CRISPRコンカテマーを用いたマウス小腸オルガノイドにおける複数の遺伝子ノックアウトのためのプロトコル

1. CRISPR-コンカテマーベクターのためのgRNA設計注：このセクションの目的は、最適なターゲティング戦略を選択する方法、およびCRISPRコンカテマーベクターの特定のオーバーハングを含むgRNAを設計する方法を説明することです。 選択したCRISPR gRNA設計ツールを使用して目的の遺伝子に対するgRNAを設計する。例については表の表を参照してください。 注：1組のパラロガス遺伝子を標的とする場合、1遺伝子につき1つのgRNAを設計することは可能ですが、遺伝子ごとに2つのgRNAを設計してダブルノックアウトを達成する可能性を高めることが推奨されます （ 図1 ）。 制限地図作成ツールを使用してgRNAにBbs I認識部位が含まれていないことを確認します（例の表を参照）。 表1に示すように、各オリゴに特異的CRISPR-コンカテマーベクターオーバーハングを付加する。 "fo：keep-together.within-page =" 1 "fo：keep-with-next.within-page =" カセット1 カセット2 カセット3 カセット4 配列（5'-3 '） CACCGG [gRNA1] GT ACCGG [gRNA2] G CCGG [gRNA3] ACACCGG [gRNA4] GTT 配列（5'-3 '） TAAAAC [RC-gRNA1] CC AAAAC [RC-gRNA2] C AAAC [RC-gRNA3] CTAAAAC [RC-gRNA4] CCG 表1：CRISPRコンカテマーベクターの各カセットのオーバーハング。 2.CRISPR-コンカテマーベクターへのgRNAのクローニング オリゴのリン酸化およびアニーリング 注：この手順は、どのようにto各gRNAオリゴのトップストランドおよびボトムストランドをアニールする方法、および単一の反応でそれらの末端をリン酸化する方法。 以下の手順に従って、オリゴをリン酸化し、氷上で上鎖および下鎖を​​アニーリングするための反応混合物を調製する。 注：すべてのオリゴを1つの反応にプールすることができます。例えば、4gRNAコンカテマーベクターの場合、8オリゴを一緒にプールする。 3つのコンカテマーについて、3.0μLのgRNAトップ鎖（各gRNAから1.0μL、10μM、1μL/ gRNA）、3.0μLのgRNAボトム鎖（各gRNAから1.0μL;10μM、1μL/ gRNA）、2.0μLのT4 DNAリガーゼ緩衝液（10×）、1.0μLのT4 PNK、および総容量20.0μLまでH 2 Oを加える。 ピペットでよく混合し、以下の設定を使用してサーモサイクラーでこれを実行します：37℃で30分間、95℃で5分間、25℃で0.3℃/分で下降、4℃で保持。 Bbs私はシャッフル反応 注：このセクションでは、プレアニーリングされたgRNAオリゴは、消化とライゲーションのサイクルを交互に繰り返すことによって、コンカテマーベクターの適切な位置に1ステップで取り込まれます。 DNase / RNaseを含まない水で1：100の反応液を希釈して、3および4gRNAコンカテマーベクターを作製する。 注：2 gRNAコンカテマーをクローニングする場合、このステップは必要ありません 。 以下の手順に従って、氷上で反応をシャフリングするBbsを組み立てます。ベクターのみを含むネガティブコントロールを含めます。 100μgのCRISPRコンカテマーベクター、10.0μLのオリゴ混合物、1.0μLのBSA含有制限酵素緩衝液（10倍）、 1.0μLDTT （10mM）、 1.0μLATP （10mM）、 1.0μLBbs I、 1.0μLT7リガーゼ、およびH 2 Oを総量20.0μLまで含む。 ピペット操作でよく混合し、以下の設定を使用してサーモサイクラーでこれを実行する：3および4gRNA-コンカテマーをクローニングするために50サイクルを実行し、 <s37℃で5分間、21℃で5分間、37℃で15分間、次いで4℃で永久に保持する、2gRNA-コンカテマーについて25サイクル以上。 エキソヌクレアーゼ処理 注：線状化したDNAの痕跡を取り除いてクローニングの効率を上げるため、この手順を強くお勧めします。 次のように、 Bbs Iシャフリング反応をDNAエキソヌクレアーゼ（ 表の表を参照）で処理する。 前のステップ（2.2.3）から11.0μLのライゲーションミックスを取り出し、1.5μLのエキソヌクレアーゼ緩衝液（10×）、1.5μLのATP（10mM）、1.0μLのDNAエキソヌクレアーゼを添加し、総容量を水で15.0μLにする。 37℃で30分間インキュベートし、続いて70℃で30分間インキュベートする。 注：このステップでは、混合物中の残留線状化DNAが除去され、クローニング効率が向上します。 2μLの反応混合物を用いて化学的に変換する熱ショックによるテント大腸菌 12 。 注：あるいは、-20℃で最大1週間反応を保存することができます。 制限消化 注：この手順の目的は、制限消化によってクローニング手順の成功を評価することです。 