Bir CRISPR-konkantör kullanarak Fare Küçük Bağırsak Organoidleri Üzerinde Birden Fazla Gen Kıyamet Protokolü
Summary
Bu protokol, CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanarak çoklu gen nakavtları yaratmada özel olarak kullanılan bir kılavuz RNA konformemer vektörüne birden fazla tekli kılavuz RNA'yı klonlamak için gereken aşamaları açıklar. Bağırsak organoitlerinde çift nakavt üretimi bu yöntemin olası bir uygulaması olarak gösterilmiştir.
Abstract
CRISPR / Cas9 teknolojisi, gen fonksiyonunu anlamada gerekli olan fonksiyon kaybı çalışmalarının fizibilitesini ve hızını büyük ölçüde geliştirmiştir. Yüksek ökaryotlarda, paralog genler, bir genin kaybını telafi ederek potansiyel bir fenotipi maskeleyebilir ve böylece, tek gen nakavtına dayanan genetik araştırmalardan elde edilebilecek bilgileri sınırlayabilir. Fare küçük bağırsak organoitlerinde tek bir transfeksiyon sonrasında çoklu gen nakavtları yaratmak için kılavuz RNA (gRNA) konsatemeri için yeni ve hızlı bir klonlama yöntemi geliştirdik. Stratejimiz, tavlanmış gRNA oligoları ve önceden tasarlanmış bir retroviral vektör ile tek bir Golden Gate karıştırma reaksiyonu gerçekleştirerek, dört tekil gRNA'yı tek bir vektöre konsatemerleştirebilmenizi sağlar. Bu, dört farklı genin aynı anda nakavmesine ya da bir genin birden fazla gRNA tarafından hedeflenmesini takiben arttırılmış nakavt etkinliğine izin verir. Bu protokolde, ayrıntılı olarak gösteriyoruzÇok sayıda gRNA'yı retroviral CRISPR-konkanteemer vektörüne verimli bir şekilde nasıl klonlayabilir ve bağırsak organoidlerinde yüksek verimli elektroporasyon nasıl elde edilir. Örnek olarak, Wnt sinyal yolağının (Axin1 / 2 ve Rnf43 / Znrf3) negatif regülatörlerini kodlayan iki çift genin aynı anda nakavt edilmesinin bağırsak organoidlerini temel büyüme faktörlerinin geri çekilmesine karşı dirençli hale getirdiğini gösteriyoruz.
Introduction
Ters genetik yaklaşım, bir genin işlevini araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Özellikle, bir genin parçalanmasının fenotipik değişikliklere neden olduğu fonksiyon kaybı çalışmaları, biyolojik süreçler konusundaki anlayışımızı oluşturmakta önemli bir rol oynamaktadır. CRISPR / Cas9 yöntemi, genom mühendisliği teknolojisindeki en son ilerlemeyi temsil eder ve mevcut hücre ve organizma genetik pratiğini geliştirmiştir. Cas9, gRNA'ya komplementer spesifik bir DNA sekansına bağlanan ve bir çift telli kopuk (DSB) üreten bir RNA yönlendirmeli endonükleazdır. Bu DSB, homolog rekombinasyon için bir DNA şablonunun yokluğunda kesilen DNA iplikçiklerini hataya eğilimli, homolog olmayan bir uç birleştirme yoluyla yeniden bağlayacak olan DNA tamir makinelerini işe alıyor; bu da, nükleotid (ler) in eklenmesine veya silinmesine neden olabilir; FrameShift Mutasyonlarına Neden Olur 1 .
CRISPR / Cas9 uygulamasının büyük kolaylığı ve çok yönlülüğüOach, bilinmeyen gen fonksiyonlarının çözülmesini amaçlayan genom ölçekli nakavt ekranları için oldukça cazip bir araç yaptı. 2 , 3 . Bununla birlikte, gereksiz işlevlere sahip birden çok paralog varsa, tek genli nakavt yaklaşımları sınırlı bir şekilde kullanılmaktadır. Bu nedenle, tek bir gen ablasyon çok az veya hiç fenotipik değişiklik 4'te elde edilen paralogues mümkün dengeleme verilen gen fonksiyonunu belirlemek için yeterli olmayabilir. Bu nedenle, genetik kompozisyonun etkisinin üstesinden gelmek için farklı paralog genleri hedef alan birden çok gRNA vektörü göndererek paralogları paralel olarak ele geçirmek önemlidir.
