פרוטוקול של נוקאוט גנים מרובים עכבר קטן Organoids באמצעות CISPR-concatemer
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השלבים לשיבוט מספר רב של מדריך RNAs לתוך אחד וקטור RNA concatmer מדריך, שהוא שימוש מיוחד ביצירת נוק-אאוט רב גנים באמצעות טכנולוגיית CRISPR / Cas9. הדור של נוקאאוטס כפול באורגנואידים במעיים מוצג כיישום אפשרי של שיטה זו.
Abstract
CRISPR / Cas9 הטכנולוגיה שיפרה מאוד את הכדאיות ואת המהירות של אובדן של הפונקציה מחקרים חיוניים בהבנת תפקוד הגן. ב אוקריוטים גבוהים יותר, גנים paralogous יכול להסוות פנוטיפ פוטנציאלי על ידי פיצוי אובדן גן, ובכך להגביל את המידע שניתן להשיג ממחקרים גנטיים להסתמך על נוקאאוט הגן יחיד. פיתחנו שיטה שיבוט חדש, מהיר עבור RNA מדריך (gRNA) concatemers על מנת ליצור knockouts גן רב לאחר סיבוב אחד של transfection ב אורגנואידים מעיים עכברים קטנים. האסטרטגיה שלנו מאפשרת concatemerization של עד ארבעה gRNAs בודדים לתוך וקטור אחד על ידי ביצוע תגובה אחת גרירת שער אחת עם oligos annealed gRNA ו וקטור retroviral תוכנן מראש. זה מאפשר גם את נוקאאוט בו זמנית של עד ארבעה גנים שונים, או יעילות מוגברת נוקאאוט בעקבות המיקוד של גן אחד על ידי gRNAs מרובים. בפרוטוקול זה, אנו מראים בפירוטאיך לשכפל ביעילות gRNAs מרובים לתוך וקטור CRISPR- רטרובירל concatmer וכיצד להשיג electroporation יעיל ביותר באורגנואידים במעיים. כדוגמה, אנו מציגים כי נוקאאוט בו זמנית של שני זוגות של גנים קידוד הרגולטורים השליליים של נתיב איתות Wnt (Axin1 / 2 ו Rnf43 / Znrf3) הופך אורגנואידים מעיים עמיד לנסיגה של גורמי גדילה מרכזיים.
Introduction
הגישה הגנטית הפוכה היא שיטה נפוצה לחקר הפונקציה של הגן. במיוחד, אובדן של תפקוד מחקרים, שבו הפרעה של הגן גורם שינויים פנוטיפיים, לשחק תפקיד מפתח בבניית ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים. שיטת CRISPR / Cas9 מייצגת את ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיה להנדסת גנום, והיא חוללה מהפכה בתרגול הנוכחי של גנטיקה בתאים ובאורגניזמים. Cas9 הוא endonuclease מונחה RNA אשר נקשר רצף DNA ספציפי המשלים את gRNA ומייצר הפסקה פעמיים גדיל (DSB). זה DSB מגייס מכונות תיקון DNA, בהיעדר תבנית ה- DNA עבור רקומבינציה הומולוגיים, יהיה לקשור מחדש את גדיל ה- DNA לחתוך דרך מצמידים השגיאה הלא הומולוגיים סוף שהצטרף, אשר יכול ובכך לגרום החדירות או מחיקות של נוקליאוטידים (s) גרימת מוטציות frameshift 1 .
הקלות הגדולה צדדיות של CRISPR / Cas9 apprאואך עשה את זה כלי אטרקטיבי ביותר עבור מסכי הגנום בקנה מידה נוקאאוט שנועדו לפענח פונקציות הגן הלא ידוע 2 , 3 . אף על פי כן, גישות נוקאאוט חד פעמיות של גנים הן בשימוש מוגבל אם קיימים מספר פרלוגים עם פונקציות מיותרות. לכן, ablating גן יחיד לא יכול להיות מספיק כדי לקבוע את הפונקציה של הגן הזה נתון פיצוי אפשרי על ידי paralogues וכתוצאה מכך שינוי פנוטיפי מעט או ללא 4 . לכן חשוב לדפוק paralogues במקביל על ידי מתן מספר gRNA וקטורים מיקוד גנים paralogous שונים על מנת להתגבר על ההשפעה של פיצוי גנטי.
