Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal
Summary
Protocolos para el estudio de la aorta murina embrionaria y perinatal mediante análisis clonal de en vivo y asignación de destino, explantes aórticos y aislada del músculo liso células se detallan aquí. Estos diversos enfoques facilitan la investigación de la morfogénesis de la aorta embrionaria y perinatal en el desarrollo normal y la patogénesis en la enfermedad.
Abstract
La aorta es la arteria más grande en el cuerpo. La pared aórtica se compone de una capa interna de células endoteliales, una capa intermedia de alternan laminillas elásticas y células musculares lisas (SMCs) y una capa externa de fibroblastos y matriz extracelular. En contraste con el extenso estudio de modelos patológicos (por ejemplo, ateroesclerosis) en la aorta del adulto, mucho menos se sabe sobre la aorta embrionaria y perinatal. Aquí, nos centramos en comités y protocolos para el análisis de la morfogénesis y patogénesis de la SMCs aorta embrionarias y perinatales en el desarrollo normal y la enfermedad. Específicamente, los cuatro protocolos incluidos son: i) en vivo destino embrionario mapeo y análisis clonal; II) explante aorta embrionaria cultura; III) aislamiento SMC de la aorta perinatal; y iv) colocación de mini-bomba osmótico subcutánea en ratones embarazadas (o no-). Así, estos enfoques facilitan la investigación de los orígenes, destino y arquitectura clonal de comités en la aorta en vivo. Que permiten la modulación de morfogénesis de aorta embrionaria en el útero por la continua exposición a agentes farmacológicos. Además, explantes de tejido aórtico aislado o comités aórticas pueden utilizarse para ganar penetraciones en el papel de objetivos gen específico durante procesos fundamentales tales como la migración, proliferación y muscularization. Estos experimentos de generación de hipótesis en comités aislados y la aorta explanted entonces pueden evaluarse en el contexto de en vivo a través de enfoques farmacológicos y genéticos.
Introduction
Circulatorio de la función de los organismos multicelulares para entregar nutrientes y oxígeno a las células son no en contacto con el medio externo y para eliminar productos de desecho y dióxido de carbono de estas células. En vertebrados, el sistema circulatorio primario consiste en el corazón, que las bombas de la sangre a través de una serie de vasos sanguíneos. Las paredes de grandes vasos sanguíneos, como arterias y venas, consisten en tres capas: i) la íntima o capa interna de células endoteliales; II) los medios de comunicación o capa media alternancia circunferencial alargada de las células musculares lisas comités y laminillas elásticas; y iii) la adventicia o capa externa de tejido conectivo y los fibroblastos. La gran mayoría de los estudios en biología vascular se centran en las células endoteliales, investiga la formación de nuevos tubos de revestimiento de células endoteliales a través de la angiogénesis. En comparación, comités reciben relativamente poca atención. Sin embargo, los comités son un tipo de célula fundamental en la construcción de la pared arterial normal y patologías vasculares.
La aorta es la arteria de mayor calibre en el cuerpo, recibiendo el gasto cardíaco del ventrículo izquierdo del corazón. Es afectado por diversas enfermedades humanas, incluyendo la aterosclerosis, aneurisma y disección. En organismos adultos, la aorta y sus ramas principales son intensamente estudiados en modelos de enfermedad vascular. Por ejemplo, dieta alta en grasas alimentó ratones que son nulos para el gen que codifica el receptor de lipoproteína de baja densidad o apolipoproteína E, desarrollar la ateroesclerosis, y estudios recientes de asignación de destino indican que SMCs preexistentes dan lugar a múltiples tipos de células en la 1de la placa aterosclerótica. En aneurismas de la aorta, los cambios patológicos incluyen SMC apoptosis y matriz extracelular remodelación2,3.
Sustancialmente se sabe menos sobre SMC morfogénesis y patogénesis durante los períodos embrionarios y perinatales. Aquí, le ofrecemos protocolos para estudiar embrionaria y perinatal aórtica SMCs en vivo, en explantes de tejidos y en células aisladas. Por ejemplo, la primera sección del protocolo delinea destino mapeo y análisis clonal en ratones embrionarios. Recombinase de CRE expresado bajo el control de un promotor específico de célula facilita el marcado de células específicas y su progenie4,5,6; sin embargo, el control temporal de células específicas de etiquetado puede ser difícil durante el desarrollo embrionario en ratones. En este contexto, con los embriones expresando el CreER condicional bajo un promotor activo en comités (e.g.,Myh11 o Acta2) y un reportero de Cre, ofrecemos métodos para inyectar el tamoxifeno o su metabolito activo 4-OH-tamoxifeno en las madres embarazadas y para analizar las células etiquetadas en embriones o vástagos postnatal. Además, en contraste con estudios de asignación de destino, que predominantemente utilizan Cre reporteros con un solo reportero fluoróforo1,7, análisis clonal es sustancialmente mejorado con reporteros de Cre de varios colores.
Las secciones segunda y terceros del protocolo describen los métodos para aislar y cultivar explantes aórticos embrionarios y aórticas comités de recién nacidos, respectivamente. Estos enfoques permiten la manipulación de vías de señalización, concretamente en explantes aórticos o PYME y para analizar los efectos directos de los agentes farmacológicos. Así, el papel de genes específicos en el tejido de interés puede ser defendido en una manera mucho más rápida que a través de manipulaciones genéticas tradicionales en ratones. Además, los estudios aislados de SMC facilitan el análisis de la migración celular y adherencia, que son técnicamente limitado en vivo.
Por último, la cuarta sección de protocolo delinea la colocación de una mini-bomba osmótica subcutánea repleta de agentes farmacológicos en ratones embarazadas (o no-). Este método facilita el análisis del efecto sobre el desarrollo embrionario causada por agentes que requieren infusión continua debido a metabolismo rápido. La alternativa de inyecciones frecuentes no es práctica para muchos agentes y debe evitarse, ya que puede causar malestar significativo en la presa embarazada.
Protocol
Representative Results
Discussion
En contraste con las investigaciones extensas de la aorta murina y sus ramas principales en adultos condiciones patológicas, tales como modelos de aterosclerosis, se sabe menos sobre la morfogénesis y la patogenesia de la aorta embrionaria y perinatal. Aquí nos centramos en la aorta embrionaria/perinatal, especialmente las PYME y proporcionar protocolos para estudiar la aorta a través de en vivo, explantes de tejido, y aislamiento de SMC se acerca. Estos enfoques cortesía proporcionan al investigador con di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dean Li para el intercambio de protocolo de su laboratorio para el aislamiento de SMC aórtica. Apoyo financiero fue provisto por los institutos nacionales de salud (R21NS088854, R01HL125815 y R01HL133016 a D.M.G), la Asociación Americana del corazón (14GRNT19990019 subvenciones a D.M.G.) y la Universidad de Yale (Brown-Coxe beca para A.M. y puesta en marcha fondos a D.M.G.).
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
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