CRISPR / Cas9'un paralog gen nakavtına kullanımını genişletmek için, son zamanlarda, dört önceden-tavlanmış gRNA'yı tek bir retroviral vektör 5'e klonlamak için hızlı, tek aşamalı bir klonlama yöntemi geliştirdik. CRISPR-konkantör adı verilen omurgaTekrarlayan gRNA ekspresyon kasetleri içeren bir MSCV retroviral plasmid üzerinde. Her bir kaset, tek bir tüpe 6'da bir Golden Gate karıştırma reaksiyonu kullanılarak çıkıntılar eşleşen eşzamanlı olarak tavlanmış bir gRNA oligo ile değiştirilebilen Type IIS kısıtlama enzimi Bbs I'in iki ters çevrilmiş tanıma bölgesi içerir. Bu klonlama yöntemi, Bbs I tarafından üretilen farklı çıkıntı diziliminden istifade ederek, birden fazla DNA fragmanının eşzamanlı olarak bir araya getirilmesine olanak sağlayan, sindirim ve ligasyonun tekrar eden döngülerinden oluşur. Bu enzimin eşsizliği, örneğin, tanımanın dışında asimetrik kesikler yapma kabiliyetidir sıra; Bu nedenle, her kaset, Bbs I çekirdeği alanını çevreleyen özel çıkıntılar ile farklı bir diziye sahip olabilir ve bu şekilde, her bir gRNA, konsatemer vektörünün belirli bir konumunda ve yönünde klonlanabilir.
Prensip belgesi olarak, bu stratejininFare elektroporasyon 5 bir tur ile eş zamanlı olarak, Wnt yolunun paralog negatif regülatörleri iki çift bozarak bağırsak organoids.
Son birkaç yılda pek çok başka grup, insan hücre çizgileri 8 , 9 , zebra balığı 10 ve Escherichia coli gibi çeşitli model sistemlerinde çoklu gen nakavtını başarmak için Golden Gate karıştırma 7 kullanılarak oluşturulan çoklu gRNA ekspresyon vektörlerine dayanan benzer stratejiler geliştirdi. 11 . Protokollerinde, gRNA'lar önce bireysel ara vektörlere klonlanır ve daha sonra bir araya getirilerek nihai bir ürün haline getirilir. Buna karşılık, CRISPR-concatemer stratejimizin en önemli avantajı, tek bir Bbs I karıştırma, klonlama basamağının kolaylığıdır. Diğer gRNA konkantemleri gibi, yöntemimiz de dört'e kadar eşzamanlı nakavt yapılmasını mümkün kılarFarklı genler veya birden fazla gRNA ile bir veya iki genin hedeflenmesini takiben artmış CRISPR nakavt etkinliği ( Şekil 1 ).
Bu protokolde, gRNA tasarımından Golden Gate reaksiyonuna kadar başarılı bir klonlamanın onaylanması için, CRISPR-konkantem vektörlerinin oluşumundaki her adımı ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ayrıca, elektroporasyon ve daha sonra büyüme faktörü geri çekme deneyleriyle, fare küçük bağırsak organoitlerine CRISPR-konkantemlerin transfeksiyonu için son derece verimli bir protokol sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, CRISPR-concatemers üretmek için gerekli tüm adımları ve fare bağırsak organoitlerinde aynı anda birden fazla geni çürütmek için CRISPR-konkanteemleri uygulayacağız. Daha önce de belirtildiği gibi, bu strateji, hızı, yüksek verimliliği ve maliyet etkinliği gibi birçok avantaja sahiptir.
Bütün prosedürü başarıyla yerine getirmek için, dikkate alınması gereken birkaç kritik husus vardır. Öncelikle, tüm gRNA oligolarının düzgün bir şekilde tavlanması ve fosforile edilmesi esastır; çünkü bunlar kendi başına çok etkili olan Bbs I klonlama reaksiyonunun başlangıç materyalini temsil eder. İkincisi, organoidleri elektroporasyona tabi tuttuğunda, durum başına daha fazla hücre kullanılırsa, mümkün olan en fazla transfeksiyon etkinliği o kadar yüksek olur. Ek olarak, hücre ayrışmasının ardından küçük hücrelerin kümelenmeleri tek hücrelere üstün olduğu da önemlidir.
Bununla birlikte, teknik prob ile karşılaşmak mümkündür.Klonlama veya transfeksiyon ilk kez denendiğinde lems; GRNA klonlaması sırasında sorunlar olması durumunda, gRNA oligo dizisini iki kez kontrol etmeniz ve doğruysa, kısıtlama sindirim taraması için ilave bakteri kolonileri seçmeniz önerilir. Transfeksiyon etkinliği ve hücre yaşayabilirliği elektroporasyondan düşükse, durum başına daha fazla hücre kullanarak protokolü tekrar etmeniz ve hücre ayrılma süresini 3 dakikaya düşürmeniz önerilir.
CRISPR-konkantemlerin üretimi nispeten ucuz ve kolay olmasına rağmen, organoidlerde daha büyük çaplı genetik ekranlar yapmak, ölçek organik kültür ile ilişkili maliyetlerle ve emek yoğun doğasıyla sınırlı olmadığı için değil. Bu durumda, CRISPR-konkantem yönteminin HEK293 ve fare embriyonik kök hücreleri gibi hücre hatlarıyla da uyumlu olduğunu belirtmek gerekir.