כדי להרחיב את השימוש של CRISPR / Cas9 כדי נוק-אאוט הגן paralogous, פיתחנו לאחרונה מהירה, צעד אחד שיבוט שיטה לשכפל עד ארבעה gRNAs מראש annealed לתוך וקטור retroviral אחד 5 . עמוד השדרה, הנקרא CRISPR-concatemer, מבוססעל MSVV retroviral פלסמיד המכיל חוזרים קלטות ביטוי gRNA. כל קלטת מכילה שני אתרי זיהוי הפוכה של IIS IIS סוג הגבלה BBS אני, אשר ניתן להחליף באופן בלתי הפיך על ידי oligo gRNA annealed עם overhangs תואמים באמצעות תגובת שער הזהב דשדוש בצינור אחד 6 . שיטה זו שיבוט מורכב מחזורים חוזרים ונשנים של עיכול קשירת המאפשרים הרכבה בו זמנית של שברי DNA מרובים על ידי ניצול רצפים התלוי שונים שנוצרו על ידי Bbs I. הייחודיות של האנזים הזה הוא, למשל, את היכולת לבצע קיצוצים אסימטריים מחוץ להכרה שלה סדר פעולות; לכן, כל קלטת יכול להיות רצף שונה עם overhangs מותאמים אישית צף BBS אני הליבה באתר ובדרך זו, כל gRNA ניתן לשכפל במיקום מסוים הכיוון של וקטור concatmer.
כהוכחה לעיקרון, הוכחנו את השימוש באסטרטגיה זו בעכברים אורגנואידים על ידי הפרעה בו זמנית שני זוגות של הרגולטורים השליליים paralogous של מסלול Wnt על ידי סיבוב אחד של electroporation 5 .
במהלך השנים האחרונות, קבוצות רבות אחרות פיתחו אסטרטגיות דומות המבוססות על מספר וקטורים ביטוי gRNA שנבנו באמצעות שער הזהב דשדוש 7 כדי להשיג נוק-אאוט גנים רב במערכות מודל שונים, כגון שורות תאים אנושיים 8 , 9 , דג הזברה 10 ו Escherichia coli 11 . בפרוטוקולים שלהם, gRNAs משוכפלים הראשון לתוך וקטורים ביניים בודדים ולאחר מכן התאספו יחד לתוך מוצר אחד הסופי. לעומת זאת, היתרון העיקרי של האסטרטגיה שלנו CRISPR- concatemer היא הנוחות של אחד BBS אני דשדוש, צעד שיבוט. כמו אחרים gRNA concatemers, השיטה שלנו מאפשרת גם את knockout בו זמנית של עד ארבעגנים שונים או הגדילה יעילות CRISPR נוקאאוט בעקבות המיקוד של אחד או שני גנים עם gRNAs מרובים ( איור 1 ).
בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט כל צעד בדור של CRISPR-concatemer וקטורים, מעיצוב gRNA לתגובה שער הזהב לאישור שיבוט מוצלח. אנו מספקים גם פרוטוקול יעיל מאוד transfection של CRISPR- concatemers לתוך אורגנואידים מעיים קטנים העכבר על ידי electroporation וגורמים הבאים גורם הגדילה נסיגה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את כל השלבים הדרושים כדי ליצור CRISPR- concatemers ולהחיל CRISPR- concatemers ב אורגנואידים מעיים העכבר על מנת לדפוק בו זמנית מספר גנים. כפי שצוין לעיל, אסטרטגיה זו יש מספר יתרונות, כגון מהירות, יעילות גבוהה ויעילות-עלות.
על מנת לבצע בהצלחה את ההליך כולו, יש כמה היבטים קריטיים לשקול. ראשית, חיוני כי כל oligos gRNA הם annealed כראוי phosphorylated, כפי שהם מייצגים את החומר המוצא עבור BBS אני שיבוט התגובה כי כשלעצמה הוא מאוד יעיל. שנית, כאשר electroporating אורגנואידים, התאים יותר בשימוש בכל תנאי, גבוה יותר את יעילות transfection מקסימלית. בנוסף, חשוב גם כי לאחר דיסוציאציה התא, אשכולות תאים קטנים להשתלט על תאים בודדים.
עם זאת, ניתן להיתקל prob טכניתLems כאשר מנסים או שיבוט או transfection בפעם הראשונה; במקרה של בעיות במהלך שיבוט gRNA, מומלץ לבדוק את רצף אוליגו gRNA, ואם נכון, בחר מושבות חיידקים נוספים להגבלת עיכול הגבלה. אם יעילות transfection ואת הכדאיות התא נמוכים שלאחר electroporation, אז זה רצוי לחזור על פרוטוקול באמצעות תאים יותר לכל תנאי והפחתת הזמן של ניתוק התא ל 3 דקות.
למרות הדור של CRISPR- concatemers הוא זול יחסית וקל יחסית, ביצוע בקנה מידה גדול בקנה מידה גנטי מסכי אורגנואידים היא לא, כמו קנה המידה הוא מוגבל על ידי העלויות הקשורות לתרבות אורגנומית ועל ידי עבודה אינטנסיבית אופי. ראוי להזכיר במקרה זה כי השיטה CRISPR-concatemer הוא גם תואם עם שורות תאים, כגון HEK293 ותאי גזע עובריים העכבר.