CRISPR-コンカテマーベクター中のgRNAインサートの存在を確認するために、接種ループを有する4〜8個の細菌コロニーを選択し、4mLのLB培地中で37℃で一晩オービタルシェーカーで各クローンを増殖させる。製造業者の指示に従ってプラスミドミニプレップキットを用いてDNAを抽出する（ 表の表を参照）。 細菌インキュベーター内で37℃で3時間インキュベートすることにより、10μLの反応液中に10UのEcoRI + 5UのBglIIを含む200ngのDNAを消化する。サイズ比較のための陽性対照として対応する元のベクターと別の反応混合物を含める。 注：ティこれらの2つの制限酵素が全コンカテマーを排出するため、すべてのコンカテマーが存在するかどうかを確認する。これらは、各コンカテマーの予想されるサイズであり、2gRNAコンカテマー（800bp）、3gRNAコンカテマー（1.2kbp）、および4gRNAコンカテマー（1.6kbp）である。 1％アガロースゲル上で90Vで約20分間消化反応を行う。 UVトランスイルミネーターを使用してゲルを視覚化する。正確な挿入サイズのクローンを、そのバンドパターンが元のベクターのものと一致すること、およびDNAラダーを使用して各フラグメントが予想されるサイズを有することを確認することによって同定する。 選択したクローンを5U Bbs Iで37℃で3時間、細菌インキュベーターで消化します。対照として対応する元のベクターと別の反応混合物を含める。 注：この追加の消化ステップは、gRNAが正しい位置にクローニングされ、結果としてすべてのBbs I認識部位が失われていることを確認することです。 消化反応を実行する1％アガロースゲル（90V、約20分間）。彼らがgRNAだけを含んでいるので、 Bbs Iによって切断されていないベクターだけを修正すると考えてください。 ベクターシーケンシング 注：このステップの目的は、制限消化分析によって正しいと同定されたベクター中のgRNA配列の存在を確認することである。 以下のプライマーを用いてSanger配列決定13により陽性コンカテマーベクターを確認する： フォワード：TCAAGCCCTTTGTACACCCTAAG（最初のgRNAカセットをチェックするため） Linker1_Forward：GACTACAAGGACGACGATGACAA（2番目のgRNAカセットをチェックするため） Linker2_Reverse：GGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGT（第2のgRNAカセットをチェックするため） Linker2_Forward：ACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCC（第3のgRNAカセットをチェックするため） Linker3_逆：TCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCAT（第3のgRNAカセットをチェックするため） 逆：AGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAG（最後のgRNAをチェックするため）カセット） シークエンシングリードで配列を検索することにより、すべてのgRNAの存在を確認します。 3.エレクトロポレーションによる腸オルガノイドのトランスフェクション注：この手順は、Fujii et al 。によって発行されたプロトコルに基づいています。 2015年には、マウス小腸オルガノイド培養液14のための適応を持ちます。 エレクトロポレーション前 注：このセクションでは、エレクトロポレーションの前にマウスの腸オルガノイドを調製する方法について説明します。これは、エレクトロポレーションの間の起こりうる毒性作用を防止する。 トランスフェクション手順の0日目に、1：2の比率でオルガノイドを分割する。 注：腸のオルガノイド培養物は、以前に確立されたプロトコールに従って陰窩分離を行うことによって得ることができる15 。を参照してください<stすべてのメディア構成について表2を参照のこと。 電気穿孔のためにオルガノイドを分割する場合、トランスフェクション当たり48ウェルプレートの最低6ウェルを種にする。 20μL、基底行列滴でオルガノイドを播種し、37℃でWENR +のNIC媒体（のWnt + EGF +ノギン+ Rスポンジン+ニコチンアミド）でそれらを増殖、加湿インキュベーター中5％CO 2（としては、以前15に記載） 。 2日目にWENR + Nicを抗生物質を含まないEN（EGF + Noggin）+ CHIR99021（グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3阻害剤）+ Y-27632（ROCK阻害剤）250μLに置き換えて培地を交換する（ 表2参照）。 注：すべてのステップで、48ウェルプレートの各ウェルに添加する培地の量は250μLです。 3日目に、オルガノイド培地を抗生物質を含まないEN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25％v / vジメチルスルホキシド（DMSO）に交換する。 