Hücresel sistem ne olursa olsun, bu durumun bir başka potansiyel dezavantajıÜç ya da dört farklı genin aynı anda nakavt edilmesini amaçlarken yönelime rastlanabilir. Örneğin, her bir gRNA'nın farklı bir hedefleme etkinliği olacaktır ve aynı anda tüm genlere çarpma değişiklikleri nispeten düşük olabilir; Bu nedenle, aynı gene karşı birden fazla gRNA yönlendirmek için konsatemer sistemi kullanmanız önerilir.
Benzer şekilde Golden Gate karıştırmaya dayanan alternatif stratejiler, çok katlı gRNA vektörlerini 7 , 8 üretmek için yıllar içinde önerildi. Bununla birlikte, yöntemimizde paralogları hedeflemek için gRNA kütüphaneleri üretmek için uygun hale getiren, tek bir retroviral vektöre doğrudan klonlamanın tek bir turunda birden fazla gRNA'yı bir araya getirmek mümkündür.
CRISPR-konsatremeri MSCV retroviral vektör omurgasında inşa edilmiştir. Böylece, gRNA konkanteri ihtiva eden retrovirüs, aşırı ifade eden kararlı hücre çizgileri üretmek için kullanılabilirRess gRNA'ları. Bir Cas9-uyarılabilir sistemle kombine edildiğinde, sistemimiz kullanılarak uyarılabilir paralog knockouts gerçekleştirebilir.
Özetle, burada bir adımda aynı vektöre dört farklı gRNA'nın nasıl klonlanacağını ve bu stratejinin yüksek bir transfeksiyon etkinliği ile organoid kültürüne nasıl uygulandığını açıklıyoruz. Ayrıca, tüm prosedür boyunca başarı şansını en üst düzeye çıkarmak için yararlı öneriler sunuyoruz.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Makalenin eleştirel okunması için Christopher Hindley'e teşekkür ediyoruz. AM, Wntsapp (Marie Curie ITN), AA-R tarafından desteklenmektedir. Tıp Araştırma Konseyi (MRC) ve BK.K tarafından desteklenmektedir. Ve RM, Wellcome Trust ve Royal Society [101241 / Z / 13 / Z] 'den bir Sir Henry Dale Bursu tarafından desteklenmekte ve Wellcome Trust ve MRC'den Wellcome Trust – MRC Cambridge Stem Cell Enstitüsüne bir temel hibe yoluyla destek alınmaktadır .
Materials
| Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
| Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
| T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
| T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
| DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
| ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
| FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
| Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
| BglII | New England Biolabs | R0144 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
| Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
| Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
| 10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
| Plasmid mini kit | Qiagen | 12125 | |
| Table top microcentrifuge | Eppendorf | UY-02580-01 | |
| Inoculating loops | Microspec | PLS5 | |
| Bacteria incubator | Sanyo | MIR-262 | |
| Luria-Bertani broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3522 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Agarose gel electrophoresis apparatus | Bioneer | A-7020 | |
| Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
| Glutamax (L-Glutamine) 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
| HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
| B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Mouse EGF 500 µg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
| Mouse Noggin 100 µg/mL | Peprotech | 250-38 | |
| Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
| R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
| Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
| Y-27632 10 µM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| 48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
| IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
| TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
| Opti-MEM (reduced serum medium ) | Life technologies | 51985-034 | |
| Electroporation Cuvettes 2mm gap | NepaGene | EC-002S | |
| Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
| NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
| Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
| BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |
References
- Mali, P., et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. -. P., Velasco-Herrera, M. D. C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nat Biotech. 32 (3), 267-273 (2014).
- Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A Genome-Wide CRISPR Library for High-Throughput Genetic Screening in Drosophila Cells. J Genet Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
- Diss, G., Ascencio, D., DeLuna, A., Landry, C. R. Molecular mechanisms of paralogous compensation and the robustness of cellular networks. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 322 (7), 488-499 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Merenda, A., Mustata, R. C., Li, T., Dietmann, S., Koo, B. -. K. Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids. Dev Biol. 420 (2), 1-7 (2016).
- Ran, F. A., Hsu, P. P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS ONE. 4 (5), (2009).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 4 (5), 5400 (2014).
- Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), 1-11 (2014).
- Yin, L., et al. Multiplex Conditional Mutagenesis Using Transgenic Expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
- Cress, B. F., Toparlak, O. D., et al. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synth Biol. 4 (9), 987-1000 (2015).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zimmermann, J., Voss, H., Schwager, C., Stegemann, J., Ansorge, W. Automated Sanger dideoxy sequencing reaction protocol. FEBS Letters. 233 (2), 432-436 (1988).
- Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nat. Protoc. 10 (10), 1474-1485 (2015).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