ללא קשר למערכת הסלולרית, חסרון פוטנציאלי נוסף של זהTrategy ניתן נתקל כאשר מכוון לעבר knockout בו זמנית של שלושה או ארבעה גנים שונים. לדוגמה, כל gRNA תהיה יעילות מיקוד שונה ושינויים להכות את כל הגנים בו זמנית יכול להיות נמוך יחסית; מסיבה זו, רצוי להעסיק את מערכת concatemer לכוון יותר gRNA אחד נגד אותו הגן.
אסטרטגיות חלופיות באופן דומה מבוסס על שער הזהב דשדוש הוצעו במשך השנים לייצר וקטורים gRNA multiplex 7 , 8 . עם זאת, בשיטה שלנו ניתן ישירות להרכיב gRNAs מרובים לתוך וקטור יחיד retroviral בסיבוב אחד של שיבוט, מה שהופך אותו מתאים ליצירת ספריות gRNA למקד paralogues.
ה- CRISPR-concatemer שלנו בנוי על עמוד השדרה הקטורית RTVIRAL MSCV. לפיכך, gRNA concatmer המכיל רטרווירוס ניתן להשתמש כדי ליצור שורות תאים יציב כי overexpGRNAs ress. בשילוב עם מערכת CAS9- inducible, אפשר לבצע נוקאאוט paralog inducible באמצעות המערכת שלנו.
לסיכום, כאן אנו מתארים כיצד לשכפל עד ארבעה gRNAs שונים לתוך אותו וקטור בשלב אחד וכיצד ליישם אסטרטגיה זו לתרבות organoid עם יעילות transfection גבוהה. יתר על כן, אנו מספקים הצעות שימושיות כדי למקסם את סיכויי ההצלחה לאורך כל התהליך.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכריסטופר הינדלי על הקריאה הביקורתית של כתב היד. AM נתמך על ידי Wntsapp (מארי Curie ITN), AA-R. נתמך על ידי המועצה למחקר רפואי (MRC), ו BK.K. ו RM נתמכים על ידי סר הנרי דייל אחוות מן Wellcome Trust ואת החברה המלכותית [101241 / Z / 13 / Z] ולקבל תמיכה באמצעות מענק הליבה מן Wellcome אמון MRC כדי Wellcome Trust – MRC קיימברידג 'תא גזע המכון .
Materials
| Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
| Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
| T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
| T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
| DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
| ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
| FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
| Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
| BglII | New England Biolabs | R0144 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
| Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
| Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
| 10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
| Plasmid mini kit | Qiagen | 12125 | |
| Table top microcentrifuge | Eppendorf | UY-02580-01 | |
| Inoculating loops | Microspec | PLS5 | |
| Bacteria incubator | Sanyo | MIR-262 | |
| Luria-Bertani broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3522 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Agarose gel electrophoresis apparatus | Bioneer | A-7020 | |
| Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
| Glutamax (L-Glutamine) 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
| HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
| B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Mouse EGF 500 µg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
| Mouse Noggin 100 µg/mL | Peprotech | 250-38 | |
| Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
| R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
| Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
| Y-27632 10 µM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| 48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
| IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
| TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
| Opti-MEM (reduced serum medium ) | Life technologies | 51985-034 | |
| Electroporation Cuvettes 2mm gap | NepaGene | EC-002S | |
| Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
| NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
| Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
| BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |
References
- Mali, P., et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. -. P., Velasco-Herrera, M. D. C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nat Biotech. 32 (3), 267-273 (2014).
- Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A Genome-Wide CRISPR Library for High-Throughput Genetic Screening in Drosophila Cells. J Genet Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
- Diss, G., Ascencio, D., DeLuna, A., Landry, C. R. Molecular mechanisms of paralogous compensation and the robustness of cellular networks. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 322 (7), 488-499 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Merenda, A., Mustata, R. C., Li, T., Dietmann, S., Koo, B. -. K. Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids. Dev Biol. 420 (2), 1-7 (2016).
- Ran, F. A., Hsu, P. P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS ONE. 4 (5), (2009).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 4 (5), 5400 (2014).
- Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), 1-11 (2014).
- Yin, L., et al. Multiplex Conditional Mutagenesis Using Transgenic Expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
- Cress, B. F., Toparlak, O. D., et al. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synth Biol. 4 (9), 987-1000 (2015).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zimmermann, J., Voss, H., Schwager, C., Stegemann, J., Ansorge, W. Automated Sanger dideoxy sequencing reaction protocol. FEBS Letters. 233 (2), 432-436 (1988).
- Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nat. Protoc. 10 (10), 1474-1485 (2015).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
