgedrückt unter der Kontrolle eines Promotors zellspezifische erleichtert die Kennzeichnung bestimmter Zellen und ihre Nachkommen4,5,6; zeitliche Steuerung der Zelle-spezifische Kennzeichnung kann jedoch während der Embryonalentwicklung bei Mäusen schwierig sein. In diesem Zusammenhang bieten mit Embryonen, die mit dem Ausdruck der bedingten CreER unter Förderer aktiv in SMCs (e.g.,Myh11 oder Acta2) und eine Cre-Reporter wir Methoden zur Injektion von Tamoxifen oder seine aktiven Metaboliten 4-OH-Tamoxifen in schwanger Dämme und für die Analyse von markierten Zellen in Embryonen oder postnatale nachkommen. Darüber hinaus ist im Gegensatz zu Schicksal Mapping Studien, welche überwiegend nutzen Cre-Reporter mit einem einzigen Reporter-Fluorophor1,7, klonale Analyse deutlich mit Multi-Color-Cre-Reporter verstärkt.
Die zweite und dritte des Protokolls Abschnitten Methoden zur Isolierung und Kultivierung embryonalen Aorten-Explantaten und Aorta SMCs von Neugeborenen, beziehungsweise. Diese Ansätze erlauben die Manipulation der Signalwege, speziell in Aorta Explantaten oder SMCs, und für die Analyse der direkten Effekte pharmakologischer Substanzen. So kann die Rolle bestimmter Gene in das Gewebe von Interesse weit schneller Weise als durch traditionelle genetische Manipulationen an Mäusen gezeigt. Darüber hinaus die isolierte SMC Studien erleichtern die Analyse der Zellwanderung und Adhäsion, technisch begrenzt in Vivo.
Der vierte Protokoll Abschnitt beschreibt schließlich die Platzierung einer subkutanen osmotische Mini-Pumpe mit pharmakologischer Substanzen bei schwangeren (oder nicht-schwangeren) Mäusen geladen. Diese Methode erleichtert die Analyse der Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung verursacht durch Agenten, die kontinuierliche Infusion wegen schnellen Stoffwechsel benötigen. Die Alternative, häufige Injektionen ist nicht praktisch für viele Agenten und sollte vermieden werden, da es erhebliche Beschwerden in der Schwangerschaft Damm führen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Gegensatz zu den umfangreichen Untersuchungen der murinen Aorta und ihrer großen Niederlassungen in Erwachsenen pathologischen Zuständen, wie z. B. Modelle von Arteriosklerose ist weniger bekannt, bezüglich der Morphogenese und der Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta. Hier setzen wir auf die embryonale/perinatale Aorta, speziell die SMCs und bieten Protokolle zur Untersuchung der Aorta durch in-Vivo, Gewebe Explant und SMC Isolierung nähert. Diese kostenlosen Ansätze bieten die Ermittler mit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die gemeinsame Nutzung seiner Laborprotokoll für Aorten-SMC Isolierung Dean Li. Unterstützung wurde gefördert durch die National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 und R01HL133016, D.M.G), der American Heart Association (Beihilfe 14GRNT19990019, DMG) und der Yale University (Brown-Coxe Fellowship, Uhr und Start Fonds, DMG).
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