細胞の調製 注意：ここでは、オルガノイドを機械的および化学的解離によって小細胞クラスターに分ける方法を説明します。これらの手順は、手順の成功に不可欠です。 4日目に、1mLのピペットチップを用いて基底マトリックスのドームを破壊し、オルガノイドを1.5mLチューブに移す。 48ウェルプレートの4つのウェルの内容物をチューブにプールする。 P200ピペットで上下に約200回ピペット操作することにより、オルガノイドを小さな断片に機械的に破壊する。室温で遠心分離し、600×gで5分間遠心分離する。 培地を除去し、ペレットを細胞培養グレードの組換えプロテアーゼ（材料表参照）1 mLに再懸濁する。 37℃で最大5分間インキュベートし、4倍の対物レンズを備えた倒立光学顕微鏡下で50μLのサンプルを点検する。 注：エレクトロポレーション後の細胞生存を増加させるので、10〜15個の細胞のクラスターが望ましい。 細胞懸濁液を低結合15 mLチューブに移し、抗生物質を含まない9mLの基礎培地を添加することにより解離させた（ 表2参照）。室温、600xgで5分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを1mLの還元血清培地（ 表の表を参照）に再懸濁する。 Bürkerのチャンバーで細胞数を数え、エレクトロポレーション反応あたり最低1 x 10 5個の細胞を使用する。還元血清培地9mLを15mLチューブに加え、室温で遠心分離し、400×gで3分間遠心分離する。 エレクトロポレーション 注：以下のセクションでは、エレクトロポレーションを実行し、後にオルガノイドを回復させる方法について説明します。 すべての上清を除去し、ペレットをエレクトロポレーション溶液で再懸濁する（ 表の表を参照）。総量10μgのDNAを細胞懸濁液に添加し、エレクトロポレーション溶液を最終容量100μLに加え、細胞DN氷上での混合物。 1：1の比でCas9発現プラスミド（ 例えば、 Addgene＃41815）と組み合わせてCRISPR-コンカテマーベクターを使用する。 注記：添加するDNAの総容量は、総反応量の10％以下である必要があります。 トランスフェクション効率（ 例： pCMV-GFP、Addgene＃11153、または一般的なGFP発現プラスミド）を評価するために、GFPプラスミドを含む別のトランスフェクションミックスを含めます。 細胞-DNA混合物をエレクトロポレーションキュベットに加え、エレクトロポレーターチャンバーに入れる。エレクトロポレーターの適切なボタンを押してインピーダンスを測定し、それが0.030-0.055Ωであることを確認します。 表3に示す設定に従ってエレクトロポレーションを行います。 注：インピーダンス値が許容範囲外になる場合は、キュベット内の溶液量を調整してください。 エレクトロポレーションバッファー+ Y-27632400μLをキュベットに加え、すべてを1.5mLチューブに移す。インカバ室温で30分間インキュベートして細胞を回収し、続いてそれらを室温で3分間400xgで回転させる。 上清を除去し、ペレットを20μL/ウェルの基底マトリックスに再懸濁する。種子は、約1×10 4〜1×10 5個の 48ウェルプレートにウェル当たり細胞およびEN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25％（v / v）のDMSO媒体を加えます。 37℃でインキュベートする。 5日目に、培地をEN + CHIR99021 + Y-27632に交換し、GFP発現を観察することによりトランスフェクション効率を確認する（ 図2 ）。オルガノイドを37°Cに保ち、2日後にEN + CHIR99021 + Y-27632培地を再懸濁する。 9日目に、培地をWENR + Nic + Y-27632に交換し、37℃でインキュベートする。 注：Y-27632は、7〜10日後（16〜19日目）に除去することができます。 ポーリングパルス </strong> 転送パルス 電圧 175V 20V パルス長 5ミリ秒 50msec パルス間隔 50msec 50msec パルス数 2 5 減衰率 10％ 40％ 極性 + +/- 表3：エレクトロポレーションの設定。 4.成長因子退出注：ここでは、腸オルガノイドにおけるWnt経路の負のレギュレーターをノックアウトする際に、成長因子回収実験を行う方法を例示する。 10-14日後電気穿孔法を用いて、上記の手順（3.2.1-3.2.2）に従って48ウェルプレート中で1：3の比率でオルガノイドを分割する。 オルガノイドペレットを20μLの基底膜マトリックスに再懸濁し、37℃で10分間固化させる。次に、標的遺伝子のノックアウトが達成されているかどうかを試験するために、250μLの増殖因子枯渇培地（ 例えば、 EN）をオーバーレイする。5 。 野生型野生型（WT）対照オルガノイドおよび変異オルガノイド5、15の間の生存の差を確認するために3継代- 2の最小の成長因子欠乏条件下オルガノイドを分割します。 注：野生型オルガノイドは、2つの継代にわたって増殖因子欠乏培地で生存できないはずであるが、突然変異株は増殖できるはずである。